A divisão celular bacteriana é orquestrada por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica que possui a capacidade de polimerizar e gerar uma estrutura chamada de anel Z. O local onde esta estrutura citoesquelética contrátil é formada determina o futuro sítio de divisão. O complexo MinCD é um dos principais reguladores da posição da divisão, favorecendo a montagem do anel Z precisamente na região medial da bactéria. MinCD age como um inibidor sítio específico da polimerização de FtsZ, atuando preferencialmente nos polos celulares. MinC é a proteína do complexo que atua diretamente sobre FtsZ e inibe sua polimerização. Essa tese elucida a interação entre FtsZ e MinC e sugere o mecanismo exercido por MinC em Bacillus subtilis. Foi triada uma biblioteca de mutantes randômicos de FtsZ para identificação de mutantes resistentes à ação de MinC. Dentre estes, as substituições K243R e D287V, quando caracterizados usando espalhamento de luz e espectroscopia de fluorescência impediram a interação com MinC. Como as mutações estavam localizados em torno das hélices H-9 e H-10 no domínio C-terminal de FtsZ, concluímos que esta região representa o sítio de interação com MinC desta proteína. Como complemento ao mapeamento do sitio de ligação de MinC em FtsZ, identificamos a região de MinC que interage com FtsZ. Para tanto, escolhemos resíduos de MinC para mutagênese e caracterização. A escolha priorizou os resíduos conservados entre espécies Gram-positivas, experimentos de RMN, carga e exposição ao solvente dos mesmos. Dentre os resíduos de MinC mutados que afetaram sua capacidade de inibir a polimerização de FtsZ in vitro foram: Y8 e K12 (β-1), K15 (alça-2), H55 (β-3) , H84 (β-4) e K149 (C-terminal). Sendo assim, podemos concluir que a face de interação para FtsZ em MinC de B. subtilis é a única folha β do domínio N-terminal desta proteína. Com base nos sítios mapeados das duas proteínas experimentalmente, criamos um modelo in silico do complexo MinC-FtsZ por docking molecular. De acordo com o modelo gerado, MinC interage com a porção lateral de polímeros de FtsZ. Isto sugere que MinC atue na inibição da formação de feixes de filamentos de FtsZ, impedindo assim a formação de anéis Z funcionais. Esse mecanismo de ação do sistema Min é diferente do proposto para E. coli, no qual MinC interage com a face de polimerização FtsZ-FtsZ e impede a formação de protofilamentos de FtsZ. / Bacterial cell division is orchestrated by FtsZ, a protein homologous to eukaryotic tubulin that has the ability to polymerize and generate a cytoplasmic structure called the Z ring. The subcellular location where this cytoskeletal structure is formed determines the future division site. The MinCD complex is one of the main regulators of the position of cell division, driving the assembly of Z-ring precisely at the medial region of the cell. MinCD acts as a site-specific inhibitor of FtsZ polymerization, blocking Z ring formation at the cell poles. MinC is the protein of the complex that acts directly on FtsZ and inhibits its polymerization. This thesis elucidates the interaction between FtsZ and MinC and suggests the MinC mechanism in Bacillus subtilis. An ftsZ randomly mutagenized library was screened to identify mutants that are resistant to MinC action. Using right-angle light scattering and fluorescence spectroscopy we showed that substitutions K243R and D287V lost the interaction to MinC. These substituted residues clustered around the H-9 and H-10 helices in the C-terminal domain of FtsZ, thus, we conclude that this region is the binding site for MinC. In addition to mapping the MinC binding site on FtsZ, we also identified the FtsZ binding site in MinC. Based on residue conservation, NMR experiments and exposure to solvent, we chose residues of MinC for mutagenesis and characterization. The substituted residues that di srupted MinC ability to inhibit FtsZ polymerization in vitro were: Y8 and K12 (β-1), K15 (turn-2) , H55 (β-3), H84 (β-4) and K149 (C-terminal). Thus, we conclude that the binding site of MinC for FtsZ is located on the β only sheet at the N-terminal domain of MinC from B. subtilis. Finally, based on the binding sites of the two proteins mapped experimentally, we created a model of the complex between MinC and FtsZ by molecular docking. According to the generated model, MinC interacts with the lateral portion of FtsZ polymers. This indicates that MinC should inhibit assembly of higher order FtsZ polymers, thereby preventing the formation of a functional Z-ring. This mechanism of Min is different from that proposed in E. coli, in which MinC interacts with FtsZ polymerization interface and inhibits FtsZ protofilament formation.

A divisão celular bacteriana é orquestrada por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica que possui a capacidade de polimerizar e gerar uma estrutura chamada de anel Z. O local onde esta estrutura citoesquelética contrátil é formada determina o futuro sítio de divisão. O complexo MinCD é um dos principais reguladores da posição da divisão, favorecendo a montagem do anel Z precisamente na região medial da bactéria. MinCD age como um inibidor sítio específico da polimerização de FtsZ, atuando preferencialmente nos polos celulares. MinC é a proteína do complexo que atua diretamente sobre FtsZ e inibe sua polimerização. Essa tese elucida a interação entre FtsZ e MinC e sugere o mecanismo exercido por MinC em Bacillus subtilis. Foi triada uma biblioteca de mutantes randômicos de FtsZ para identificação de mutantes resistentes à ação de MinC. Dentre estes, as substituições K243R e D287V, quando caracterizados usando espalhamento de luz e espectroscopia de fluorescência impediram a interação com MinC. Como as mutações estavam localizados em torno das hélices H-9 e H-10 no domínio C-terminal de FtsZ, concluímos que esta região representa o sítio de interação com MinC desta proteína. Como complemento ao mapeamento do sitio de ligação de MinC em FtsZ, identificamos a região de MinC que interage com FtsZ. Para tanto, escolhemos resíduos de MinC para mutagênese e caracterização. A escolha priorizou os resíduos conservados entre espécies Gram-positivas, experimentos de RMN, carga e exposição ao solvente dos mesmos. Dentre os resíduos de MinC mutados que afetaram sua capacidade de inibir a polimerização de FtsZ in vitro foram: Y8 e K12 (β-1), K15 (alça-2), H55 (β-3) , H84 (β-4) e K149 (C-terminal). Sendo assim, podemos concluir que a face de interação para FtsZ em MinC de B. subtilis é a única folha β do domínio N-terminal desta proteína. Com base nos sítios mapeados das duas proteínas experimentalmente, criamos um modelo in silico do complexo MinC-FtsZ por docking molecular. De acordo com o modelo gerado, MinC interage com a porção lateral de polímeros de FtsZ. Isto sugere que MinC atue na inibição da formação de feixes de filamentos de FtsZ, impedindo assim a formação de anéis Z funcionais. Esse mecanismo de ação do sistema Min é diferente do proposto para E. coli, no qual MinC interage com a face de polimerização FtsZ-FtsZ e impede a formação de protofilamentos de FtsZ. / Bacterial cell division is orchestrated by FtsZ, a protein homologous to eukaryotic tubulin that has the ability to polymerize and generate a cytoplasmic structure called the Z ring. The subcellular location where this cytoskeletal structure is formed determines the future division site. The MinCD complex is one of the main regulators of the position of cell division, driving the assembly of Z-ring precisely at the medial region of the cell. MinCD acts as a site-specific inhibitor of FtsZ polymerization, blocking Z ring formation at the cell poles. MinC is the protein of the complex that acts directly on FtsZ and inhibits its polymerization. This thesis elucidates the interaction between FtsZ and MinC and suggests the MinC mechanism in Bacillus subtilis. An ftsZ randomly mutagenized library was screened to identify mutants that are resistant to MinC action. Using right-angle light scattering and fluorescence spectroscopy we showed that substitutions K243R and D287V lost the interaction to MinC. These substituted residues clustered around the H-9 and H-10 helices in the C-terminal domain of FtsZ, thus, we conclude that this region is the binding site for MinC. In addition to mapping the MinC binding site on FtsZ, we also identified the FtsZ binding site in MinC. Based on residue conservation, NMR experiments and exposure to solvent, we chose residues of MinC for mutagenesis and characterization. The substituted residues that di srupted MinC ability to inhibit FtsZ polymerization in vitro were: Y8 and K12 (β-1), K15 (turn-2) , H55 (β-3), H84 (β-4) and K149 (C-terminal). Thus, we conclude that the binding site of MinC for FtsZ is located on the β only sheet at the N-terminal domain of MinC from B. subtilis. Finally, based on the binding sites of the two proteins mapped experimentally, we created a model of the complex between MinC and FtsZ by molecular docking. According to the generated model, MinC interacts with the lateral portion of FtsZ polymers. This indicates that MinC should inhibit assembly of higher order FtsZ polymers, thereby preventing the formation of a functional Z-ring. This mechanism of Min is different from that proposed in E. coli, in which MinC interacts with FtsZ polymerization interface and inhibits FtsZ protofilament formation.

A citocinese bacteriana é controlada por diversas proteínas que se agrupam em um complexo chamado divisomo. O cerne do divisomo é constituído por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica, que se auto-associa formando uma estrutura chamada anel Z. O anel Z serve como arcabouço e recruta diversas outras proteínas componentes do divisomo para o sítio onde o septo será sintetizado na célula. A formação do anel Z é modulada por proteínas que se ligam diretamente a FtsZ e regulam a sua auto-associação, tanto induzindo como inibindo a sua polimerização. Apesar de muitos destes moduladores de FtsZ já serem conhecidos, muito pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual eles controlam a estruturação do anel Z in vivo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre FtsZ e um modulador de divisão, a proteína ZapA, da bactéria gram-positiva Bacillus subtilis. Para isso construímos uma biblioteca de mutantes de ftsZ por \"Error Prone PCR\", com aproximadamente 1 substituição por cópia de ftsZ e contendo um total de 1x105 clones. A partir dessa biblioteca, utilizamos duas triagens genéticas para identificar mutantes incapazes de interagir com ZapA. Na primeira estratégia, selecionamos 12 mutantes de FtsZ resistentes à superexpressão de uma forma tóxica de ZapA, que bloqueia a divisão, causando filamentação e morte das células. Surpreendentemente, apesar destes mutantes serem insensíveis ao efeito de ZapA, ensaios citológicos mostraram que nenhum deles perdeu a interação com ZapA. Como as mutações foram mapeadas nas vizinhanças do sítio catalítico e de polimerização de FtsZ, e como a maioria delas confere resistência cruzada aos efeitos de outros moduladores de FtsZ, suspeitamos que elas afetassem a estabilidade do polímero de FtsZ e, consequentemente, o comportamento do anel Z. Essas suspeitas foram confirmadas em ensaios de FRAP e cálculos de proporção de FtsZ no anel Z, indicando que os mutantes formam um anel Z mais estável que o normal. Como não obtivemos mutantes que perderam a interação com ZapA na primeira triagem, aplicamos a biblioteca em uma segunda estratégia de triagem genética, procurando um mutante de FtsZ que voltasse a interagir com um mutante de ZapA que não se liga mais a FtsZ (ZapAN62A). Esta estratégia de ganho de função identificou um candidato, FtsZE91V , que, tanto por critérios genéticos como citológicos, voltou a interagir com ZapAN62A. Apesar do mutante FtsZE91V mostrar-se capaz de restaurar a interação com ZapAN62A, ele não afetou a interação com ZapA selvagem, segundo nossos ensaios de microscopia de fluorescência e viabilidade. O mutante FtsZE91V, mapeia na hélice H3 de FtsZ. Esta hélice está exposta na superfície de FtsZ (compõe um dos lados da molécula de FtsZ) de uma maneira compatível com a idéia de que ela seria importante para interações laterais entre polímeros de FtsZ. Nossos resultados apontam, portanto, que a hélice H3 deve ser o sítio de interação para ZapA em FtsZ. / The bacterial cytokinesis is ruled by a number of proteins that constitute the divisome complex. FtsZ, a homologue of eukaryotic tubulin, is the main component of the divisome and self-associates in a structure named Z ring. The Z ring works as a scaffold and recruits the other components of divisome, establishing itself where the septum will be synthesized in the cell. Some of these proteins interact directly with FtsZ and control self-association, promoting polymerization or preventing it. Although there have been discovered many of FtsZ modulators, little is known about the mechanisms that control the formation of the Z ring in vivo. The aim of this work was study de interaction between FtsZ e one of its division modulators, ZapA protein, on Bacillus subtilis grampositive bacteria. We created a mutagenized ftsZ plasmid library by error prone PCR, which contained 1,0x105 transformants and exhibited a mutation rate of one substitution per ftsZ copy. The library was transformed into a modified Bacillus subtilis strain and we performed two genetic screenings to select cells with FtsZ mutants incapable of interacting with ZapA. In first strategy, we selected 12 resistant ftsZ mutants for a toxic ZapA overexpression, that blocked division and caused filamentation and cell death. Surprisingly, although these mutants were insensitive to ZapA effect, cytological assays showed that none of them lost interaction with ZapA. As the substitutions were mapped around the catalytic and interaction site of FtsZ structure and showed resistance to other modulators, we suspected that the mutations were affecting the polymer stability of FtsZ and, consequently, the behavior of Z ring. This hypothesis was confirmed by FRAP experiments and by calculations of FtsZ proportions in Z ring, pointing out that the mutants form more stable Z rings. As we didnt\' find mutants that lost their ZapA´s interaction, we applied our library in a second genetic screen, looking for mutants that return to interact with a ZapA mutant (ZapAN62A) that doesn´t bind to FtsZ anymore. This gain of function strategy identified one candidate, FtsZE91V, which returns to interact with ZapAN62A in our genetic and cytological assays. Although the mutant FtsZE91V showed itself capable to interact with ZapAN62A, that didn´t affect the interaction with wild type ZapA by our fluorescent microscopy and viability assays. The substitution E91V was mapped on H3 helix of FtsZ structure. This helix is exposed on FtsZ surfaces (on FtsZ´s lateral side), being compatible with the idea that lateral interaction is important in FtsZ polymers. So, we concluded that helix H3 is the binding site of ZapA in FtsZ.

A citocinese bacteriana é controlada por diversas proteínas que se agrupam em um complexo chamado divisomo. O cerne do divisomo é constituído por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica, que se auto-associa formando uma estrutura chamada anel Z. O anel Z serve como arcabouço e recruta diversas outras proteínas componentes do divisomo para o sítio onde o septo será sintetizado na célula. A formação do anel Z é modulada por proteínas que se ligam diretamente a FtsZ e regulam a sua auto-associação, tanto induzindo como inibindo a sua polimerização. Apesar de muitos destes moduladores de FtsZ já serem conhecidos, muito pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual eles controlam a estruturação do anel Z in vivo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre FtsZ e um modulador de divisão, a proteína ZapA, da bactéria gram-positiva Bacillus subtilis. Para isso construímos uma biblioteca de mutantes de ftsZ por \"Error Prone PCR\", com aproximadamente 1 substituição por cópia de ftsZ e contendo um total de 1x105 clones. A partir dessa biblioteca, utilizamos duas triagens genéticas para identificar mutantes incapazes de interagir com ZapA. Na primeira estratégia, selecionamos 12 mutantes de FtsZ resistentes à superexpressão de uma forma tóxica de ZapA, que bloqueia a divisão, causando filamentação e morte das células. Surpreendentemente, apesar destes mutantes serem insensíveis ao efeito de ZapA, ensaios citológicos mostraram que nenhum deles perdeu a interação com ZapA. Como as mutações foram mapeadas nas vizinhanças do sítio catalítico e de polimerização de FtsZ, e como a maioria delas confere resistência cruzada aos efeitos de outros moduladores de FtsZ, suspeitamos que elas afetassem a estabilidade do polímero de FtsZ e, consequentemente, o comportamento do anel Z. Essas suspeitas foram confirmadas em ensaios de FRAP e cálculos de proporção de FtsZ no anel Z, indicando que os mutantes formam um anel Z mais estável que o normal. Como não obtivemos mutantes que perderam a interação com ZapA na primeira triagem, aplicamos a biblioteca em uma segunda estratégia de triagem genética, procurando um mutante de FtsZ que voltasse a interagir com um mutante de ZapA que não se liga mais a FtsZ (ZapAN62A). Esta estratégia de ganho de função identificou um candidato, FtsZE91V , que, tanto por critérios genéticos como citológicos, voltou a interagir com ZapAN62A. Apesar do mutante FtsZE91V mostrar-se capaz de restaurar a interação com ZapAN62A, ele não afetou a interação com ZapA selvagem, segundo nossos ensaios de microscopia de fluorescência e viabilidade. O mutante FtsZE91V, mapeia na hélice H3 de FtsZ. Esta hélice está exposta na superfície de FtsZ (compõe um dos lados da molécula de FtsZ) de uma maneira compatível com a idéia de que ela seria importante para interações laterais entre polímeros de FtsZ. Nossos resultados apontam, portanto, que a hélice H3 deve ser o sítio de interação para ZapA em FtsZ. / The bacterial cytokinesis is ruled by a number of proteins that constitute the divisome complex. FtsZ, a homologue of eukaryotic tubulin, is the main component of the divisome and self-associates in a structure named Z ring. The Z ring works as a scaffold and recruits the other components of divisome, establishing itself where the septum will be synthesized in the cell. Some of these proteins interact directly with FtsZ and control self-association, promoting polymerization or preventing it. Although there have been discovered many of FtsZ modulators, little is known about the mechanisms that control the formation of the Z ring in vivo. The aim of this work was study de interaction between FtsZ e one of its division modulators, ZapA protein, on Bacillus subtilis grampositive bacteria. We created a mutagenized ftsZ plasmid library by error prone PCR, which contained 1,0x105 transformants and exhibited a mutation rate of one substitution per ftsZ copy. The library was transformed into a modified Bacillus subtilis strain and we performed two genetic screenings to select cells with FtsZ mutants incapable of interacting with ZapA. In first strategy, we selected 12 resistant ftsZ mutants for a toxic ZapA overexpression, that blocked division and caused filamentation and cell death. Surprisingly, although these mutants were insensitive to ZapA effect, cytological assays showed that none of them lost interaction with ZapA. As the substitutions were mapped around the catalytic and interaction site of FtsZ structure and showed resistance to other modulators, we suspected that the mutations were affecting the polymer stability of FtsZ and, consequently, the behavior of Z ring. This hypothesis was confirmed by FRAP experiments and by calculations of FtsZ proportions in Z ring, pointing out that the mutants form more stable Z rings. As we didnt\' find mutants that lost their ZapA´s interaction, we applied our library in a second genetic screen, looking for mutants that return to interact with a ZapA mutant (ZapAN62A) that doesn´t bind to FtsZ anymore. This gain of function strategy identified one candidate, FtsZE91V, which returns to interact with ZapAN62A in our genetic and cytological assays. Although the mutant FtsZE91V showed itself capable to interact with ZapAN62A, that didn´t affect the interaction with wild type ZapA by our fluorescent microscopy and viability assays. The substitution E91V was mapped on H3 helix of FtsZ structure. This helix is exposed on FtsZ surfaces (on FtsZ´s lateral side), being compatible with the idea that lateral interaction is important in FtsZ polymers. So, we concluded that helix H3 is the binding site of ZapA in FtsZ.