Die Untersuchung der antimikrobiellen Fähigkeiten von Bodenisolaten ist von großer Bedeutung, um neue antibiotische Substanzen zu entdecken. Im Rahmen eines mikrobiologischen Praktikums wurden von Studierenden Bodenproben gesammelt und daraus 32 Streptomyces-Isolate gewonnen. Diese Isolate wurden auf ihre antimikrobiellen Leistungen untersucht und taxonomisch eingeordnet. Mittels Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST) wurden die 32 Bodenisolate der Gattung Streptomyces zugeordnet. Es gelang, alle Isolate erfolgreich dieser Gattung zuzuordnen. Allerdings konnte nicht für jedes Isolat eine eindeutige Spezieszugehörigkeit durch MLST festgestellt werden. Der Fokus lag insbesondere auf der detaillierten Analyse und Charakterisierung der Bodenisolate #4I1 und #12I2. Mittels Baumrekonstruktionen, basierend auf 16S-rRNA, MLST- und Gesamtgenomanalysen, wurden diese Stämme der Spezies Streptomyces silvae For3T zugeordnet. Das Genom des endophytischen Streptomyces sp. M3, welches aus der NCBI-Datenbank entnommen wurde, konnte ebenfalls dieser Spezies zugeordnet werden. Weiterhin wurde eine vergleichende Genomanalyse durchgeführt, um die genetische Struktur und die metabolischen Eigenschaften der S. silvae-Stämme zu erforschen. Diese umfassenden genetischen Untersuchungen trugen erheblich zum Verständnis der innerartlichen Variabilität und der adaptiven Merkmale der untersuchten Streptomyces-Stämme bei. Die physiologischen Profile der S. silvae-Stämme wurden mittels verschiedener Tests auf ihre antimikrobiellen Eigenschaften und ihre Anpassungsfähigkeit an verschiedene Umweltbedingungen untersucht. Besondere Aufmerksamkeit wurde dem Stamm S. silvae #4I1 gewidmet. Dieser wurde ausführlichen physiologischen Tests unterzogen, um eine präzise taxonomische Beschreibung als Repräsentant seiner Spezies zu ermöglichen. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass die S. silvae-Stämme ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivitäten aufweisen. Die Ergebnisse der vergleichenden Genomanalyse verdeutlichten eine enge evolutionäre Verwandtschaft zwischen den S. silvae-Stämmen und offenbarten das Potenzial dieser Stämme zur Produktion von Sekundärmetaboliten, die zur Bekämpfung von pathogenen Mikroorganismen beitragen könnten.:Inhaltsverzeichnis___________________________________________________ I Abkürzungsverzeichnis______________________________________________ VI Zusammenfassung________________________________________________ VIII Summary_________________________________________________________ X Einleitung________________________________________________________ 1 Antibiotika________________________________________________________ 1 Innovative Lösungen zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen_____________ 3 Identifizierung von Antibiotikaklassen mittels Ganzzell-Biosensoren____________ 4 Gattung Streptomyces______________________________________________ 6 1.4.1 Merkmale und Lebensweise von Streptomyces spp.___________________ 8 1.4.2 Genomstruktur von Streptomyces: Charakteristika und Besonderheiten___ 13 1.4.3 Genomische Organisation der Gene für Sekundärmetaboliten in Streptomyces spp. ____ 15 Zielstellung______________________________________________________ 17 2 Material und Methoden___________________________________________ 18 Verwendete Laborgeräte____________________________________________ 18 Materialien______________________________________________________ 19 2.2.1 Verbrauchsmaterialien_________________________________________ 19 2.2.2 Chemikalien_________________________________________________ 19 2.2.3 Medien_____________________________________________________ 21 2.2.4 Verwendete Bakterienstämme und Oligonukleotide___________________ 29 Physiogische Methoden____________________________________________ 31 2.3.1 Isolierung und Herstellung der Sporensuspensionen von Streptomyces spp. aus Bodenproben 31 2.3.2 Kultivierung der Streptomyces-Stämme____________________________ 32 2.3.3 Kultivierung der Biosensoren und Testorganismen___________________ 33 Methodische Herangehensweisen zur Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Streptomyces spp. 34 2.4.1 Evaluierung des Hemmpotenzials von Streptomyces-Stämmen gegenüber ausgewählten Testorganismen 34 2.4.2 Biosensor-basierte Identifikation antibiotischer Substanzklassen_________ 36 Vergleichende Morphologie der S. silvae-Stämme 37 Physiologische Charakterisierung von S. silvae #4I1______________________ 37 2.6.1 Morphologie und Bildung melanoider Pigmente______________________ 37 2.6.2 Bestimmung der Nutzung verschiedener Kohlenstoffquellen sowie der Natriumchloridtoleranz und Lysozymresistenz_ 37 2.6.3 Evaluierung der pH-Präferenzen_________________________________ 38 2.6.4 Bestimmung der Hämolyseaktivität________________________________ 39 2.6.5 Bestimmung des Temperaturoptimums_____________________________ 39 2.6.6 Analyse der Mikromorphologie mittels Elektronenmikroskopie___________ 39 Molekularbiologische und genetische Methoden__ 40 2.7.1 Isolation genomischer DNA aus Bodenisolaten______________________ 40 2.7.2 Messung der Konzentration genomischer DNA______________________ 40 2.7.3 Gesamt-Genom-Sequenzierung__________________________________ 40 2.7.4 MLST (Multi-Locus-Sequenz-Typisierung)__________________________ 41 2.7.4.1 PCR (Polymerasekettenreaktion)_______________________________ 41 2.7.4.2 Gelektrophorese____________________________________________ 43 2.7.4.3 Extraktion und Aufreinigung der PCR-Produkte____________________ 43 2.7.4.4 Sequenzierung der PCR-Produkte______________________________ 43 Bioinformatische Methoden__________________________________________ 44 2.8.1 Anwendung der MLST-Methode bei den Bodenisolaten________________ 44 2.8.2 Bioinformatische Methoden zur vergleichenden Genomik der vier S. silvae-Stämme ___ 45 2.8.3 Bioinformatische Strategien zum Genomassembling__________________ 46 2.8.3.1 Optimierung der Sequenzdaten aus der Gesamtgenomsequenzierung__ 47 2.8.3.2 de-novo-Genomassembling___________________________________ 48 2.8.3.3 Mapping__________________________________________________ 48 2.8.3.4 Extraktion der Genomsequenz_________________________________ 50 2.8.3.5 Auswahl der Referenzsequenzen für die Contig-Verschmelzung (Scaffolding) _ 50 2.8.3.6 Genomrekonstruktion durch Scaffolding__________________________ 51 2.8.4 Bioinformatische Ansätze zur Ermittlung genomischer Kennziffern________ 52 2.8.4.1 Berechnung des ANI-Wertes___________________________________ 53 2.8.4.2 Berechnung des genomischen GC (Guanin-Cytosin)- und AT (Adenin-Thymin)-Gehaltes 53 2.8.4.3 Berechnung des GC-Versatzes_________________________________ 54 2.8.5 16S-rRNA-Analyse____________________________________________ 55 2.8.5.1 16S-rRNA-Sequenzextraktion__________________________________ 55 2.8.5.2 16S-rRNA-Prozessierung und Alignment__________________________ 56 2.8.5.3 Generierung des 16S-rRNA-Baums_____________________________ 57 2.8.6 AutoMLST_______________________________________________________ 59 2.8.7 Gesamtgenom-basierte Konstruktion eines phylogenetischen Baumes____ 60 2.8.8 Genomische Charakterisierung und Identifizierung relevanter Gencluster in den Genomen von S.silvae__ 61 2.8.8.1 Genannotation___________________________________________________ 61 2.8.8.2 Identifikation von BGCs_______________________________________ 62 2.8.8.3 Identifikation von Antibiotikaresistenzgenen_______________________ 63 2.8.9 Visualisierung____________________________________________________ 63 2.8.9.1 Erstellung zirkulärer Genomkarten______________________________ 64 2.8.9.2 MAUVE-Alignement__________________________________________ 64 3 Ergebnisse_____________________________________________________ 66 Systematische Taxonomie von Streptomyces-Bodenisolaten mittels MLST__ 66 Vielfalt und Spezifität von Streptomyces-Isolaten: Inhibitorische Kapazitäten und biosensorische Charakterisierungen_ 69 3.2.1 Bestimmung der inhibitorischen Kapazität von Streptomyces-Isolaten gegenüber ausgewählten Testorganismen__70 3.2.2 Systematische Evaluierung der biosensorischen Profile von 36 Streptomyces-Stämmen _ 73 Komparative Genomanalyse von S. silvae______ 78 3.3.1 Optimierung der Genomassemblierung der Streptomyces-Isolate #12I2 und #4I1 ______ 79 3.3.2 Phylogenetische Einordnung von S. silvae-Stämmen mittels 16S-rRNA-Analyse und MLST 81 3.3.3 GBDP-gestützte Analyse zur Aufklärung der Phylogenie von S. silvae-Stämmen_______ 82 3.3.4 Komparative Genomkartografie zur Visualisierung der genetischen Diversität in der S. silvae-Klade_ 84 3.3.5 Identifikation homologer Genombereiche___________________________ 88 3.3.6 Vergleichende Analyse der BGCs für Sekundärmetabolite in den vier S. silvae-Genomen 91 3.3.7 Komparative Analyse der Antibiotikaresistenz-assoziierten Gentypen in den S. silvae-Stämmen__ 95 Vergleichende physiologische Untersuchungen von S. silvae-Stämmen________ 99 3.4.1 Differenzierte Analyse antimikrobieller Aktivitäten von S. silvae-Stämmen in Abhängigkeit vom Nährmedium__ 99 3.4.2 Klassifikation der antimikrobiellen Sekundärmetaboliten von S. silvae-Stämmen unter Einsatz lumineszierender Biosensoren_101 3.4.3 Vergleichende Analyse der Makromorphologie von S. silvae-Stämmen auf diversen Nährmedien_ 103 Physiologische Charakterisierung von S. silvae #4I1_____________________ 106 3.5.1 REM-basierte Untersuchung der Mikromorphologie von S. silvae #4I1___ 107 3.5.2 Morphologische Analyse und Melanoidpigmentsynthese von S. silvae #4I1 auf ISP-Medien__ 108 3.5.3 Analyse des Verwertungsspektrums von Kohlenstoffquellen durch S. silvae #4I1 _____ 110 3.5.4 Bestimmung der Salztoleranz von S. silvae #4I1_____________________ 112 3.5.5 Einfluss des pH-Wertes auf das Wachstum von S. silvae #4I1__________ 113 3.5.6 Bestimmung der Lysozymresistenz bei S. silvae #4I1_________________ 114 3.5.7 Untersuchung der hämolytischen Aktivität von S. silvae #4I1___________ 116 3.5.8 Bestimmung der Temperaturpräferenz von S. silvae #4I1______________ 117 4 Diskussion____________________________________________________ 118 Genetische und Phänotypische Diversität der Streptomyces-Isolate__________ 119 4.1.1 MLST-basierte Einordnung und genetische Diversität der Streptomyces-Isolate _______ 119 4.1.2 Kultivierbarkeit der Streptomyces-Isolate__________________________ 119 4.1.3 Hemmeffekte von Streptomyces-Isolaten__________________________ 120 4.1.4 Biosensorische Profile und antimikrobielle Fähigkeiten von Streptomyces-Bodensolaten 123 Fokussierte Untersuchungen der S. silvae-Stämme_______ 125 4.2.1 Signifikanz der 16S-rRNA-Sequenzidentität in S. silvae_______________ 125 4.2.2 Etablierung von S. silvae als monophyletischen Gruppierung__________ 126 4.2.3 Sekundärmetabolismus und der Einfluss variabler Kulturbedingungen auf die antimikrobielle Aktivität und Biosensor-Induktion der S. silvae-Stämme__130 5 Ausblick______________________________________________________ 139 Literaturverzeichnis_______________________________________________ 142 Anhang________________________________________________________ 173

>Magister Scientiae - MSc / The high rate of rediscovery of known compounds has led to a decline in the discovery of novel natural products. The high biodiversity of organisms growing in extreme conditions such as oceans has led to the increased interest by researchers for their use as a source of novel natural products. Marine bacteria are known for their extensive biosynthetic capacity to produce diverse natural products, which are suitable for various biotechnology applications such as in agriculture, for treatment of fungal plant pathogens, and as antibiotics, for treatment of bacterial infections. This study aimed at discovering novel secondary metabolites from marine bacteria previously associated with novel marine invertebrate species endemic to the South African coast. The methodologies used in this study included a bioassay guided fractionation coupled to genome sequencing and mining. For the bioassay guided fractionation approach, the study first focused on screening marine bacteria for antimicrobial activity when cultured on 4 different media, against fungal strains previously shown to be virulent olive trunk pathogens. In parallel, the bacterial isolates with the most inhibitory activity against the fungal pathogens were also screened for antimicrobial activity against 4 indicator strains including Gram-negative Escherichia coli 1699 (E. coli), Pseudomonas putida, and Gram-positive Staphylococcus epidermidis ATCC14990, and Bacillus cereus ATCC10702. One of the marine bacterial isolates, PE6-126, showed diverse antimicrobial activity including antibacterial and antifungal activity against the tested strains. The genome sequencing data revealed that this isolate was B. cereus based on the average nucleotide identity (ANI) (>99%) to reference strains. antiSMASH analysis of the genome revealed nine predicted secondary metabolite clusters including bacteriocins (2), non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) (2), siderophore (1), sactipeptide (1), betalactone (1), linear azol(in)e-containing peptides (LAP) - bacteriocin (1) and a terpene (1). Some of these pathways had low to no sequence similarity to known pathways, indicating the potential of these pathways to produce novel compounds. One of the pathways showed very high sequence similarity to the thuricin CD pathway in Bacillus thuringiensis. Considering that thuricin CD has been reported to have antimicrobial activity against B. cereus (ATCC1072), it was hypothesised that it could also be produced by PE6-126. However, the antimicrobial extract from PE6-126 was tested for sensitivity to proteinase K and heat treatment, which thuricin CD is known to be sensitive to. The results revealed that the antimicrobial activity was not lost after treatment, implying that a different metabolite could be responsible for the anti-B. cereusactivity. In addition, PE6-126 initially displayed antimicrobial activity against a multi-drug resistant E. coli 1699, suggesting some of the antimicrobial compound/(s) produced by this strain could potentially be novel. The bioassay-guided fractionation approach coupled to Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS) did not lead to identification of the antimicrobial compound/(s), therefore it remains a question whether the secondary metabolite pathways predicted by antiSMASH lead to the production of the active compound/(s).The results from this study showed that even well studied species have the potential to synthesize as yet undescribed compounds, based on the novelty of some of the pathways. This study highlights the importance of employing a genome-guided approach in drug discovery, as there may be many novel compounds to discover from biosynthetic pathways that have not yet been characterised. Further research is needed to identify the antimicrobial compound/(s) produced by PE6-126.