O leite é um alimento muito importante na alimentação humana, mas, quando contaminado com resíduos de antibióticos, pode ser considerado adulterado e constituir risco à saúde pública. Desta forma, é importante que este alimento apresente condições sanitárias adequadas e risco à saúde minimizado ou inexistente. O presente estudo teve como objetivos identificar os resíduos de antibióticos comumente encontrados em leite cru produzido em propriedades rurais no Rio Grande do Sul (RS), avaliar a presença de resíduos de antibióticos nas amostras analisadas quanto ao limite máximo de resíduos (LMR) descrito no Programa Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC), averiguar o conhecimento dos responsáveis pela ordenha do leite quanto aos medicamentos utilizados em seu rebanho, bem como, identificar os resíduos de antibióticos comumente avaliados, na rotina, e a motivação para a escolha destes, em plataformas de recebimento de leite cru em estabelecimentos industriais, inspecionados pelo serviço oficial do RS. Para tanto, foram realizados dois estudos exploratório-descritivos. No primeiro, em 2013, foi realizada coleta de dados a campo, mediante aplicação de questionário referente à administração de medicamentos veterinários, bem como, da análise, no Laboratório Nacional Agropecuário, de 388 amostras de leite cru, oriundas de propriedades rurais distribuídas no Estado. No segundo estudo, que ocorreu de 2014 a 2015, foi aplicado questionário referente aos testes de detecção de resíduos de antibióticos em 36 estabelecimentos industriais, sob inspeção estadual. Os resultados do primeiro estudo demonstraram que 96 (24,7%) amostras apresentaram algum resíduo de antibiótico dos 45 analitos pesquisados. Destas, 91 (23,5%) estavam conformes, segundo a legislação vigente e, apenas, 5 (1,3%) foram suspeitas de violação do LMR descrito no PNCRC. Dos resíduos de antibióticos identificados, os da classe dos macrolídeos (n=51; 13,1%), seguidos das quinolonas (n=49; 12,6%) e das tetraciclinas (n=18; 4,6%) foram os comumente encontrados em leite cru produzido no RS. Quanto ao conhecimento dos responsáveis pela ordenha, infere-se que 22,6% não registraram ou controlaram a administração de medicamentos ao rebanho leiteiro, embora, 87,4% (n=339) tenha assegurado descartar o leite durante o período residual. Ainda, apenas 3,4% (n=13) dos entrevistados consideraram a bula do medicamento ou a orientação de veterinário (n=12; 3,1%), para o descarte do leite, guiando-se, principalmente, pela indicação da cooperativa a qual estiverem associados (55,9%; n=217). No segundo estudo, dos 36 estabelecimentos participantes, 83% foram classificados como fábrica de laticínios, sendo os antibióticos dos grupos dos betalactâmicos (100%) e das tetraciclinas (69%) os comumente pesquisados. Quanto à escolha do teste para a pesquisa de resíduos de antibióticos, esta foi influenciada pela praticidade e rapidez na execução do mesmo (67%) e não no conhecimento, especificamente, dos antibióticos utilizados pelos fornecedores de leite à indústria (22%). Conclui-se que o leite consumido no RS, quanto à presença de resíduos de antibióticos, no período da coleta, apresentou resultados compatíveis com aqueles identificados no PNCRC, oferecendo baixo risco à saúde pública. Mesmo assim, esforços devem ser direcionados quanto à melhoria das boas práticas agropecuárias nas propriedades rurais e às empresas quanto aos critérios de escolha dos testes de detecção de resíduos de antibióticos. / Milk is an important food for human consumption, but when contaminated with antibiotic residues may be considered adulterated and risk to public health. Thus, it is important that this food presents sanitary conditions and minimized or zero risk to the public health. This study aimed to identify the commonly antibiotic residues found in raw milk produced in rural properties in Rio Grande do Sul (RS), to evaluate the conformity of samples regarding the maximum residue limit (MRL) established by the National Plan for Control of Residues and Contaminants in Animal in milk (PNCRC), to verify the knowledge level of people responsible for the milking process, in regard to the medications used in the herd and the withdrawal period, as well to identify the antibiotic residues commonly screened during the dairy processing routine, and the reasons for selecting them, at raw milk receiving points in the dairy plant, inspected by official services in the RS. Therefore, it held two exploratory and descriptive studies. In the first one, the milk samples collection occurred in 2013. At the moment of collection, a questionnaire was employed in order to evaluate the use of veterinary medicines by people responsible for milking. The 388 samples of raw milk, from rural properties distributed along the state were analyzed at the National Agricultural Laboratory. The second one, was from 2014 to 2015, which was administered questionnaire regarding the testing of antibiotic residues in 36 industrial establishments under state inspection. In the first study, 388 samples were analyzed in which 96 (24.7%) contained some antibiotic residue from the 45 analytes searched; 91 of these samples (23.5%), were in conformance with the current legislation. Only a total of five samples (1.3%) were suspected of violating the MRL described in the PNCRC. The antibiotic residues commonly found in the raw milk produced in RS were the macrolides (n=51; 13.1%), followed by quinolones (n=49; 12.6%) and the tetracyclines (n=18; 4.6%). The analysis of degree of knowledge of those responsible for milking demonstrates that 22.6% do not record or control the drug administration to the dairy herd. However, 87.4% (n=339) of the producers ensured to perform the discharge of the milk during the residual period, although, only 3.4% (n=13) of them consider the instructions present in the medicine bottle or the veterinary instructions (n=12; 3.1%) for this procedure, being guided by the cooperative in which they are associated (n=217; 55.9%). In the second study, the results showed that from the 36 participating facilities, 83% were classified as dairy plants, in which it was observed that the most commonly screened antibiotics were those belonging to the beta lactam group (100%) and tetracyclines (69%), whereas the selection of which antibiotic residues to screen, at the milk receiving point of the plant, was influenced by the practicality and quickness in performing the screening (67%) rather than by specific knowledge on which antibiotics were used by milk suppliers (22%). It was concluded that the milk consumed in RS was in accordance with the previously results obtained by the PNCRC in terms of the presence of antibiotic residues during the collection period, offering negligible health risk. However, efforts should be directed to farmers on good agricultural practices and to industries in regard to criteria for choice of tests for antibiotic residue detection.

I lactobacilli sono considerati dei microorganismi non-patogeni. Molti di loro appartengono al gruppo batterico GRAS e/o sono nell’elenco QPS. Dal momento che i lactobacilli intenzionalmente aggiunti agli alimenti possono agire come reservoir di geni di resistenza, la valutazione del rischio deve essere continuamente aggiornata. Lo scopo di questa tesi era la valutazione di alcuni metodi usati per testare e caratterizzare le specie del genere Lactobacillus per quanto riguarda la sicurezza e la potenziale attività probiotica. Nella prima parte due metodi di micro diluzione, il metodo ISO e CLSI, soni stati comparati testando la resistenza agli antibiotici di 54 ceppi L. plantarum. Sulla base di risultati ottenuti il metodo ISO era più adatto per valutare la resistenza di questa specie. Il test del limite di sensibilità della PCR per 8 paia di primers specifici per il rilevamento dei lactobacilli e bifido batteri da feci ha confermato i loro diversi livelli di efficacia. La seconda parte della tesi descrive un progetto di ricerca mirato sulla identificazione di nuovi ceppi probiotici fra diversi ceppi di Lactobacillus paracasei e Lactobacillus rhamnosus identificando dei geni o loci responsabili della interazione con l’ospite, immunomodulazione, e l’inibizione della crescita dei patogeni. Le analisi fenotipiche dei 40 ceppi hanno confemato una grande variabilità fra di loro, che può servire per associare delle caratteristiche fenotipiche a quelle genotipiche. Tra i ceppi dello stesso progetto è stato individuato un ceppo di L. mucosae. Dal momento che questa è una specie relativamente nuova, le sue caratteristiche sono state analizzate comparandole con altri 3 ceppi appartenenti alla stessa specie. In questo modo sono state confermate alcune informazioni su L. mucosae, ma soprattutto sono stati forniti dei dati nuovi sulle proprietà di questa specie. / The species of the Lactobacillus genus are generally believed to be microorganisms with no pathogenic potential. Many of them have granted GRAS and QPS status. Non-pathogenic bacteria as lactobacilli-intentionally added or accidentally present in food-are under evaluation, as they could act as reservoir of resistant genes. This thesis was aimed to evaluate some methods used for testing and to characterize some Lactobacillus species, as regards their safety and potential probiotic activity. The first part of the research focused on the comparison of two broth microdilution methods: ISO and CLSI, in order to assess the resistance of 54 L. plantarum strains to antimicrobial agents. The results suggest better performances of the phenotypic assay developed by ISO, at least for strains belonging to L. plantarum species.Then the assessment of the PCR detection limit for 8 sets of primers for the detection of lactobacilli and bifidobacteria from infant faeces confirmed different levels of effectiveness for the primers. Next part of the thesis was the research project aimed at identifying genes or genetic loci of different strains of two Lactobacillus species (i.e. Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus) involved in the interaction with the host, immune-modulation of host cells and pathogen growth inhibition in order to find new probiotic strains. The phenotypic analysis of 40 selected strains demonstrated large variability between strains of these species, which could serve to the association of phenotypic differences to genome specificities. A strain of Lactobacillus mucosae was found within the framework of the same project. As it is a relatively new species, it was chosen to further investigate its properties, comparing it with three other L. mucosae strains. This study led to confirm some information but first and foremost it has provided new data on the examined species.

Negli ultimi decenni l'utilizzo degli antibiotici a scopo terapeutico o come promotori della crescita nell'allevamento animale ha portato alla comparsa e alla diffusione di microrganismi resistenti. In questo contesto, la presenza di Lattobacilli (LAB) antibiotico resistenti non rappresentano di per sé un rischio clinico. Tuttavia la possibilità che essi ma possono essere veicolo di geni codificanti l'antibiotico-resistenza verso batteri patogeni presenti negli alimenti o nel tratto gastro-intestinale umano (inclusi enterococchi, streptococchi e listeria), costituisce un possibile rischio per la salute umana che deve essere attentamente valutato. Obiettivo di questo lavoro è stato quello di valutare attraverso metodi di indagine fenotipica con le tecniche delle microdiluizioni in brodo, Etest e disc-diffusion, i livelli di antibiotico resistenza per le specie S. thermophilus e L. plantarum verso gli antibiotici tetraciclina, eritromicina, clindamicina, streptomicina, gentamicina, ampicillina. Ceppi atipici appartenenti alla specie S. thermophilus sono stati sottoposti ad analisi genetiche con lo scopo di caratterizzare e localizzare i geni responsabili della resistenza. E' stato inoltre testato il possibile trasferimento orizzontale dei geni di antibiotico resistenza nativi da S. thermophilus verso i batteri Gram-positivi E. faecalis e Listeria monocytogenes. In alcuni ceppi di S. thermophilus resistenti si sono infine osservati e studiati particolari caratteri fenotipici ( fitness ) correlati alla presenza delle determinanti genetiche di antibiotico resistenza nell'ospite batterico. / In the last decades, the use of antibiotics in human therapy or in animal husbandry as growth promoters has induced the development and the diffusion in antibiotic resistant micro-organisms. In this context antibiotic resistant Lactic Acid Bacteria (LAB) do not represent a clinical risk in themselves. However, the possibility that S. thermophilus cultures might transfer antibiotic resistance genes to pathogenic species either present in food or in the gastrointestinal tract (including enterococci, streptococci and listeria) represents a potential clinical risk that needs to be carefully evaluated. The aim of this study was to evaluate by means of phenotypic methods (microdilution, E-test, disc-diffusion) the levels of antibiotic resistance for S. thermophilus and L. plantarum species against the antibiotic tetracycline, erythromycin, clyndamicin, streptomycin, gentamycin and ampicillin. The atypical resistant S. thermophilus strains were subjected to genetic analyses in order to characterise and to localise the antibiotic resistance determinants. Furthermore the ability of the resistant S. thermophilus strains in transferring the antibiotic resistant determinant was assessed in mating experiments using as recipients the Gram-positive bacteria E. faecalis and Listeria monocytogenes. In same resistant S. thermophilus strains, special bacterial fitness related with the presence of the antibiotic resistance determinants in the bacterial hosts were observed and studied.

L’insorgenza e la diffusione dell’antibiotico resistenza sta diventando un problema a livello mondiale. Molti sono gli ambienti in cui può avvenire tale diffusione, ma una delle principali vie di trasmissione passa attraverso la catena alimentare. Infatti, l’utilizzo di sostanze antimicrobiche è largamente diffuso negli allevamenti di animali ad uso alimentare e in agricoltura. In particolare, negli allevamenti gli antibiotici non solo vengono usati per trattare eventuali patologie, ma anche come profilassi e come promotori di crescita. Di conseguenza, questo uso a volte sconsiderato ha portato all’insorgenza di batteri resistenti a tali sostanze. Un ruolo fondamentale nella trasmissione e diffusione di tali resistenze a livello alimentare è svolto da batteri non patogeni che sono parte del naturale microbiota degli alimenti. Questi microorganismi infatti, pur non essendo essi stessi nocivi per l’uomo, possono fungere da reservoir di antibiotico resistenze per eventuali batteri patogeni. I batteri che generalmente svolgono questo ruolo sono i batteri lattici. Per questo motivo molto importante è stato identificare e studiare l’antibiotico resistenza anche di tali microorganismi. Negli ultimi anni, tuttavia, c’è stato un crescente interesse per un’altra classe di microorganismi, chiamata Haloarchaea o alobatteri o archaea alofili, poiché la loro presenza è stata rilevata in alimenti particolarmente salati. Dal momento che in letteratura ci sono pochi lavori che studiano i profili di antibiotico resistenza di tali microorganismi e, comunque, tali profili non sono stati studiati su un numero significativo di microorganismi appartenenti alla stessa specie, il presente lavoro di tesi è volto a definire il profilo di antibiotico resistenza del capostipite degli archaea alofili, che è l’Halobacterium salinarum, verificare se ci sono ceppi che presentano antibiotico resistenze e controllare se tali resistenze possono essere trasferite a batteri patogeni. / Antimicrobial resistance is now widely acknowledged as a major global public health challenge. There are many environments through which the transmission and diffusion of antibiotic resistance could happen, but one of the main routes of transmission is the food chain. As a matter of fact, antibiotic use is widely spread in animal husbandry and in agriculture. In particular, in animal husbandry antimicrobials have been used both for therapeutic reasons and as growth promoters. As a consequence, a selective pressure on pathogenic and commensal bacteria of animal origin has been exerted during the time, leading to the onset of microorganisms resistant to such compounds. A pivotal role in the spread in the food chain of antibiotic resistance has been played by non-pathogenic bacteria present in food. These microorganisms are not harmful for humans, but they could represent a reservoir of antibiotic resistance for foodborne pathogenic bacteria. Usually lactic acid bacteria play this role, since they are present in all fermented food. For this reason, the antibiotic resistance profile of lactic acid bacteria has been assessed. In recent years, another class of microorganisms called halophilic archaea have raised an increasing scientific interest, since they have been found in the human intestinal mucosa as well as in foods such as salted codfish and fermented Asiatic seafood. As a few papers have studied the antibiotic resistance profiles of halophilic archaea, and the only present do not consider a statistically significant number of microorganisms belonging to the same species, the aim of the present work is to define the antibiotic resistance profile of the major exponent of halophilic archaea, named Halobacterium salinarum, and consequently to verify if some strains present antibiotic resistances and if they can transfer these resistances to bacteria present in the food chain.

Obiettivo di questo lavoro è stato valutare la diffusione di AR in differenti ceppi di S. thermophilus isolati tra il 1947 e il 2004 e provenienti da differenti ambienti, in modo da avere un chiaro andamento del fenomeno; questo è stato possibile analizzando un numero significativo di ceppi isolati in un periodo di tempo che va da prima dell'utilizzo degli antibiotici fino ai giorni nostri. L'espressione fenotipica è stata valutata con tre differenti metodi (microdiluizioni in brodo, E-test e Disk Diffusion), in accordo con gli standard NCCLS, per la determinazione delle MICs (Minimum Inhibitory Concentration, ovvero Concentrazioni Minime Inibenti). Per la valutazione genetica è stata impiegata la tecnica dei microarrays a DNA utilizzando oligonucleotidi da 50 e 60-mer, per un totale di 300, appartenenti a 10 diverse classi di antibiotici. La conferma dei risultati è stata ottenuta mediante PCR e sequenziamento. In 9 ceppi di S. thermophilus è stato possibile mettere in evidenza la presenza di almeno uno dei geni tetS ed ermB responsabili della resistenza agli antibiotici Tetraciclina e Eritromicina rispettivamente. / The aim of the present work was to assess the AR diffusion in a total of 70 different strains of Streptococcus thermophilus, collected between 1950 and 2004 and from different environments; in this way we had the possibility to obtain a clear overview of the response of these bacteria to a large variety of antibiotics, having been able to analyze a significant number of different strains, originated from different areas and distributed over a wide time period, since before the use of antibiotics up to the present day. The phenotypic expression has been evaluated by using three different methods: microdilution, E-test and disk diffusion. The genetic analysis was performed using 50 and 60-mer oligonucleotides DNA based micro array for the identification of AR genes; the AR genes represented by the oligonucleotides on the micro array belong to: Aminoglycoside, Extended Spectrum ?-lactamase (ESBL), Chloramphenicol, Macrolide Lincosamides and Streptogramin (MLS) group, Sulfonamide, Tetracycline, Trimethoprim and Vancomycin. tetS and ermB genes were found and sequenced in 4 out of the total of the S. thermophilus investigated. Furthermore we have wanted to establish the genetic location of above-mentioned genes and assess their transfer intra and inter species adopting the conjugation technique in plate.

La scoperta e il successivo uso di antibiotici hanno reso resistenti molte specie batteriche sia di origine animale sia umana. I geni di resistenza agli antibiotici possono essere trasferiti tramite la catena alimentare, a partire dagli animali e alimenti, fino al tratto gastrointestinale degli esseri umani. Il presente studio descrive la proprietà coniugativa di alcuni nuovi plasmidi, in particolare di uno identificato in un ceppo di Lactococcus lactis spp. lactis, isolato dall'intestino di pesce, e di altri plasmidi individuati in ceppi di Lactobacillus brevis, Lb. plantarum e Lb. reuteri, isolati da salame. La trasferibilità dei plasmidi che portano i geni di resistenza per l’eritromicina o tetraciclina è stata valutata con metodi di elettroporazione e coniugazione in vitro. Nello specifico è riportato il trasferimento di tali plasmidi a specie batteriche patogene per l’uomo come Listeria monocytogenes e Staphylococcus spp. e a un agente responsabile di Lactococcosi nei pesci come Lc. garvieae. Dopo lo studio sulle proprietà coniugative si è proceduto alla caratterizzazione di questi elementi extracromosomici con esperimenti di comobilizzazione e stabilità. I dati ottenuti suggeriscono come i LAB possano essere un serbatoio di diffusione dei geni per l’antibiotico resistenza, con gravi rischi per l’allevamento di prodotti ittici e salute umana. / The discovery and subsequent widespread use of antibiotics have rendered many bacterial species of human and animal origin resistant to some antibiotics. Antibiotic resistance gene may be transferred via food chain, from animals into fermented and other food or in the human gastrointestinal tract. The transferability of some plasmids that harbor the tetracycline or erythromycin resistance genes to animal and human pathogens was assessed using electrotrasformation and conjugation. The present study describes the proprieties of some new plasmids, originally isolated from fish intestinal Lactococcus lactis ssp. lactis and from fermented sausage Lactobacillus brevis, Lb. plantarum and Lb. reuteri. In particular, here I report the potentially of transferable antibiotic resistance determinants to human pathogenic bacterial like Listeria monocytogenes and Staphylococcus spp. and to an etiologic agent of Lactococcus infection like Lc. garvieae. The possibility of transferring natural Lactococcus and Lactobacillus plasmids into pathogenic bacterial strains involved the characterization of these elements, like comobilization and plasmid stability. These data suggest that lactic acid bacteria (LAB) might be reservoir organism for acquired resistance genes that can be spread both to fish and human pathogens, posing a risk to aquaculture and human health.