Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind starke Suppressoren des Immunsystems. Für die immunsupressive Wirkung werden lösliche Faktoren propagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob neben den bekannten Sekretionsfaktoren stromaler Stammzellen wie RANK/RANKL/OPG, TNFα, IFNγ und verschiedene Interleukine, andere Sekretionsfaktoren eine immunmodulatorische Wirkung auf monozytäre Zellen haben. Als Sekretionsprodukt wurde hCyr61 untersucht, das im Überstand von mit TNFα behandelten humanen fetalen Osteoblasten (hFOB) nachgewiesen worden war. Das zur CCN-Familie gehörende Protein hCyr61 ist an der Angiogenese beteiligt, wird im Kallus während der Frakturheilung vermehrt exprimiert und hat, wie zwischenzeitlich nachgewiesen wurde, einen deutlichen Effekt auf die Differenzierung endothelialer Vorläuferzellen aus monozytären Zellen. In den hier beschriebenen Experimenten wurden sowohl monozytäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC), als auch THP1-Zellen auf die Veränderung der CD14-, 80-, 83- und 86- Expression unter Stimulation mit und ohne Il-4, GM-CSF und hCyr61 untersucht. Die Expressionsänderung wurde mittels konventioneller PCR, real-time PCR und FACS-Analyse untersucht. In allen drei Nachweismethoden zeigte sich ein Verlust typisch monozytärer Marker wie CD14 unter Stimulation mit hCyr61. Der Verlust an CD14 scheint bei PBMC deutlicher als bei THP1-Zellen, was möglicherweise durch die oben beschriebene endotheliale Differenzierung erklärt wird. THP1-Zellen befinden sich bereits in einer höheren Differenzierungsstufe, sodass sie ihr monozytäres Commitment nicht vollständig verlieren. / Mesenchymal stem cells have a strong suppressive effect on the immune system. Soluble factors are discussed to be responsible for this effect. The aim of this dissertation was to investigate, whether there are other soluble factors with immunomodulatory effects on monocytic cells beside the already known factors like RANK/RANKL/OPG, TNFα, IFNγ and various interleukins. As a soluble factor found in the supernatant of humane fetal osteoblasts stimulated by TNFα, hCyr61 was investigated. This protein belongs to the CCN-family and it takes part in angiogenesis, was found in high concentrations in the callus during the healing process of a fracture and it effects strongly the differentiation of endothelial precursor cells from monocytic cells. The change of the expression of CD14, 80, 83 and 86 was investigated with and without stimulation by Il-4, GM-CSF and hCyr61 in monocytic cells from peripheral blood (PBMC) and THP1-cells. The results were verified by conventional PCR, real-time PCR and FACS analysis. All three methods showed a decrease of CD14 as typical monocyte marker in the presence of hCyr61. The decrease of CD14 in PBMC seems more striking then in THP1, which might be explained by endothelial differentiation mentioned above. THP1 cells have reached a higher level of differentiation, therefore they don´t lose their monocyte commitment anymore.

Ulm, Univ., Diss., 2002.

Tübingen, Univ., Diss., 2005.

Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für die beim Diabetes mellitus Typ 1 zerstörten Betazellen stellen einen hochattraktiven Forschungsansatz dar. Ziel dieser Arbeit war, Insulin-positive Zellen aus in vitro modifizierten Blutmonozyten zu gewinnen. Blutmonozyten sind nicht nur, wie bereits seit längerem bekannt, in der Lage, sich in Makrophagen und dendritischen Zellen zu differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen, wie z.B. Insulin-produzierender Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die gewünschten Zellen in vivo nicht nur ihre Funktion beibehalten, sondern dass von diesen Zellen auch kein immunologisches Risiko für den Patienten ausgeht. Eine dauerhafte Immunsuppression, wie sie für die Vollorgantransplantation notwendig ist, ist für Zelltransplantate nicht angebracht. Hier besteht Übereinkunft, dass Immunsuppressiva, wenn überhaupt, nur kurzfristig einzusetzen sind. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war, die in vitro Differenzierung von Blutmonozyten zu charakterisieren. Dabei sollte die Expression von Insulin, Gluka¬gon und dem Glukosetransporter Glut-2 nachgewiesen werden. Auch morpho¬logische Veränderungen während der Kultur sollten beobachtet werden. Die kultivierten Monozyten entwickelten sich mit zunehmender Kulturdauer eindeutig zu Makrophagen. Dabei waren zwei verschiedene Zellmorphologien zu unterscheiden: Der erste Zelltyp (Typ 1) war oval mit Ausläufern. Der zweite Zelltyp (Typ 2) war sehr groß, teilweise mit einem Durchmesser von über 500 μm, häufig von ovaler Form und polynukleär. Dieser Zelltyp wies zudem häufig einen breiten, um das Kerngebiet gruppierten Saum auf. Mit zunehmender Kulturdauer dominierte dieser Zelltyp die Kultur. Der Großteil der Typ 1-Zellen blieb CD14 positiv. Gab es CD14-negative Zellen in der Kultur, so gehörten sie mit großer Wahrscheinlichkeit zu den Typ 2-Zellen. Nur in den in vitro modifizierten, nicht aber in den frisch isolierten Monozyten waren Insulin, C-Peptid, Glukagon und GLUT-2 immunhistochemisch nachzu¬weisen. Mit zunehmender Kulturdauer dominierten stark adhärente Makrophagen die Kultur. Das aus ca. 5x106 Monozyten isolierte Insulin senkte den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse innerhalb einer Stunde nach Injektion um 66,1±12,8 Prozent (n=5). Zum Vergleich: 170 pg Humaninsulin senkten den Blutzuckerspiegel um 84,2±8,4 Prozent (n=4). Insulin-negative Monozyten beeinflussten nicht den Blutzuckerspiegel diabeticher Mäuse. Zudem lassen erste elektronenmikroskopische Aufnahmen von in vitro modifizierten Monozyten Insulin-haltige Vesikel erkennen. Zum jetzigen Zeitpunkt ist gesichert, dass in vitro modifizierte Monozyten über biologisch aktives Insulin verfügen, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Tiere senkt. Der Nachweis von C-Peptid deutet zudem darauf hin, dass es sich hierbei um de novo Insulin handelt. Dies bedeutet, dass das Insulin-Gen in den in vitro modifizierten Monozyten aktiv ist und sie Insulin mRNA exprimieren, die anschließend in Insulin translatiert wird. Der elektronenmikroskopische Nachweis Insulin-haltiger Granula deutet außerdem darauf hin, dass diese Zellen Insulin speichern können. Inwieweit sie jedoch auch zur Glukose-ab¬hängigen Insulin-Ausschüttung in der Lage sind, ist in weiteren Experimenten zu überprüfen. / Promising cell replacement strategies may restore insulin-secretion in patients with type 1 diabetes. Cells suitable for such a strategy must demonstrate prolonged function in vivo and should not induce immunological responses. A chronic immuno¬suppressive therapy which is requisite for organ grafts is not suitable for cell grafts. Peripheral human blood monocytes easily obtained from patients can be modified in vitro into insulin-positive cells and, therefore may be perfect for autologic cell replacement strategies. The purpose of this study was to characterise cultured monocytes for the presence of insulin and C-peptide as a well-defined indicator for insulin synthesis by immunohistochemistry. In addition, the expression of glucagon and the glucose transporter Glut-2 was proved. During culture, monocytes differentiated into cells with unique morphology. The cell type 1 showed a lengthy-oval shape with branches, like fibroblasts. The cell type 2 was very large, oval in shape and often polynuclear. These cells demonstrated the morphology of long-term cultured macrophages and dominated the culture in the course of time. Cultured monocytes were positive for insulin, C-peptide, glucagon and Glut-2 in contrast to freshly isolated monocytes. Evidence from the electron microscopy indicated that insulin-positive monocytes store their insulin in vesicles. Insulin isolated from 5x106 insulin-positive monocytes was able to reduce blood glucose levels of diabetic mice (> 22 mmol/L) about 66.1±12.8 percent (n=5) within one hour after injection. In comparison, 170 pg of human insulin decreased blood glucose levels of diabetic mice about 84.2±8.4 percent (n=4). Insulin-negative monocytes were unable to reduce blood glucose levels. In this study the possibility of modifying monocytes into insulin-positive cells during culture was confirmed. The detection of C-peptide supports the existence of de novo insulin within these cells which was stored in granula and biologically active. In further studies these cells have to prove whether they are really able to secrete insulin in a dose-dependent manner qualifying them as long-term cell replacements.