Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, μέλη της υπερ-οικογένειας των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούμενων από προσδέτη, είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά οι νικοτινικοί υποδοχείς διακρίνονται σε νευρικούς και μυϊκούς υποδοχείς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών, όπου ενέχονται στη διαβίβαση της νευρικής ώσης στους μυς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών. Επιπλέον από το φυσιολογικό του ρόλο, ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, με σημαντικότερο και καλύτερα μελετημένο το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με μυασθένεια (~80%) ανιχνεύονται στο ορό αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (αντί-υποδοχέα αντισώματα) τα οποία οδηγούν στην ελάττωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μείωση του αριθμού των υποδοχέων προκαλεί αδυναμία δέσμευσης της ακετυλοχολίνης από τη μετασυναπτική μεμβράνη, αναστολή της σύσπασης του μυ και εκδήλωση μυϊκής κόπωσης και αδυναμίας, συμπτώματα χαρακτηριστικά της μυασθένειας. Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης δύνανται να ελαττωθούν μέσω δράσης του συμπληρώματος, αντιγονικής τροποποίησης ή λειτουργικής παρεμπόδισης. Οι σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της αναοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες. Για την προσέγγιση αυτή απαραίτητη είναι η απόκτηση ενός ανοσοπροσροφητή με διαμόρφωση που να προσομοιάζει αυτή του αντιγόνου-στόχου. Ωστόσο, η απόκτηση μεγάλων ποσοτήτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, του υδρόφοβου χαρακτήρα του και της αδυναμίας απομόνωσης του σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για τους λόγους αυτούς, η έρευνα προσανατολίζεται στην μελέτη των εξωκυτταρικών περιοχών (ΕΚΠ) του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα στις οποίες προσδένεται η πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων των μυασθενών. Η καθήλωση ανασυνδυασμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ, δ και ε του υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών εκφρασμένων στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris είχε περιγραφεί και προηγουμένως από το εργαστήριό μας. Ωστόσο, αν και η χρήση των πρωτεϊνών αυτών ως ανοσοπροσροφητών κατάφερε την αφαίρεση ενός ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, δεν επετεύχθη η ικανοποιητική απομάκρυνσή τους. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό των συνδεδεμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ ή ε και δ του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στο σύστημα έκφρασης P. pastoris. Στοχεύοντας στη δημιουργία ενός βελτιωμένου ανοσοπροσροφητή, πραγματοποιήθηκε η σύνδεση όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό συνδέτη. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ, κατασκευάστηκαν σε μία προσπάθεια μίμησης της διαμόρφωσης ολόκληρου του υποδοχέα σε ένα μοναδικό πολυπεπτίδιο. Τα πενταμερή, θεωρητικά φέρουν το σύνολο των αντιγονικών επιτόπων που αναγνωρίζουν τα αντισώματα αλλά και τις διεπιφάνειες των υπομονάδων που πιθανολογείται ότι είναι επίσης ανοσογόνες. Παράλληλα, μελετήθηκαν και τα διμερή α1-β ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ, τα οποία προέκυψαν ως ενδιάμεσα στάδια στην κατασκευή των πενταμερών και φέρουν την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή αλλά με ιδιαίτερα χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον η ανοσοπροσροφητική τους ικανότητα ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων όχι μόνο δεν βελτιώθηκε αλλά παρουσιάστηκε μειωμένη σε σχέση με τις επιμέρους υπομονάδες. Αντίθετα, όσο αφορά στη χρήση συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, το διμερές α1-β ΕΚΠ φαίνεται να τηρεί ένα σύνολο προϋποθέσεων έναντι των πενταμερών β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ, β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ που το καθιστούν καλό υποψήφιο ανοσοπροσροφητή. Σε αυτές συγκαταλέγονται το σχετικά υψηλό επίπεδο παραγωγής του από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης του P. pastoris καθώς και το γεγονός ότι απομονώνεται σε καθαρή μορφή. Σε ότι αφορά το ανοσοπροσροφητικό του προφίλ, φέρει την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα και τα απομακρύνει εξίσου αποδοτικά όσο και το μείγμα των μεμονωμένων α1 και β ΕΚΠ. Επιπλέον, το α1-β ΕΚΠ ως ένα πολυπεπτίδιο, υπερτερεί έναντι των μεμονωμένων α1 ΕΚΠ και β ΕΚΠ καθώς ο χαρακτηρισμός του όσο αφορά τις δοκιμασίες με στόχο την έγκριση για κλινική χρήση αναμένεται να είναι ευκολότερος έναντι των δύο πρωτεϊνών. Τέλος, η υψηλή χωρητικότητά του ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων μπορεί να εξασφαλίσει χαμηλό κόστος παραγωγής, έναν παράγοντα σημαντικό για την εφαρμογή της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης σε μεγάλη κλίμακα. Ο επιτυχής χαρακτηρισμός του α1-β ΕΚΠ σχετικά με παραμέτρους σταθερότητας, τοξικότητας και ασφάλειας θα μπορούσε να σηματοδοτήσει την έναρξη των κλινικών δοκιμών για τη χρήση του ως ανοσοπροσροφητή στην εφαρμογή της νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια σε ανθρώπους. / Myasthenia gravis is an antibody mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction. The muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is the main antigen in myasthenia gravis. Circulating antibodies against the acetylcholine receptor are the main pathogenic factors, causing loss of the available functional receptors at the neuromuscular junction with the consequent impairment of signal transduction. Muscle nicotinic acetylcholine receptors are transmembrane proteins formed by 5 homologous subunits: two α subunits and three β, γ (in the embryo and replaced by ε in the adult) and δ. Typically, each subunit consists of an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane region and a cytoplasmic loop. The ECDs carry most of the epitopes for MG autoantibodies ,with subunit α baring the main immunogenic region. Current MG treatments include the use of anticholinesterase drugs, immunosuppressants or immunomodulators, plasmapheresis and thymectomy with none of these approaches being specific. The selective removal of anti-AChR antibodies from the blood of MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. In our laboratory, we aim to develop this method using recombinant extracellular domains (ECDs) of the AChR subunits (α, β, γ, δ and ε) as immunoadsorbents immobilized on CN-Br Sepharose. We have previously described the expression of the individual ECDs in P. pastoris system and their characterization. The aim of this dissertation was to study and characterize the linked ECDs of the α, β, γ, δ and ε subunits expressed in the yeast P. pastoris system. In an attempt to improve immunoadsorption efficiency we expressed the AChR subunits linked with a flexible peptide linker 24 amino acids long. More specifically we designed and characterized two pentameric constucts namely β-δ-α1-γ-α1 ECD & β-δ-α1-ε-α1 ECD to mimic the whole pentameric extracellular domain of the AChR in a native conformation. We also examined two dimeric constructs (α1-β ECD & β1-α ECD) since these subunits carry the majority of MG epitopes. Regarding the pentamers, they were successfully expressed in the P.pastoris system but with the expression yield being relatively low. Furthermore their immunoadsorbing ability was limited in comparison with the mixture of all five ECDs. This fact, combined with their small expression yield, poses a serious obstacle for their use in therapy. On the other hand, both expression yield and antibody binding of the α1-β dimer were satisfactory, at least as good as the mixture of individual α and β ECDs. In addiction, the high capacity of thee α1-β ECD in combination with its expression yield suggests that few milligrams of protein could be sufficient for the clearance of the plasma from an average titer patient. Such a quantity could be easily obtained, allowing the large scale application of the method, while reducing the cost. Therefore, the α1-β dimer constitutes a suitable candidate to be used as efficient immunoadsorbent in the development of a specific therapy against MG. Further characterization of the α1-β ECD, with respect to stability, toxicity and safety aspects, could mark the initiation of animal studies. The successful completion of these studies is crucial for the advancement into clinical trials, for the use of the α1-β ECD as immunoadsorbent in the antigen-specific therapy for myasthenia gravis.