Orientador: Eduardo Maffud Cillli / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Vani Xavier de Oliveira Júnior / Resumo: Neste trabalho foi avaliado o efeito da dimerização e do comprimento/polaridade do espaçador utilizado na formação dos dímeros, na estrutura e atividade biológica do peptídeo antimicrobiano: Gly-Trp-Leu-Asp-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Gly-Lys-Ala-Ala-Phe-Asn-Val-Ala-Lys-Asn-Phe-Leu-CONH2. Nesse sentido, o monômero e três dímeros com diferentes espaçadores foram sintetizados pelo método de síntese de peptídeo em fase sólida (SPFS) utilizando uma combinação das químicas Fmoc e Boc. Análises por cromatografia de fase reversa e espectrometria de massas confirmaram o sucesso das sínteses e das purificações. Os ensaios de atividade antimicrobiana, em termos de CIM mostraram que a dimerização não aumentou a capacidade do peptídeo de inibir o crescimento de bactérias e fungos. No entanto, quando analisada a capacidade dos peptídeos de matar E. coli, um menor tempo para produzir o efeito inibitório foi observado para os dímeros. Adicionalmente, a atividade hemolítica dos peptídeos também foi avaliada, encontrando-se um aumento significativo, aproximadamente 40 vezes, para os dímeros em relação ao monômero. Com o objetivo de tentar explicar esses efeitos, o teste de proteção osmótica foi realizado. No entanto, o tamanho dos poros foi semelhante, o que não permite explicar as diferenças em termos desta variável. Conhecendo seus diâmetros, foi possível determinar que o poro é formado por 6 moléculas monoméricas ou 3 diméricas. Estudos de permeabilização mostraram que a porcentagem e a velocidade de liberação de carboxifluoresceína foram maiores para os dímeros quando comparados com o monômero, especialmente em vesículas contendo esfingomielina. Este ensaio também mostrou que a duplicação da concentração de monômeros não é suficiente para atingir a capacidade de permeabilização dos dímeros, confirmando que a proximidade das cadeias é um fator... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work analyzed the effect of dimerization and the length/polarity of the spacer used in the formation of dimers, in the structure and biological activity of the antimicrobial peptide: Gly-Trp-Leu-Asp-Val-Ala-Lys-Lys-Ile-Gly-Lys-Ala-Ala-Phe-Asn-Val-Ala-Lys-Asn-Phe-Leu-CONH2. In this way, the monomer and three dimers (Lys-branched) with different spacer groups were synthesized by solid phase peptide synthesis methodology using a combination of Fmoc and Boc chemical approaches. Analysis by reverse phase chromatography and mass spectrometry confirmed the success of the synthesis and purifications. The antimicrobial activity assay, in terms of MICs showed that dimerization did not increase the ability of the peptides to inhibit the growth of bacteria and fungi. Nevertheless, when analyzing the peptides activity against E. coli in terms of kinetics, an increased velocity was observed for the dimers. The hemolytic activity of peptides was also evaluated, finding a very significant difference, approximately 40 times greater for dimers. Aiming to explain this difference, the osmotic protection test was performed, but the pore size was similar, which can not explain the differences in terms of this variable. Knowing the diameter of the pores, it was possible to determine that the pore is formed by six monomeric or three dimeric molecules. Additionally, permeabilization studies showed that the percentage and rate of carboxyfluorescein release were larger for the dimers compared with monomer, especially in vesicles containing sphingomyelin. This test also showed that the use of two times more monomer concentration's is not sufficient to reach dimers permeabilization capacity, confirming that the proximity of the chains is an important factor in the activity of this peptide. Analysis by circular dichroism revealed that peptides in aqueous solution are in random coil, whereas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A hepcidina é uma proteína que faz parte do sistema imune inato e desempenha um papel fundamental na regulação da homeostase do ferro. Este peptídeo foi previamente caracterizado em várias espécies, entretanto, até agora, não em ovinos. O objetivo deste estudo foi de determinar a sequência do RNAm codificante da hepcidina, bem como caracterizar e realizar a análise da expressão gênica deste peptídeo em diferentes tecidos de ovinos saudáveis. A região codificante da hepcidina consiste em 249 pares de base, as quais codificam um peptídeo contendo 82 aminoácidos. Este precursor, da forma bioativa da hepcidina, apresenta maior homologia com as sequências de Bos taurus e Bubalus bubalis. A hepcidina foi expressa predominantemente no fígado dos ovinos, contudo foram observados altos níveis de expressão no abomaso e baixos níveis nos outros tecidos. Estes resultados ampliam o conhecimento comparativo deste peptídeo, mostrando a relação da hepcidina ovina com a de outras espécies de mamíferos e será útil para estudos futuros sobre o metabolismo de ferro e do processo inflamatório nos ovinos. / Abstract: Hepcidin is part of the innate immune system, and plays a central role in the regulation of iron homeostasis. This peptide has been previously characterized in several species but not in sheep until now. The aim of this study was to sequence, characterize and perform hepcidin gene expression analysis in different tissues of healthy sheep. The resulting ORF consisted of 249 bp predicted to encode an 82 amino acids peptide. The deduced precursor was mostly homologous to Bos taurus and Bubalus bubalis. Hepcidin was predominantly expressed in liver, although high expression was present in abomasum and lower level expression occurred in other tissues. These findings extend our comparative knowledge of this peptide, showing the relationship between sheep hepcidin and other mammalian hepcidins and might be helpful for additional studies on iron metabolism and inflammatory process in sheep. / Orientador: Alexandre Secorun Borges / Coorientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Juliana Regina Peiró / Mestre