München, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Universiẗat, Diss., 2006--Giessen.

Zugl.: Bonn, Univ., Diss., 2007

Universiẗat, Diss--Aachen, 2004.

Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2008

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Thesis (doctoral)--Universität, Giessen, 2004.

Universiẗat, Diss., 2004--Gießen. / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Univ., Diss., 2006--Giessen

Ubiquitous bacterial species with the potential to serve as reservoir for antibiotic resistance genes are fanning the flames of antimicrobial resistance. Shortly after discovering the high-level daptomycin (DAP) resistant Mammaliicocci sciuri (M. sciuri) strain TS92 this threat was apparent, as first genetic studies of the Ziebuhr group pointed towards a novel resistance mechanism. The elucidation of this resistance mechanism was therefore urgently required and was addressed by investigating the biological and the chemical background. The aim of this work was to explore the chemical background by applying LC-(HR)MS techniques. Non-specific adsorption was identified as the reason for the initial observation of highly deviating results when working with DAP. The extent was therefore evaluated in a study including several solvents and matrices as well as several syringe filter, ultrafiltration, and reaction container materials. It was shown, that the adsorption behavior of DAP is strongly dependent on the solvent and the contact surface but does not follow any general rule. It became apparent that a preliminary empirical study is always necessary to select an individually suitable combination. Moreover, it could be demonstrated that polypropylene containers are entirely unsuitable for DAP in Mueller-Hinton (MH) medium, as the adsorption loss is already > 25% after one transfer. Within the frame of this study, the use of Protein LoBind® or, with reservation, laboratory glass surfaces was highly recommended instead, whenever possible. The most suitable storage solvent for DAP stock solutions was found in 50% methanol. Following these recommendations resulted in precisely reproducible results in both the biological and chromatographic studies. In previous experiments, a degradation of DAP incubated together with M. sciuri TS92 was suspected. To confirm this, a suitable LC-MS/MS method for the quantification of DAP in a bacterial growth medium and in presence of M. sciuri TS92 was therefore developed. The sample preparation consisted of sterile filtration followed by solvent-induced protein precipitation and centrifugation. The reversed phase chromatography assay made use of a gradient elution and covered the concentrations from 1 to 20 μg/mL by a 1/x² weighted linear regression model, that was calculated from eight calibration levels within the range. All requirements of the internationally approved European Medicines Agency (EMA) guideline on bioanalytical method validation were met. It was subsequently applied to study the time-dependent amount of DAP in presence or absence of M. sciuri TS92 in MH medium. The initial suspicion was confirmed, as the amount of DAP decreased significantly after 24 h of incubation only in presence of M. sciuri TS92. Thus, antibiotic inactivation was hypothesized to be the defense mechanism against DAP. The novel two-gene operon drcAB was found by the Ziebuhr group to mediate the resistance of M. sciuri TS92 against DAP. Moreover, the group provided a heterologous expressible clone of this operon on a plasmid vector, which was transformed into DAP-sensitive Staphylococcus aureus (S. aureus), generating S. aureus RN4220_Pxyl/tet-drcAB. The previously developed DAP quantification assay was applied here to monitor the time dependent amount of DAP in a liquid MH medium culture of this strain upon heterologous drcAB expression. The assay remained applicable and valid for the cultures of this artificial S. aureus strain and it could be demonstrated that the presence of DrcAB leads to a significant loss of DAP after 24 h of incubation. Along with the results of the Ziebuhr group, this was evidence that drcAB expression indeed confers DAP resistance to S. aureus, namely by structural modification(s) and thus antibiotic inactivation. For the qualification of these structural modification(s), drcAB expressing and non-expressing S. aureus RN4220_Pxyl/tet-drcAB cultures in MH medium were again spiked with DAP. After 24 h of incubation, their supernatants were subjected to untargeted LC-HRMS analysis. Apart from the detection principle, this method was a slightly modified version of the previously quantification method. HRMS and MS/HRMS data were simultaneously obtained from information-dependent acquisition runs providing comprehensive characterization of the sample compositions. The subsequently performed GUCS approach revealed two substances that emerge in the presence of DrcAB. Under consideration of the corresponding (MS/)HRMS information, the isotope pattern and the in silico plausibility, the data allowed structural elucidation of both substances. The structures found suggested a two-step modification mechanism of DAP, comprising the N-substitution of the arylamine moiety of kynurenine with C3H4NO and subsequently the hydrolysis of the lactone moiety. This resulted in the postulation that DAP is deprived of its antibiotic effect by the enzymatic transfer of dehydroalanine. / Ubiquitär vorkommende bakterielle Spezies, die als Genreservoir für Antibiotikaresistenzen dienen können, sind Öl für das Feuer der antimikrobiellen Resistenz. Kurz nach der Entdeckung des hochgradig Daptomycin (DAP)-resistenten Mammaliicocci sciuri (M. sciuri) TS92, als die ersten genetischen Studien der Arbeitsgruppe Ziebuhr auf einen neuartigen Resistenzmechanismus hindeuteten, war diese Bedrohung erkennbar. Die Aufklärung dieses Resistenzmechanismus war daher dringend erforderlich und wurde durch Untersuchungen des biologischen als auch des chemischen Hintergrunds adressiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des chemischen Hintergrundes unter Anwendung verschiedener flüssigchromatographischer sowie massenspektrometrischer Techniken. Eine unspezifische Adsorption wurde als Grund für die, zu Beginn der Untersuchungen, häufige Beobachtung voneinander abweichender Ergebnisse bei der Arbeit mit DAP identifiziert. Das Ausmaß wurde daher in einer Studie bewertet, in der unterschiedliche Lösungsmittel und Matrices, sowie unterschiedliche Materialien für Spritzenfilter, Ultrafiltrationsmembranen und Reaktionsgefäßen einbezogen wurden. Es wurde gezeigt, dass das Adsorptionsverhalten von DAP stark vom Lösungsmittel und der Kontaktoberfläche abhängig ist, dabei jedoch keiner allgemeinen Regel folgt. Daraus wurde ersichtlich, dass zur Auswahl einer individuell geeigneten Kombination immer eine empirische Voruntersuchung notwendig ist. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass Polypropylen-Reaktionsgefäße völlig ungeeignet für DAP in Müller-Hinton (MH) Medium sind und dass bei dessen Verwendung bereits nach einem Transferschritt ein Adsorptionsverlust von mehr als 25% auftritt. Im Rahmen dieser Studie wurde stattdessen die Verwendung von Protein LoBind® oder, unter Vorbehalt, Laborglas Oberflächen wann immer möglich empfohlen. Das geeignetste Lösungsmittel zur Lagerung von DAP-Stammlösungen war 50% Methanol. Die Einhaltung dieser Empfehlungen führte sowohl bei den biologischen als auch bei den chromatographischen Studien zu gut reproduzierbaren Ergebnissen. In früheren Experimenten wurde der Abbau von DAP bei Inkubation mit M. sciuri TS92 vermutet. Um dies zu bestätigen, wurde deshalb eine geeignete LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von DAP in bakteriellen Wachstumsmedien und in Anwesenheit von M. sciuri TS92 entwickelt. Die Probenvorbereitung bestand zunächst aus einer Sterilfiltration mit anschließender lösungsmittelinduzierten Proteinfällung und Zentrifugation. Die Umkehrphasen-chromatographische Prüfung verwendete ein Gradient und umfasste den Konzentrationsbereich von 1 bis 20 μg/mL. Dieser wurde durch ein lineares Regressionsmodell aus acht Kalibrierpunkten mit einer Gewichtung von 1/x² abgedeckt. Alle Anforderungen der international anerkannten European Medicines Agency (EMA)-Leitlinie „Guideline on bioanalytical method validation“ wurden eingehalten. Anschließend wurde die Methode zur zeitabhängigen Untersuchung der Menge an DAP in MH-Medium bei An- bzw. Abwesenheit von M. sciuri TS92 verwendet. Der initiale Verdacht wurde bestätigt, nachdem die Menge an DAP nach einer Inkubationszeit von 24 h nur bei Anwesenheit von M. sciuri TS92 signifikant abfiel. Daher konnte die Inaktivierung des Antibiotikums als Abwehrmechanismus gegen DAP angenommen werden. Die Arbeitsgruppe Ziebuhr zeigte, dass das neuartige und aus zwei Genen bestehende drcAB Operon die DAP-Resistenz an M. sciuri TS92 vermittelt. Außerdem stellte die Gruppe einen heterolog exprimierbaren Klon des Operons auf einem Plasmidvektor bereit, der in einen DAP-sensitiven Staphylococcus aureus (S. aureus) transformiert wurde, wodurch S. aureus RN4220_Pxyl/tet-drcAB entstand. Die zuvor entwickelte DAP-Quantifizierungsmethode wurde verwendet, um die zeitabhängige DAP-Menge in einer flüssigen MH-Kultur dieses Stamms nach heterologer drcAB-Expression zu untersuchen. Die Methode blieb anwendbar und valide für die MH-Kultur dieses künstlichen S. aureus Stamms und es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von DrcAB zu einem signifikanten DAP-Verlust nach einer Inkubationszeit von 24 h führte. Zusammen mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe Ziebuhr weist dies daraufhin, dass die Expression von drcAB tatsächlich eine DAP-Resistenz in S. aureus erzeugt, und zwar durch strukturelle Modifikation(en) und somit durch Inaktivierung des Antibiotikums. Zur Qualifizierung dieser strukturellen Modifikation(en) wurden drcAB exprimierende und nicht exprimierende S. aureus RN4220_Pxyl/tet-drcAB Kulturen in MH-Medium erneut mit DAP dotiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurden die Überstände einer ungerichteten LC-HRMS Analyse unterzogen. Abgesehen vom Detektionsprinzip wurde eine geringfügig veränderte Methode der Quantifizierungsmethode verwendet. HRMS- und MS/HRMS-Daten wurden simultan durch IDA-Messläufe generiert, wodurch eine umfassende Charakterisierung der Probenbestandteile erhalten wurde. Der im Anschluss durchgeführte GUCS Ansatz offenbarte zwei Substanzen, die bei Anwesenheit von DrcAB auftreten. Unter Berücksichtigung der dazugehörigen (MS/)HRMS-Informationen, der Isotopenmuster und der in silico-Plausibilität, erlaubten diese Daten die Strukturaufklärung beider Substanzen. Diese lassen einen zweistufigen Modifizierungsmechanismus vermuten, in dem zunächst die N-Substitution des Arylaminrestes von Kynurenin mit C3H4NO und anschließend die Hydrolyse des Lactons stattfindet. Dies führte zur Postulierung, dass DAP durch die enzymatische Übertragung von Dehydroalanin seiner antibiotischen Wirkung beraubt wird.