Tesis para optar al grado de Magíster en alimentos, mención gestión, calidad e inocuidad de los alimentos / Los alimentos de origen amiláceo procesados a altas temperaturas (fritura y horneado), contienen compuestos considerados probables carcinogénicos tales como la acrilamida, cuyos principales precursores son los azucares reductores y la asparagina. Uno de los métodos mas efectivos en la reducción de acrilamida es el uso de la enzima L-asparaginasa. Esta enzima reacciona directamente con la asparagina. El objetivo de este trabajo fue reducir la concentración de acrilamida en sopaipillas fritas mediante el uso de la enzima L-asparaginasa, variando tiempos de reposo y concentración de la enzima; además realizar un modelo predictivo de formación de acrilamida que relacione la generación de color y la aparición del contaminante. Basado en la bibliografía, se definió un rango de concentración de 60 a 1000 ppm (mg asparaginasa/kg harina) y un rango de tiempos de reposo de la masa de 0 a 30 minutos, se corrió un diseño de cribado con cinco variables de respuesta (concentración de acrilamida, concentración de asparagina en la masa cruda y frita, y concentración de ácido aspártico en masa cruda y frita). Las sopaipillas se elaboraron con una receta optimizada desde el punto de vista sensorial y se frieron a 170+ 1ºC por 3 minutos; en el caso de las muestras, para determinar la generación de acrilamida la temperatura se mantuvo constante y los tiempos se variaron desde los 130 segundos hasta los 250 segundos con incrementos de 30 segundos entre cada medición. La adición de L-asparaginasa demostró ser un método efectivo para disminuir el contenido de acrilamida en sopaipillas; en todos los niveles de adición de Lasparaginasa, independiente de los tiempos de reposo, generó una reducción de acrilamida a concentraciones menores a los 25 ppb. Se desarrolló un método de “clean-up” que permitió el análisis de las muestras de sopapillas mediante GC-MS y se determinó un modelo de formación de acrilamida en sopaipillas que permitió relacionar la generación de color con la aparición de acrilamida, este modelo predictivo tiene un coeficiente de correlación de 0,8912 / Foods rich in carbohydrates subjected to high temperature processes (frying or baking), contain potential carcinogenic compounds such as acrylamide, whose mainly precursors are reducing sugars and asparagine. One of the most effective methods for reducing acrylamide is the use of the enzyme L-asparaginase. This enzyme reacts directly with the asparagine that is the most important precursor in the formation of acrylamide. The objective of this thesis was to reduce the concentration of acrylamide in fried sopaipillas using the enzyme L-asparaginase, varying the resting time and the concentration of the enzyme added to the dough. Also with the information gathered the thesis sought to generate a predictive model for the formation of acrylamide that relates the generation of color and the appearance of the studied contaminant. Based on literature review a range of concentrations from 60 to 1000 ppm (mg asparaginase/Kg Flour) and a range of resting time for the dough from 0 to 30 minutes were defined. Using statgraphics® software a screening design with five response variables (acrylamide concentration, asparagine concentration in fried and raw dough, and aspartic acid concentration in fried and raw dough) was run. The sopaipillas were manufactured using a recipe optimized by a sensory panel and fried at 170ºC + 1ªC for 3 minutes. For the samples used in the determination of acrylamide generation the temperature was maintained constant and the frying time varied from 130 seconds to 250 seconds with 30 second of increase between each measurement. The addition of L-asparaginase demonstrated to be an effective method to diminish the acrylamide content in fried sopaipillas; in every level of addition of L-asparaginase, independent of the resting times, a reduction below 25 ppm of acrylamide was obtained. A clean-up method that allows the analysis of sopaipilla samples by GC-MS was developed and, a model of acrylamide generation on sopaipillas was determined. This model allows relating the color development with the generation of acrylamide. This predictive model has a correlation coefficient of 0,8912 / Fondef

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / La enzima L-asparaginasa II, que hidroliza L-asparagina en ácido aspártico y amonio, es utilizada actualmente como agente quimioterapéutico, en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloblastica aguda (LLA), linfoma no Hodgkin, melanosarcoma y carcinoma hepatocelular entre otros, dado su efecto antineoplásico sobre ciertos tipos de células tumorales que son incapaces de producir L-asparagina y dependen de la circulante para su proliferación. A pesar de su rol exitoso en el tratamiento de estas enfermedades, su uso es constantemente reevaluado ya que genera efectos secundarios, asociados a la actividad inespecífica de la enzima sobre un segundo sustrato estructuralmente similar a la Lasparagina, la glutamina, generando pancreatitis, disfunción renal, trombosis, hemorragia y reacciones de hipersensibilidad. Además, otro factor que afecta su uso en tratamientos a largo plazo es la generación de anticuerpos en los tejidos posterior a su aplicación, neutralizando su efecto sobre células tumorales. La presencia de esta enzima se ha descrito en diversos organismos, siendo las actualmente utilizadas las producidas por microorganismos. Entre ellos, las bacterias marinas del orden actinobacteria son de gran interés, ya que se han descrito Lasparaginasas II sin actividad glutaminasa. Dado el interés por encontrar nuevas asparaginasas con baja o nula actividad glutaminasa es que se estudió una nueva Lasparaginasa II descrita en el genoma de la actinobacteria Salinispora tropica CNB 440 que hasta el momento no ha sido caracterizada. Para ello el gen que codifica la enzima L-asparaginasa II fue amplificado a partir del genoma de S. tropica CNB 440 y clonado en el vector de expresión pET22b(+), con el cual se quimiotransformó cepas de E. coli BL21(DE3) quimiocompetentes. Dada la presencia de inducción basal, las cepas fueron co-transformadas con el vector pLysS, obteniendo colonias doble transformantes de E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solucionando este problema. Posteriormente se indujo la expresión del constructo en células co-transformadas con IPTG, obteniendo la expresión de la proteína recombinante de forma soluble para los cultivos inducidos a 25ºC con 0.1 y 0.2 mM de IPTG. Luego se evaluó la actividad a 37ºC de la enzima L-asparaginasa II a partir de extractos crudos de los cultivos anteriores, mediante Nesslerización para los sustratos L-asparagina y L-glutamina, obteniendo exclusivamente actividad asparaginasa por parte de la enzima. Luego se realizó purificación de la proteína recombinante mediante cromatografía en columna Ni-NTA, obteniendo muchas proteínas contaminantes, por lo que se utilizó la técnica de cromatografía Ni-NTA en batch, para aumentar la especificidad por la proteína recombinante; sin embargo, su correcta purificación no fue posible. Finalmente se realizó una estimación de la actividad enzimática a partir de la muestra de extracto crudo inducido a 25ºC con 0.1 mM de IPTG, obteniéndose una actividad específica de la Lasparaginasa II de 117,81 U/mg y no actividad sobre L-glutamina. / The enzyme L-asparaginase II, which hydrolyzes L-asparagine to aspartic acid and ammonium, is currently used as a chemotherapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, acute myeloblastic leukemia, non-Hodgkin lymphoma, melanosarcoma and hepatocellular carcinoma, among others, due to its antineoplastic effect on certain types of tumor cells that are incapable of producing L-asparagine and depend on the circulating L-asparagine for their proliferation. Despite its successful role in the treatment of these diseases, its use is constantly reevaluated since it generates secondary effects, associated with the specificity of the enzyme to a second substrate due to its structural similarity, glutamine. These effects include pancreatitis, renal dysfunction, thrombosis, hemorrhage and hypersensitivity reactions. In addition, another factor that affects its use in long-term treatments is the generation of antibodies in the tissues after its application, neutralizing its effect on tumor cells. Asparaginases are distributed among living organisms, and those produced by microorganisms are currently used. Among them, marine bacteria of the actinobacteria order are of great interest, since L-asparaginases II without glutaminase activity has been reported. Given the interest in finding new asparaginases with low or no glutaminase activity, a new L-asparaginase II described in the genome of the actinomycete Salinispora tropica CNB 440 that has not been characterized yet, was studied. To accomplish this, the gene coding for the enzyme L-asparaginase II was amplified from the genome of S. tropica CNB 440 and cloned into the expression vector pET22b(+), which was used to chemotransform chemocompetent E. coli BL21 (DE3) strains. Given the presence of basal induction, the strains were co-transformed with the vector pLysS, obtaining double transformant colonies named E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solving this problem. Subsequently, the expression of the construct was induced with IPTG in cotransformed cells, obtaining the expression of the recombinant protein in a soluble form for the cultures induced at 25 ° C with 0.1 and 0.2 mM of IPTG. The activity at 37ºC of the enzyme L-asparaginase II was evaluated from crude extracts of the cultures, by Nesslerization for the substrates L-asparagine and L-glutamine, obtaining only asparaginase as enzymatic activity. Purification of the recombinant protein was initially performed by Ni-NTA column chromatography, obtaining a low-purity recombinant protein, so the technique was varied to Ni-NTA chromatography in batch, to increase the affinity for the asparaginase. However, its correct purification was not possible. Finally, an estimation of the enzymatic activity was made from crude extract induced at 25°C with 0.1 mM of IPTG, obtaining a specific activity of L-asparaginase II of 117.81 U/mg, and no activity on L-glutamine.