Universiẗat, Diss., 2006--Würzburg.

Würzburg, Univ., Diss., 2009.

In den letzten Jahren haben Pilzinfektionen zugenommen und bakterielle Infektionen nahezu überholt, wofür vor allem der massive Einsatz von Medikamenten sowie operative Eingriffe verantwortlich sind. Einer der gefährlichsten Auslöser schwerer Pilzinfektionen, die innere Organe schädigen und sehr schwer zu behandeln sind, ohne dabei den Wirtsorganismus zu schädigen, ist der opportunistische Hefepilz Candida albicans. Da aufgrund der immer größer werdenden Zahl von Resistenzen von Candida albicans nur ein relativ kleines Repertoire für die Therapie zur Verfügung steht, war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Synthese einer Reihe peptidischer Inhibitoren mit elektrophilen Bausteinen als potentielle irreversible Inhibitoren der sekretorischen Aspartat-Proteasen (SAPs) des Hefepilzes Candida albicans und deren Testung an dem am stärksten exprimierten SAP-Isoenzym SAP2 sowie anderen Proteasen. Dabei sollte geklärt werden, ob neben der HIV-1-Protease auch andere Aspartat-Proteasen durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar sind, ob andere elektrophile Ringe sowie elektronenarme Michael-Systeme in der Lage sind, als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren zu fungieren, und ob die Z-Konfiguration der Olefine für die Hemmung von Aspartat-Proteasen ebenso wichtig ist wie die cis-Konfiguration bei Epoxiden. Die Aziridin-2-carboxylat-Bausteine wurden als Racemate über Cromwell-Synthese gewonnen und die Aziridin-2,3-dicarboxylat-Bausteine stereoselektiv aus Tartraten dargestellt. Die Oxiran-2-carboxylat-Bausteine wurden enantioselektiv ausgehend von Threonin bzw. als Racemate über Darzens-Glycidester-Synthese dargestellt. Die Synthese der Oxiran-2,3-dicarboxylat-Bausteine gelang mittels tertButylhydroperoxid / BuLi aus den Maleaten. Die Z-Olefinbausteine wurden durch Kupplung von Alkoholen bzw. AS an Maleinsäureanhydrid erhalten oder über Wittig- bzw. Horner-Wadsworth-Emmons-Reaktion dargestellt. Die Kupplung von AS bzw. Peptiden an die elektrophilen Bausteine erfolgte mit gängigen AS- / Peptidkupplungsmethoden. Die als irreversible Inhibitoren der SAP2 konzipierten Verbindungen wurden in einem neu entwickelten fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre SAP2-Hemmung getestet. Dazu wurde ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt und die zunehmende Fluoreszenz durch das Spaltprodukt der enzymatischen Hydrolyse des Substrats bei 540 nm detektiert (Anregung 355 nm). Als Substrat diente das Undecapeptid Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ markiert die Spaltstelle). Von den Inhibitoren wurden IC50-, k2nd- und, falls möglich, ki- und Ki-Werte ermittelt. Von den 41 an der SAP2 getesteten AS- / Peptid-verknüpften Verbindungen stellen die beiden Aziridine A-07 und A-08 mit k2nd-Werten im mittleren fünfstelligen Bereich [M-1min-1] die besten Inhibitoren dar. Bis auf zwei Verbindungen zeigen alle aktiven Verbindungen an der SAP2 sinkende IC50-Werte bei längerer Inkubationszeit und somit eine zeitabhängige und irreversible Hemmung. Zur Untersuchung der Selektivität wurden die Verbindungen mittels kontinuierlicher Assays an den Cystein-Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) getestet. Als Substrat wurde dabei Cbz-Phe-Arg-AMC verwendet. Erfreulicherweise waren bis auf das E-konfigurierte Olefin E-Ol-04 alle Verbindungen an den Cystein-Proteasen inaktiv. Die Ergebnisse zeigen, dass neben den HIV-Proteasen auch die sekretorische Aspartat-Protease SAP2 durch cis-konfigurierte Epoxide irreversibel hemmbar ist. Desweiteren zeigt sich, dass mit Aziridinen auch andere elektrophile Ringe als irreversible Aspartat-Protease-Inhibitoren fungieren können. An der SAP2 zeigen sich die Aziridine sogar aktiver. Auch elektronenarme Michael-Systeme sind in der Lage Aspartat-Proteasen zu hemmen, auch wenn ihre Hemmung deutlich schwächer ist als die der Aziridine. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass nicht, wie angenommen, die Z-Konfiguration der Olefine entscheidend ist, sondern dass E-Olefine sogar bessere Hemmungen aufweisen. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Joachim Morschhäuser und Dr. Peter Staib vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg, konnte gezeigt werden, dass die Aziridine A-07 und A-08 neben dem isolierten Enzym auch die SAP2-Produktion in Candida albicans-Zellkulturen hemmen ohne auf die Pilzzellen toxisch zu wirken. Neben der Hemmung der SAP2 wirken die Aziridine A-07 und A-08 auch antiplasmodial. Bei Testungen am Malaria-Erreger Plasmodium falciparum zeigten beide Aziridine einen IC50-Wert im unteren mikromolaren Bereich. Der Grund der Hemmung des Parasiten ist jedoch noch unklar, da A-07 und A-08 weder an den isolierten Cystein-Proteasen des Malaria-Erregers Falcipain 2 und 3 aktiv sind, noch dessen Aspartat-Protease Plasmepsin II hemmen. / Over the last years fungal infections have increased dramatically and now nearly exceed the number of bacterial infections. Reasons are the massive use of antibiotics and the increasing number of surgeries. One of the most serious pathogens that causes superficial as well as severe systemic infections, which are difficult to treat without affecting the host organism, is the opportunistic fungal pathogen Candida albicans. Due to an increase of resistances of Candida species towards antifungal drugs only a limited repertoire of drugs is available for systemic therapy. The goal of the present work was the synthesis of series of peptide inhibitors containing electrophilic building blocks as potential irreversible inhibitors of the secreted aspartic proteases (SAPs) of Candida albicans. The synthesized compounds should be tested against SAP2, which is the mostly expressed SAP-isoenzyme, and other proteases. This work should elucidate whether cis-configured epoxides can be used to irreversibly block other aspartic proteases than the HIV-1-protease and whether other small electrophilic building blocks like aziridines and electron poor Michael acceptor systems can react as irreversible inhibitors of aspartic proteases as well. Additionally, the role of the configuration of the Michael systems (Z / E) for inhibition potency should be investigated. The aziridine-2-carboxylates were obtained as racemates by Cromwell synthesis and the aziridine-2,3-dicarboxylates were synthesized stereoselectively by a chiral pool synthesis starting from tartrates. The oxirane-2-carboxylates were synthesized enantioselectively starting from threonine or were obtained as racemates by Darzens glycide ester synthesis. The oxirane-2,3-dicarboxylates were obtained by Weitz-Schäffer epoxidation of maleates with tertbutylhydroperoxide / butyllithium. The Z-configured olefinic building blocks were synthesized by reactions of alcohols or amino acids with maleinic anhydride or by Wittig and Horner-Wadsworth-Emmons reactions. The electrophilic building blocks obtained by these pathways were coupled with amino acids and peptides using known methods of peptide chemistry. The compounds which were designed as irreversible aspartic protease inhibitors were tested for SAP2 inhibition using a newly-developed FRET assay. The inhibition constants (IC50-, k2nd-, ki- and Ki-values) were determined in dilution assays measuring the increase of fluorescence at 540 nm. The undecapeptide Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe / Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH (/ designates the cleavage site) was used as substrate. Within the series of 41 synthesized compounds the aziridines A-07 and A-08 exhibiting k2nd-values of about 50000 M-1min-1 were found to be the most active inhibitors. With the exception of two compounds all inhibitors showed time-dependent inhibition indicating irreversible inactivation of the target enzyme. In order to elucidate the selectivity the compounds were tested against the cysteine proteases cathepsin B (human), cathepsin L (Paramecium tetraurelia) und rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense) using a continuous fluorometric microplate assay. In all cases, the substrate Cbz-Phe-Arg-AMC was used. With the exception of the E-configured olefin E-Ol-04 all compounds were found to be inactive against cysteine proteases. In summary, the results prove that besides the HIV-proteases other aspartic proteases like SAP2 can also be inhibited irreversibly by cis-configured epoxides. Furthermore, it is shown that cis-configured aziridines can also be used as building blocks for irreversible inhibitors of aspartic proteases, being even more active against SAP2 than corresponding epoxides. Electron poor Michael acceptor systems can also be used, but they are obviously weaker than the three-membered heterocycles. The results obtained with the olefins show that the E-configured compounds are superior to Z-configured ones. In collaboration with the group of Prof. Dr. Joachim Morschhäuser and Dr. Peter Staib (Department of Molecular Infection Biology, University of Würzburg) it was proven that the aziridines A-07 and A-08, which are the most active inhibitors of the target enzyme, also inhibit SAP2 in Candida albicans cell cultures leading to growth inhibition without being cytotoxic against the fungi. These aziridines (A-07 and A-08) display antiplasmodial activity as well. Tests against the malaria parasite Plasmodium falciparum revealed for both aziridines IC50-values in the low micromolar range. The reasons for the antiplasmodial activity are uncertain at the moment: A-07 and A-08 are only weakly active against the plasmodial cysteine proteases falcipain 2 and falcipain 3 and, furthermore, they do not inhibit the parasitic aspartic protease plasmepsin II.

Techn. University, Diss., 2006--München.

Candida albicans gehört zu den für den Menschen fakultativ pathogenen Hefepilzen. Der normalerweise harmlose Begleiter der humanen Mikroflora findet sich hauptsächlich auf Schleimhäuten der Mundhöhle und des Magen-Darm-Trakt sowie in der vaginalen Flora. Menschen, deren Immunsystem geschwächt ist, sind jedoch besonders anfällig für Infektionen, die durch den Pilz hervorgerufen werden können. Neben oberflächlichen kann es dabei auch zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen kommen, die nicht selten zum Tod des Patienten führen. Durch ein zunehmendes Auftreten von Resistenzen gegen gebräuchliche Pharmaka besteht aktuell ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen gegen Candida. Die zehn vom Hefepilz exprimierten sekretorischen Aspartatproteasen (SAP1-10), die als wichtige Virulenzfaktoren gelten, stellten sich dabei zunehmend als vielversprechende Targets heraus. Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der literaturbekannten cis-konfigurierten 3-Phenylaziridin-2-carboxylate A-07 und A-08 als irreversible Inhibitoren der SAP-Isoenzyme. Die Variation der Substituenten am Aziridinstickstoff für die Adressierung der S3-Tasche im Enzym erfolgte durch Alkyl-, Aryl- und Acylreste. Die Aminosäureester wurden in Konfiguration und Art der Seitenkette modifiziert, um eine Verbesserung der Anpassung an die S1‘-Tasche zu ermöglichen. Die cis-3-Phenylaziridin-2-carboxylate wurden durch Cromwell-Synthese als Racemate erhalten. Aminosäure- und Peptidkupplungen erfolgten mit gängigen Kupplungsreagenzien (PPA, DPPA). Die stereoselektive Synthese des methylenverbrückten Aziridin-2-carboxylats A-10 erfolgte durch Redoxkondensation nach Mukaiyama. Die synthetisierten Verbindungen wurden in einem fluorimetrischen FRET-Assay auf ihre inhibitorische Wirkung gegen SAP2 getestet. Dabei war das im FRET-Assay bislang an SAP2 verwendete Substrat Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH auch für Testungen an SAP1, 3 & 8 sowie Cathepsin D geeignet. Neben den jeweiligen Km-Werten konnten für diese Enzyme auch die zugehörigen kcat-Werte bestimmt werden. Zur Bestimmung der Hemmkonstanten wurde für die aktiven Verbindungen ein Verdünnungsassay nach Kitz und Wilson durchgeführt. 20 der 46 Aziridin-2-carboxylate erreichten SAP2 k2nd-Werte von mindestens 7880 M-1min-1. Die mit k2nd-Werten von 60608 bis 118582 M-1min-1 potentesten Verbindungen wurden durch (R)-Aminosäuresubstitution (A-28, A-31) bzw. durch Cyclohexylmethyl-Verknüpfung am Aziridinstickstoff (A-43, A-45) erhalten. Für die einzelnen Diastereomere von A-31, A-31a und A-31b, wurde eine signifikant unterschiedliche Hemmwirkung festgestellt. Die Inhibitoren zeigten eine zeitabhängige Hemmung, die nach ca. 30 min Inkubationszeit jedoch wieder schwächer wurde. LC-MS- und NMR-Studien lassen einen pseudo-irreversiblen Hemmmechanismus vermuten: Der Inhibitor bindet zunächst irreversibel unter Ringöffnung des Aziridins an das Enzym. Der entstehende Ester wird danach unter den sauren Assaybedingungen wieder hydrolysiert. Der resultierende Aminoalkohol bindet anschließend als Übergangszustandsanalogon reversibel an das Enzym. Selektivitätsstudien an Cathepsin D zeigten für 36 der 46 Aziridin-2-carboxylate k2nd-Werte von 10350 bis 936544 M-1min-1. Damit sind die Verbindungen an CathD aktiver als an SAP2. Die 1-Cyclohexylmethyl-verknüpften Aziridine wiesen auch an CathD die höchsten k2nd-Werte auf, wenngleich sich dabei die (R)-Konfiguration der Aminosäurereste (A-57, A-59) als die aktivere Variante herausstellte. Mit dem (R)-Phe-substituierten 1-tert-Butylaziridin A-58 erreichte der potenteste Vertreter der Reihe bereits einen Ki-Wert im dreistelligen nano-molaren Bereich. Ebenso wurden für die (R)-Aminosäure-Analoga von A-07 und A-08 (A-28, A-31) erhöhte Hemmkonstanten erhalten. Wie SAP2 wird auch CathD durch die (an)getrennten Diastereomere A-31a und A-31b signifikant unterschiedlich stark inhibiert. Mit den (R)-Valin-verknüpften Aziridinen A-81, A-82 und A-85 fanden sich aktive verzweigt-Alkyl-substituierte CathD-Inhibitoren. / Candida albicans is one of the most common fungal pathogens of human beings. Usually, Candida species reside as commensal organisms as part of the normal microflora, predomi-nantly colonizing the mucosal surfaces of the oral cavity, the gastrointestinal tract or the va-ginal flora. However, notably in immunosuppressed individuals, C. albicans can evolve into an opportunistic pathogen, causing superficial as well as life-threatening systemic infections with high mortality. Increasing resistances to current drug therapies demand research for new antifungal phar-maceuticals. The secreted aspartic proteases (SAP1-10), encoded by ten different sap genes, were discovered as key virulence factors and hence are considered to be potential targets for new antimycotic drugs. The goal of the present work was the improvement of the known cis-configured 3 phenyl-aziridine-2-carboxylates A-07 und A-08 as irreversible inhibitors of the SAP isoenzymes. In order to address their S3 pocket, the substituent at the aziridine-nitrogen was modified (alkyl, aryl and acyl residues). Furthermore, various amino acid esters (D, L) were included in order to improve their fit into the S1’ pocket. The cis-3-phenylaziridine-2-carboxylates were obtained as racemates via Cromwell synthesis. Amino acid and peptide coupling reactions were performed with common coupling reagents (PPA, DPPA). The stereoselective synthesis of the methylene-bridged aziridine-2-carboxylate A-10 was achieved via redox condensation according to Mukaiyama. The synthesized compounds were tested for inhibition of SAP2 by using a fluorometric FRET assay using Dabcyl-Arg-Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Glu(EDANS)-ArgOH as sub-strate. This substrate, designed for SAP2, was found to be also suitable for assays with SAP1, 3 & 8 and Cathepsin D. Additionally, the corresponding Km- and kcat values were determined. For the determination of the inhibition constants of the active compounds a dilution assay according to Kitz and Wilson was performed. 20 of the 46 aziridine-2-carboxylates yielded k2nd values of at least 7880 M-1min-1 against SAP2. With k2nd values between 60608 and 118582 M-1min-1, the most potent compounds were achieved with (R)-amino acids (A-28, A-31) and by cyclohexylmethyl substitution of the aziridine-nitrogen (A-43, A-45). Significantly different inhibition potencies were found for the single diastereomers of A-31, A-31a and A-31b. The inhibitors showed a time-dependent inhibition that decreased after 30 min incubation time. LC-MS and NMR studies suppose a pseudo-irreversible mechanism of inhibition: First, the inhibitor irreversibly binds to the enzyme under ring opening of the aziridine. Then the generated ester is hydrolyzed under the acidic assay conditions. The resulting amino alcohol subsequently could bind as a transition-state mimetic inhibitor to the enzyme. In selectivity studies on CathD 36 of the 46 aziridine-2-carboxylates showed k2nd values be-tween 10350 and 936544 M-1min-1. Thus, the compounds show higher activity against CathD than against SAP2. Again, the 1-cyclohexylmethyl-substituted aziridines show the highest k2nd values. However, in these cases the compounds with (R)-configured amino acid residues are the more active ones (A-57, A-59). With the (R)-Phe-substituted 1-tert-butylaziridine A-58, the most active compound reached a Ki value in the nanomolar region. Similarly to the results obtained for SAP2, the (R)-amino acid analogues to A-07 und A-08 (A-28, A-31) show higher inhibition constants. Again, the separated diastereomers A-31a and A-31b display significantly different inhibition potencies. With the (R) valin linked aziridines A-81, A-82 and A-85 a highly active group of alkyl-substituted inhibitors with branched side-chains was found.