Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial. / Besides the emergency of more active and less toxic antifungal agents and the conventional use of antifungal prophylaxis, invasive mold infections have still high mortality rates, especially, invasive aspergillosis (IA). This life-threatening disease is a predominant fungal opportunistic infection for patients with long-term neutropenia, mostly HSCT recipients. Aspergillus fumigatus is the most important species causing IA and is already known as an angioinvasive fungal pathogen. Upon filamentation this fungus can damage and activate human vein endothelial cells (HUVEC) which in turn switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is known to be mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. The aim of this study was to investigate the endothelial activation ability of several mutants of A. fumigatus. Briefly, HUVECs were infected with germ tubes and conidia of A. fumigatus wild type (WT) Af293 and Ku80 and mutant (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) strains and a differential quantitative fluorescence assay performed to determine adhesion and internalization rates. Thus, a kinetic study of secreted pro-inflammatory cytokines and chemokines in HUVEC conditioned medium was achieved by a multiplex immuneassay. The cytokine production was assayed at three time points (4, 8 and 16 hours) using dead germ tubes, and at one time point (16 hours) using dead conidia, for an E:T ratio of 2:1. Additionally, to investigate endothelial activated phenotype, the expression of tissue factor was performed by a real time RT-PCR assay. The ugm1 mutant, which lacks the ugm1 gene encoding UDP-galactopyranose mutase, an enzyme responsible for the conversion of galactopyranose in galactofuranose, showed a hiperadherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation. This mutant stimulated at least a 10-fold and 2.5-fold increase of TNF-alfa and IL-6 secretion, respectively and 2-fold increase of tissue factor expression by host cells, as compared to WT strains. Galactofuranose is an uncommon 5-membered ring form of galactose and a very important component of glycostructures of the A. fumigatus cell wall. The lack of this monosaccharide in the fungal cell wall leads to a compensatory mechanism characterized by an increment in the galactosaminogalactan expression. In contrast, the calA and crzA mutants, with upstream and downstream dysfunction in the calcium/calcineurin pathway, with alteration in the cell wall β-1,3-glucan content, showed a decrease capacity to adhere to HUVECs and did not induce both the secretion of pró-inflammatory cytokine and activation on endothelial cells. Furthermore, the mutant ΔprtT, witch lacks the transcriptional factor (prtT) that regulates the secretion of multiple proteases, showed the same adhesion and endothelial cell activation phenotype as observed for WT strains. As indicated in previous investigations, our data showed that conidia of A. fumigatus werent able to cause the same endothelial cell cytokine stimulation observed for germ tubes, and that endothelial cell activation is independent on fungal cell viability. Finally, its possible to conclude that the polymers of galactose in the cell wall of A. fumigatus, especially the galactosaminogalactan molecule, seem to be responsible for the endothelial cell interaction mechanisms and activation.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial. / Besides the emergency of more active and less toxic antifungal agents and the conventional use of antifungal prophylaxis, invasive mold infections have still high mortality rates, especially, invasive aspergillosis (IA). This life-threatening disease is a predominant fungal opportunistic infection for patients with long-term neutropenia, mostly HSCT recipients. Aspergillus fumigatus is the most important species causing IA and is already known as an angioinvasive fungal pathogen. Upon filamentation this fungus can damage and activate human vein endothelial cells (HUVEC) which in turn switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is known to be mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. The aim of this study was to investigate the endothelial activation ability of several mutants of A. fumigatus. Briefly, HUVECs were infected with germ tubes and conidia of A. fumigatus wild type (WT) Af293 and Ku80 and mutant (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) strains and a differential quantitative fluorescence assay performed to determine adhesion and internalization rates. Thus, a kinetic study of secreted pro-inflammatory cytokines and chemokines in HUVEC conditioned medium was achieved by a multiplex immuneassay. The cytokine production was assayed at three time points (4, 8 and 16 hours) using dead germ tubes, and at one time point (16 hours) using dead conidia, for an E:T ratio of 2:1. Additionally, to investigate endothelial activated phenotype, the expression of tissue factor was performed by a real time RT-PCR assay. The ugm1 mutant, which lacks the ugm1 gene encoding UDP-galactopyranose mutase, an enzyme responsible for the conversion of galactopyranose in galactofuranose, showed a hiperadherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation. This mutant stimulated at least a 10-fold and 2.5-fold increase of TNF-alfa and IL-6 secretion, respectively and 2-fold increase of tissue factor expression by host cells, as compared to WT strains. Galactofuranose is an uncommon 5-membered ring form of galactose and a very important component of glycostructures of the A. fumigatus cell wall. The lack of this monosaccharide in the fungal cell wall leads to a compensatory mechanism characterized by an increment in the galactosaminogalactan expression. In contrast, the calA and crzA mutants, with upstream and downstream dysfunction in the calcium/calcineurin pathway, with alteration in the cell wall β-1,3-glucan content, showed a decrease capacity to adhere to HUVECs and did not induce both the secretion of pró-inflammatory cytokine and activation on endothelial cells. Furthermore, the mutant ΔprtT, witch lacks the transcriptional factor (prtT) that regulates the secretion of multiple proteases, showed the same adhesion and endothelial cell activation phenotype as observed for WT strains. As indicated in previous investigations, our data showed that conidia of A. fumigatus werent able to cause the same endothelial cell cytokine stimulation observed for germ tubes, and that endothelial cell activation is independent on fungal cell viability. Finally, its possible to conclude that the polymers of galactose in the cell wall of A. fumigatus, especially the galactosaminogalactan molecule, seem to be responsible for the endothelial cell interaction mechanisms and activation.