RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. / RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.

This work investigated the subcellular dynamics of the plant elicitor peptide AtPep1 and its interplay with plant defense responses. First, an introduction of the plant innate immunity system is provided with emphasis on pattern trigger immunity (PTI), which is based on the recognition of \"non-self\" and \"self\" elicitor molecules by surface-localized patternrecognition receptors (PRRs). Then, the Arabidopsis endogenous peptides that act as selfelicitor molecules are presented, with details on AtPep1 and its PEPR receptors. Plant endomembrane trafficking is described, encompassing endocytic pathways, clathrin mediated endocytosis (CME) and receptor-mediated endocytosis (RME). In the next chapter, we explored strategies for the in vivo study of the subcellular behavior of AtPep1; to this end, we fused the precursor protein of AtPep1 (PROPEP1) to GFP and assessed its localization. We found that PROPEP1 was associated with the tonoplast and accumulated in the vacuole, suggesting that this organelle could work as the station where PROPEP1 is stored and later released, only in a danger situation, hence initiating AtPep1. Moreover, we generated AtPep1 versions labeled with fluorescent dyes and demonstrated that this peptide could be fluorescently tagged without loss of its biological activity. In chapter 3, we combined classical and chemical genetics with life imaging to study the behavior of a bioactive fluorescently labeled AtPep1 in the Arabidopsis root meristem. We discovered that the labeled AtPep1 was able to bind the plasma membrane very quickly in a receptor-dependent manner. Subsequently, the PEPR-AtPep1 complex was internalized via CME and transported to the lytic vacuole, passing through early and late endosomal compartments. Impairment of CME compromised the AtPep1 responses. Our findings provide for the first time an in vivo visualization of a signaling peptide in plant cells, thus giving insights into its intracellular fate and dynamics. The role of the coregulatory receptor BRI1-associated kinase 1 (BAK1) in AtPep1-responses was also investigated (chapter 4). Our results confirmed that BAK1 interacts with PEPRs in a ligand-dependent manner and indicate that BAK1 modulates AtPep1 signaling and endocytosis, but that, when absent, it might be replaced by homologous SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (SERK) proteins that could have additional functions during the AtPep1 signaling. Furthermore, phosphorylation events after the formation of PEPR-BAK1 complexes seem to dictate the molecular bases of AtPep1 internalization and signaling. Finally, we discussed our findings in a more general perspective, highlighting the important findings for the plant endomembrane trafficking field, the potential use of fluorescently labeled ligands as a tool to study ligand-receptors pairs, the availability of AtPep1-PEPRs as an excellent model to study endocytosis and its interplay with signaling, and the future challenges in the field. / Neste trabalho, foi investigada a dinâmica subcelular do peptídeo elicitor de planta AtPep1 e suas implicações nas respostas de defesa. Primeiramente, é fornecida uma introdução do sistema imune inato de plantas com ênfase na imunidade ativada por moléculas elicitoras derivadas de organismos invasores ou da mesma planta, após seu reconhecimento por receptores localizados na membrana plasmática (PTI responses). Peptídeos endógenos que têm sido reportados em Arabidopsis como ativadores de PTI são descritos, dando especial destaque para o peptídeo AtPep1 e seus receptores PEPRs. O tráfego de endomembranas em plantas é introduzido, abrangendo as vias de internalização, endocitose mediada por proteínas clathrinas (CME) e endocitose mediada por receptor (RME). No capítulo seguinte, foram avaliadas estratégias para o estudo in vivo da dinâmica subcelular do AtPep1. Para isso a proteína precursora do AtPep1 (PROPEP1) foi fusionada a GFP e sua localização visualizada, encontrando que PROPEP1 é associado com o tonoplasto e acumula dentro do vacúolo, fato que sugere uma função de armazenamento do PROPEP1 para esta organela, desde onde é liberado em caso de uma situação de perigo dando origem ao AtPep1. Adicionalmente, foram produzidas versões biologicamente ativas do AtPep1 marcado com fluróforos. No capítulo três foram combinados genética clássica e genética química com visualizações in vivo para estudar o comportamento de um AtPep1 bioativo e marcado fluorescentemente na células meristemática da ponta da raiz de Arabidopsis, sendo encontrado que AtPep1 se liga rapidamente na membrana plasmática numa forma dependente de receptor. Em seguida, o complexo AtPep1-PEPR foi internalizado via CME e transportado para o vacúolo, passando através do endossomo primário e secundário. Quando o funcionamento da CME foi comprometido, as respostas ao AtPep1 também foram afetadas. Estes resultados fornecem a primeira visualização in vivo de um peptídeo de sinalização em plantas, mostrando sua dinâmica e destino intracelular. O papel regulatório durante as respostas induzidas pelo AtPep1 do co-receptor BRI1-associated kinase 1 (BAK1) foram investigadas (Capítulo quatro). Nossos resultados confirmaram que BAK1 interage com PEPRs numa forma dependente do ligante e indicam que BAK1 modula sinalização e endocitose do AtPep1, no entanto quando ausente, BAK1 pode ser substituído por seus homólogos SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE os quais poderiam ter funções adicionais durante as repostas induzidas pelo AtPep1. Eventos de fosforilação após a formação do complexo PEPR-BAK1 parecem ditar as bases moleculares da internalização e sinalização do AtPep1. Finalmente, são discutidos os resultados encontrados nesta pesquisa numa perspectiva geral, destacando a relevância destas descobertas na área de pesquisa em que estão inseridos, o potencial que representa o uso de ligantes marcados fluorescentemente como ferramenta para o estudo de complexos entre ligante-receptor, a disponibilidade do sistema AtPep1-PEPRs como modelo de estudo da endocitose em plantas e sua relação com sinalização, e os futuros desafios na área.

RALFs são peptídeos hormonais de aproximadamente 5kD que regulam negativamente o alongamento celular. Dentre suas atividades biológicas, a alcalinização do meio extracelular e a inibição do alongamento celular são tidas como associadas, pois a acidificação do meio extracelular é necessária para a expansão celular. A atividade de alcalinização e a de inibição do crescimento são medidas em dois ensaios distintos: o ensaio de alcalinização do meio extracelular de células em suspensão e o ensaio do crescimento de raiz primária de plantas jovens. Buscando-se fazer ambas as avaliações da inibição da expansão celular e da alcalinização em um único modelo de estudo, tomou-se como medida da expansão celular o volume das células decantadas (VCD). Quando o tampão MES ou o pré-tratamento com \"Fusicoccin\" foi utilizado para se atenuar o efeito de alcalinização do AtRALF1, verificou-se que o efeito de inibição do alongamento celular não sofreu alteração. Em arabidopsis são encontrados nove peptídeos RALF, que apresentam alta similaridade com o RALF original de tabaco. Com exceção do AtRALF4, todos são capazes de alcalinizar o meio extracelular e inibir raízes. A comparação da estrutura primária do AtRALF4 com os demais RALFs mostra que poucos resíduos são distintos entre eles, sugerindo que estes possam ser os determinantes das atividades de inibição e alcalinização. A alteração de um destes resíduos, AtRALF4(N92A), é capaz de restaurar a capacidade do AtRALF4 de inibir as raízes sem, no entanto, recuperar a atividade de alcalinização. Quando três outros resíduos exclusivos do AtRALF4 foram substituídos pelos seus correspondentes do AtRALF1, observa-se uma restauração parcial da alcalinização, desta vez, sem alterar a capacidade de inibir as raízes. Recentemente, foi mostrado pelo nosso grupo que o peptídeo AtRALF1 induz a expressão de genes relacionados ao rearranjo da parede celular. Quando verificado por PCR quantitativa, contatou-se que somente os peptídeos mutantes que apresentam atividade de inibição do crescimento são capazes de promover uma indução semelhante. Ainda, utilizando gel indicador de pH, verificou-se que plantas transgênicas super-expressando AtRALF1 (35S:AtRALF1) acidificam o meio durante seu crescimento de maneira semelhante a plantas selvagens. O peptídeo de defesa AtPEP1, a exemplo dos peptídeos RALF, também promove a alcalinização do meio extracelular. A utilização de drogas para reproduzir ou atenuar o efeito de alcalinização promovido por este peptídeo sugere que a expressão dos genes responsivos a AtPEP1 também não está relacionada à alteração na atividade das próton-ATPases. Finalmente, quando mutantes para ambos os receptores de AtPEPs foram utilizados (atpepr1/r2) em gel indicador de pH, verificou-se que estes alcalinizam o pH da rizosfera na presença do peptídeo. Nossos dados somados sugerem uma dissociação das atividades biológicas de alcalinização do meio extracelular e de inibição da expansão celular. A alteração na atividade das próton-ATPases pode não ser apenas uma mensagem secundária do efeito biológico, mas sim outra fonte de informação independente e ainda pouco explorada como tal. / RALFs are 5kD peptide hormones that negatively regulates cell expansion. Among the biological activities of the RALF peptide, the extracellular alkalinization and cellular expansion inhibition were previously suggested to be associated, once the extracellular acidification is required to cell expansion. Usually, the alkalinization and cell expansion inhibition activities are evaluated in two different assays, the cell suspension medium alkalinization and the plantlet root growth inhibition. We manage to set an assay in which both cell expansion inhibition and extracellular alkalinization activities could be evaluated. Using the package suspension cell volume through decantation as a value of cell expansion, we evaluated the relation between alkalinization and cell expansion inhibition in different conditions. When the MES buffer or the pre-treatment with Fusicoccin was used to arrest the AtRALF1 extracellular alkalinization, the package cell volume inhibition activity was not affected. There are 9 RALF peptides encoded in arabidopsis plants that are closely related with the first isoform isolated from tobacco. With exception of the AtRALF4, all those isoforms are able to alkalinize the extracellular medium and arrest root growth. Comparing the AtRALF4 with other eight isoforms, we verified that are few different amino acids between them, suggesting that those amino acids could be essential for the biological activities. The rescue of one of those amino acids, AtRALF4(N92A), was able to regain the root growth inhibition activity of the AtRALF4 peptide, although the extracellular alkalinization activity was not restored. When three other AtRALF4 amino acids were substituted by their AtRALF1 correspondent, there is a partial rescue of the extracellular alkalinization activity, but no alterations in the root growth inhibition. We had recently shown that the AtRALF1 peptide induces the expression of genes related to cell wall rearrangement. The quantitative PCR analyses demonstrates that only the mutant peptides that are able to arrest root growth are also able to induce the gene expression. When submitted to a pH indicator, it was verified that AtRALF1 overexpressing plants acidifies it during its growth, as much as wild type plants.The defense peptide AtPEP1, similarly of AtRALF1, also triggers extracellular alkalinization. The use of proton-pump chemical modulators to simulate or arrests AtPEP1 extracellular alkalinization activity suggests that the gene expression of the AtPEP1-responsive genes is not related to changes in plasma membrane proton pump activity. Finally, when double mutants for both the AtPEP1 receptors (atpepr1/r2) were submitted to a pH gel indicator, it was seen that they alkalinize the rhizosphere pH in the presence of the AtPEP1 peptide. Our data suggests that the extracellular alkalinization and arrest of cell expansion activities are dissociated. The proton pump modulation activity may not be only a secondary messenger, but another source of information independent and yet to be explored.