Ulm, Univ. Diss., 2006.

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Bei der Atherosklerose handelt es sich um eine chronische inflammatorische Erkrankung, die sich an der arteriellen Gefäßinnenwand abspielt. Ihre Haupt-Manifestationsformen Schlaganfall und Herzinfarkt zählen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Eine chronische Endothelbelastung und -funktionsstörung, beeinflusst durch Risikofaktoren wie Diabetes, arterieller Bluthochdruck, Rauchen und Entzündungszustände, führen zur Permeabilitätserhöhung des Endothels, zur Zelleinwanderung, subendothelialen Lipidanreicherung, Migration glatter Muskelzellen und der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen. Es kommt zu Aktivierung des Immunsystems und fortschreitender Entzündungsreaktion, schließlich zur Ausbildung eines nekrotischen Kerns und zunehmender Vulnerabilität des Plaques. Epigenetische Veränderungen betreffen klassischerweise das Chromatingerüst. Durch DNA-Methylierung und -Demethylierung sowie verschiedene Modifikationen der Histon-Proteine kann die DNA in ihrer Zugänglichkeit verändert werden. So kann die Transkription eines bestimmten Genes direkt und potenziell längerfristig beeinflusst werden, ohne dass Alterationen der DNA-Basenfolge selbst stattfinden. Das Enzym SET7 nimmt hierbei eine Sonderrolle ein, da es neben einer Methylierung von Histon 3 auch verschiedene zelluläre Zielstrukturen posttranslational direkt methylieren kann. Epigenetische Veränderungen im Kontext der Atherosklerose sind bereits vereinzelt beschrieben. Auch sind sie relevant in der Reaktion auf Umwelteinflüsse und bei inflammatorischen Vorgängen. Der Frage, ob epigenetische Mechanismen im atherosklerotischen Geschehen eine Rolle spielen, sollte in dieser Arbeit nachgegangen werden. Dazu wurde in Zellkulturversuchen für Makrophagen und glatte Muskelzellen geprüft, ob die einzelnen pro-atherosklerotischen Stimuli oxLDL, IL-1β, TNFα und LPS bereits zu relevanten Veränderungen epigenetischer Enzyme führen. Dies erfolgte über Vergleich der entsprechenden mRNA mittels qPCR. Zur Untersuchung der genaueren Dynamik wurde für die Enzyme SET7 und DNMT1 der zeitliche Ablauf dieser Reaktion auf TNFα-Stimulation in Makrophagen genauer betrachtet. Unter gleichen Versuchsbedingungen wurde außerdem die Änderung der mRNA-Expression einiger Matrixmetalloproteasen, TIMP-Enzyme, Zytokine und Transkriptionsfaktoren analysiert,um zukünftig kausale Zusammenhänge weiter aufdecken zu können. Auch die Frage nach Veränderungen epigenetischer Enzyme in der Ldlr-/--Maus nach fettreicher Diät im Vergleich zu Ldlr-/--Mäusen ohne Diät sollte hier beantwortet werden. Dazu wurde die mRNA der Zellsuspensionen aus Milz, Aortenwurzel und gesamter Aorta der Tiere mithilfe der qPCR verglichen. Schließlich sollte ein effizienter Weg für einen individuellen und flexiblen SET7 knock-out etabliert werden, um weitere Studien dieses Enzyms zu ermöglichen. Hierzu wurde die Methode des CRISPR/Cas9 Systems gewählt und abschließend die Funktionalität des Systems überprüft. / Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease which occurs at the inner layer of the artery wall. Its two main manifestations are stroke and myocardial infarction, which are two of the most common causes of death worldwide. Chronical endothelial stress and endothelial dysfunction, affected by different risk factors such as hypertension, diabetes mellitus, smoking, and an inflammatory state, lead to an increased permeability, cell accumulation, subendothelial lipid accumulation and migration of smooth muscle cells, causing immune system activation, a subsequent inflammatory reaction, and the formation of atherosclerotic lesions. Finally, the development of a necrotic core occurs, accompanied by a progressive plaque vulnerability. Epigenetic mechanisms affect the chromatin structure. Therefore, the accessibility of the DNA can be altered by DNA methylation, -demethylation and different modifications of histone proteins. This can directly affect the transcription of a certain gene in a potentially long-lasting way without altering the DNA base sequence itself. The enzyme SET7 is noteworthy because of its ability of direct methylation of different cellular targets in addition to its function as a histone 3 methyltransferase. Some epigenetic alterations in the context of atherosclerosis have already been described. Epigenetic changes also play a role in the reaction to environmental signals and in processes caused by inflammation. The aim of this study was to clarify whether epigenetic mechanisms play a role in atherosclerosis. Therefore, epigenetic alterations in macrophages and smooth muscle cells after pro-atherosclerotic stimulation with oxLDL, IL-1β, TNFα and LPS were tested in cell culture experiments and their mRNA expression was compared via qPCR. Regarding the dynamics, the temporal SET7 and DNMT1 expression after stimulation was investigated for macrophages in detail. Furthermore, changes of mRNA expression for certain matrix-metalloproteases, TIMP-enzymes, cytokines, and transcription factors could be detected under constant experimental conditions. By this, the detection of causal dependencies between individual changes could be facilitated in the future. To answer the question of relevant changes in epigenetic enzyme expression in Ldlr-/--mice after high-fat diet compared to mice without any diet, mRNA expression of cell suspension gained from the mice spleen, aortic sinus and total aorta were compared by using qPCR. Finally, an efficient way of knocking down SET7 was established by the usage of the CRISPR/Cas9 method, and functionality of this approach was demonstrated in this study.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009