Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Moringa oleifera é uma planta tropical com grande importância econômica e de usos industriais e medicinais. Diferentes partes da planta são aplicadas e o extrato de sementes é comumente usado na purificação de água para consumo humano. Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não-imune que se ligam bioespecificamente a carboidratos, com capacidade de aglutinar células de forma reversível; extração e purificação dessas biomoléculas permite sua aplicação no âmbito biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade hemaglutinante (AH) em extratos de diferentes tecidos de M. oleifera, purificar e caracterizar uma lectina de sementes com propriedades coagulantes (cMoL). AH foi detectada em extratos salinos (NaCl 0,15 M) de flores e raques da inflorescência (5 %, p/v), sementes, folhas e tecido fundamental do tronco e casca do tronco (10 %, p/v). cMoL isolada após extração salina e cromatografia em gel de guar foi ativa na faixa de pH de 4 a 9, termoestável a 100 ºC durante 7 h e aglutinou eritrócitos de coelho e humanos. AH dos extratos dos tecidos e de cMoL foi inibida por carboidratos; azocaseína e asialofetuína aboliram a AH de cMoL. Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras revelou uma banda polipeptídica principal de 26.5 kDa; cMoL nativa é uma proteína básica e foi purificada como uma única banda. A verificação da propriedade coagulante foi realizada utilizando-se uma suspensão de caolin em água (10 g/L) e leitura espectrofotométrica de absorbância a 500 nm. Preparações de sementes e cMoL apresentaram atividade coagulante similar ao sulfato de alumínio, o coagulante sintético mais utilizado no tratamento da água em todo o mundo; após o aquecimento de cMoL não foram observadas diferenças significativas na coagulação. Em conclusão, lectinas estão presentes em diferentes tecidos de M. oleifera; preparações lectínicas de sementes e cMoL podem ser aplicadas no tratamento de água para consumo humano

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-14T14:01:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação KÉZIA MOURA.pdf: 1645406 bytes, checksum: 228e191c7a4f30a67acd5d55cee26e2b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação KÉZIA MOURA.pdf: 1645406 bytes, checksum: 228e191c7a4f30a67acd5d55cee26e2b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq;FACEPE / Lectinas são proteínas ligadoras de carboidratos e com atividade hemaglutinante (AH). Sementes de Moringa oleifera são utilizadas no tratamento de água e contêm uma lectina solúvel em água (WSMoL) com atividade coagulante. O objetivo deste trabalho foi avaliar a cinética de coagulação promovida por WSMoL através de medidas de absorbância (densidade óptica) e variação de resistência elétrica na interface eletrodo-solução, na ausência e presença de carboidratos e íons. Extrato aquoso (10%, p/v) de sementes foi fracionado com sulfato de amônio (60% de saturação) e o precipitado foi aplicado em coluna de quitina equilibrada com NaCl 0,15 M. WSMoL foi eluída com ácido acético 1,0 M e caracterizada quanto à massa molecular nativa, perfil em SDS-PAGE e ponto isoelétrico (PI). A atividade coagulante foi determinada empregando-se modelo de água turva com caolin a 1% em água de torneira. A AH e atividade coagulante de WSMoL foram também avaliadas na presença de Nacetilglicosamina, glicose e frutose em diferentes concentrações (25, 50, 100, 200 mM) e soluções de sais de cálcio e magnésio (20 mM). WSMoL nativa apresentou massa molecular 59,4 kDa. Em SDS-PAGE, foram observados três peptídeos com aproximadamente 30, 20 e 10 kDa. O PI determinado para WSMoL nativa foi de 5,5. A AH de WSMoL foi inibida por todos os carboidratos nas concentrações testadas (exceto frutose a 25 mM) e estimulada pelos íons cálcio e magnésio. A atividade coagulante de WSMoL foi demonstrada por redução da absorbância da solução de caolin e redução da resistência elétrica do meio aquoso em presença da lectina. A incubação da lectina com carboidratos nas concentrações que inibiram a AH ou com íons cálcio e magnésio promoveu a redução da atividade coagulante de WSMoL, demonstrada pela baixa eficiência na redução da absorbância e resistência elétrica do meio aquoso. A incubação com carboidratos na concentração de 200 mM aboliu a atividade coagulante da lectina. Em conclusão: 1) WSMoL nativa é uma proteína aniônica oligomérica; 2) a redução de absorbância e resistência elétrica promovida por WSMoL provavelmente envolve desestabilização de partículas em suspensão, seguida da formação de complexos entre WSMoL e as partículas; 3) a presença no meio aquoso de carboidratos inibidores da AH de WSMoL resulta em diminuição da atividade coagulante; e 4) cátions Ca2+ e Mg2+ estimularam a AH mas prejudicaram a atividade coagulante de WSMoL.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5264_1.pdf: 2886740 bytes, checksum: 56c736feadc9b36ed9bc882bab5177fe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Moringa oleifera é uma planta tropical com grande importância econômica e de usos industriais e medicinais. Diferentes partes da planta são aplicadas e o extrato de sementes é comumente usado na purificação de água para consumo humano. Ácidos húmicos constituem uma significante fração de matéria orgânica natural que ocorre em rios e constituem o maior problema nas estações de tratamento de água, porque reagem com o cloro formando subprodutos indesejáveis. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade hemaglutinante (AH) em tecidos de M. oleifera, purificar uma lectina de sementes solúvel em salina (SSMoL), avaliar a atividade coagulante de preparações lectínicas e SSMoL na água tratada com caolin e em solução de ácido húmico, caracterizar a afinidade de SSMoL com ácido húmico e investigar a atividade antioxidante em tecidos desta planta. A lectina foi isolada após extração da farinha em NaCl 0,15 M e cromatografia em gel de guar. Ensaios de AH foram realizados na presença de carboidratos, glicoproteínas, ácido húmico e compostos orgânicos halogenados. Experimentos de difusão com o ácido húmico e preparações lectínicas foram efetuados em gel de agarose. Atividade antioxidante foi investigada em extratos etanólicos (E1) e salinos (E2) de M. oleifera a partir de flores, raques da inflorescência e da folha, sementes, tecidos de folhas e tecido fundamental do tronco. A capacidade de capturar radical livre (RSC) de extratos e padrões antioxidantes foi determinada com dot-blots em placa de cromatografia em camada fina corada com solução do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) 0,4 mM. Ensaios espectrofotométricos foram realizados (515 nm); extratos foram analisados com vários reagentes para classe de compostos associados com atividade antioxidante. Atividade lectínica foi detectada em extratos salinos a partir de flores, raque da inflorescência, sementes, tecido de folha e tecido fundamental do tronco. SSMoL aglutinou eritrócitos de coelho e humanos e foi ativa na faixa de pH 4,0 a 9,0. Também, AH de extratos de tecidos e SSMoL foram inibidas por carboidratos e glicoproteínas; azocaseína e asialofetuína aboliram a AH de SSMoL. AH do extrato, fração e SSMoL diminuiu significantemente na presença do ácido húmico. Nenhum efeito foi observado na presença dos ácidos tricloroacético e dicloroacético ou clorofórmio. Bandas de precipitação foram observadas através de difusão em gel entre ácido húmico, preparações e SSMoL. A lectina básica foi termoestável a 100 °C durante 7horas. SDS-PAGE, em condições redutoras, revelou duas bandas. Preparações de sementes e SSMoL apresentaram atividade coagulante similar ao controle positivo, sulfato de alumínio. Componentes antioxidantes foram detectados em todos E1 e E2 de flores, raque da inflorescência e tecido de folha por redução do DPPH após 30 min. Extrato de folha mostrou melhor RSC; antioxidantes presentes em E2 reagiram mais lentamente com o radical DPPH. Flavonóides foram detectados em E1 e E2; esteróides e triterpenóides foram detectados em E1. O cromatograma revelado com solução metanólica difenilborinato-2- etilamina (p/v) mostrou que flores, raques da inflorescência e da folha, bem como tecido de folha de E1 continham pelo menos três flavonóides com os mesmos valores de Rf (0,18, 0,38 e 0,44, respectivamente). Flor e folha de E2 mostraram pelo menos dois flavonóides (Rf 0,35, 0,63 e 0,16, 0,34, respectivamente). Quando DPPH foi usado para revelar o cromatograma, a presença de componentes antioxidantes foi confirmada em todos os extratos. Em conclusão, extratos de tecidos distintos de M. oleifera mostraram AH. Uma lectina foi purificada usando um método simples, após definido o protocolo. Extrato, fração e SSMoL mostraram propriedades coagulantes na água tratada com caolin e em solução de ácido húmico. Resultados similares foram encontrados com o sulfato de alumínio, o mais comum coagulante sintético usado no tratamento da água em todo mundo. Contudo, preparações de sementes de M. oleifera e SSMoL podem ser aplicadas no tratamento da água para remover ácidos húmicos. Extratos etanólicos e salinos de tecidos de M. oleifera possuem componentes antioxidantes

O Fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da hemofilia B, o qual é baseado na administração de FIX derivado de plasma humano ou FIX recombinante. A terapia baseada nestas abordagens apresenta limitações como os altos custos e a baixa disponibilidade para a população de hemofílicos. O FIX é uma proteína complexa com grande variedade de modificações pós-traducionais e, por isso, apresenta baixa atividade específica e produtividade. A produção de um FIX recombinante com aumento na sua atividade coagulante pode contribuir para terapias de reposição e gênica mais eficazes nas quais quantidades menores das moléculas cataliticamente melhoradas serão necessárias para se obter os benefícios terapêuticos do FIX. Essa infusão diminuída poderá reduzir ou eliminar a geração de inibidores de FIX, minimizando os efeitos colaterais e reduzindo os custos do tratamento, sendo um dos desafios atuais no tratamento da hemofilia B. Nesse contexto, a engenharia genética tem se tornado uma ferramenta importante na modificação de proteínas de interesse farmacêutico visando a melhora das suas propriedades bioquímicas e biofísicas. Este trabalho teve como objetivo desenvolver novas variantes de FIX recombinante humano com aumento da sua atividade biológica. Para isso, fizemos um estudo detalhado da estrutura da proteína FIX e geramos três variantes FIX-YKALW, FIX-ALL e FIX-LLW, utilizando a técnica de mutagênese sítio dirigida. Essas variantes foram expressas em células humanas SK-Hep-1 tratadas com vitamina K e as proteínas foram caracterizadas in vitro e in vivo. A quantidade de FIX total secretada no sobrenadante celular foi similar entre as variantes FIX-YKALW e FIX-LLW (3,2 ?g/mL), enquanto FIX-ALL apresentou a menor expressão (1,8 ?g/mL), quantidades 2-3 vezes menores que de FIX controle (FIX-WT). Entretanto, a atividade biológica das variantes foi, em média, 6,2 vezes maior que FIX-WT, com atividade específica 11 vezes maior para FIX-YKALW e FIX-LLW e 24 vezes maior para FIX-ALL. FIX-YKALW apresentou a melhor geração de trombina in vitro dentre as variantes e destacou-se na avaliação da eficiência hemostática em camundongos hemofílicos B, na qual uma dose 5 vezes menor que a recomendada de FIX foi suficiente para promover uma resposta pró-coagulante. Neste trabalho foram desenvolvidas 3 novas variantes de FIX recombinante humano com maior atividade específica que o fator disponível no Sistema Único de Sáude. O FIX-ALL apresentou-se como a proteína mais potente in vitro descrita até o momento e FIX-YKALW como a mais promissora, dentre as mutantes desenvolvidas, na proteção hemostática in vivo. Estudos complementares são necessários para transpor a barreira da pesquisa para a utilização desses novos fatores de coagulação no tratamento da hemofilia B. Entretanto, esse trabalho apresenta novas proteínas com potencial de serem usadas na combinação com a terapia gênica bem como na terapia de reposição / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factor or recombinant protein. Coagulation therapy based on these approaches has limitations as high costs and low availability to hemophilic population. FIX is a complex protein with a wide variety of post-translational modifications and, therefore, presents low specific activity and productivity. The production of recombinant FIX with enhanced coagulant activity may contribute to more effective protein replacement and gene therapies in which reduced amounts of catalytically improved molecules will be required to obtain the therapeutic benefits of FIX. This fewer infusion may reduce or eliminate the generation of FIX inhibitors, minimizing side effects and reducing treatment costs. It is one of the current challenges for hemophilia B treatment. In this context, bioengineering has become an important tool for pharmaceutical interest protein modification to improve its biochemical and biophysical properties. This study focused on development of new recombinant human FIX variants with augmented clotting activity. We performed a detailed study of FIX protein structure and generated three variants, FIX-YKALW, FIX-ALL and FIX-LLW, using site-directed mutagenesis. Such variants were expressed in SK-Hep-1 cells treated with vitamin K and they were characterized in vitro and in vivo. The amount of FIX secreted in the cell supernatant was similar between FIX-YKALW and FIX-LLW (3.2 ?g/mL), whereas FIX-ALL displayed the lowest expression (1.8 ?g/mL), 2-3 times lower than FIX-wild-type (FIX-WT). However, the clotting activities of FIX variants were 6.2 times greater than FIX-WT. FIX-YKALW e FIX-LLW showed 11-fold higher specific activity and FIX-ALL showed 24-fold higher specific activity. FIX-YKALW displayed the greatest generation of thrombin in vitro among variants and was highlighted in the evaluation of haemostatic efficiency in hemophiliac B mice, in which a dose 5 times lower than the recommended FIX replacement therapy was enough to promote a procoagulant response. We generated 3 novel recombinant human FIX variants with enhanced specific activity than FIX available on the health system. FIX-ALL with higher in-vitro potency than any other known hyperfunctional FIX variant and FIX-YKALW as the most promising variant, among the generated mutants, for in-vivo haemostatic protection. Further studies are required to overcome the barrier to research for application of new coagulation factors on hemophilia B treatment. However, we have presented new proteins with potential for therapeutic use combined with gene therapy as well as in protein replacement therapy.