Les b-lactamines, grâce à leur efficacité clinique, sont parmi les antibiotiques les plus prescrits pour traiter des infections bactériennes. Cependant, leur utilité est compromise par la prolifération des b-lactamases (BLs) avec des profils d’hydrolyse de substrats très larges. La résistance induite par les BLs compromet également les b-lactamines les plus puissantes (c-à-d les carbapénèmes). OXA-48, une carbapénèmase de classe D (CHDL), a été initialement identifiée dans une souche de K. pneumoniae de Turquie en 2001. OXA-48 hydrolysent fortement les pénicillines, faiblement les carbapénèmes, et quasiment pas les céphalosporines de troisième génération (C3G). Cependant certains variants comme OXA-163 ou OXA-405 hydrolysent les C3G et pas les carbapénèmes. La comparaison de la structure tri-dimensionnelle d’OXA-48 avec d’autres CHDLs a révélé de petites différences principalement localisées dans les boucles qui relient des éléments de structure. Notamment, la boucle localisée entre les feuillets b5 et b6 semble jouer un rôle majeur dans l’hydrolyse des carbapénèmes.Afin de mieux comprendre la contribution de la boucle b5-b6 dans l’hydrolyse des carbapénèmes, nous avons étudié, grâce à des outils biochimiques et structuraux, des variants naturels ou synthétiques d’OXA-48 présentant des modifications dans la boucle: le rôle du remplacement de chaque AA de la boucle par une alanine, des délétions croissantes ou de l’augmentation de la taille de la boucle. Nous avons également réalisé l’échange de boucle entre OXA-48 et OXA-18, une oxacillinase inhibée par l’acide clavulanique et hydrolysant fortement les C3G mais pas les carbapénèmes. La protéine recombinante OXA-48loop18 hydrolysait les C3G, et conservait une activité significative d’hydrolyse des carbapénèmes. L’échange de boucle a permis l’élargissement du site actif, permettant l’accès à des b-lactamines possédant un radical volumineux (e.g. ceftazidime). De plus, le remplacement de chaque AA de la boucle par une alanine a relevé de faibles changements hydrolytiques. En réalisant des délétions croissantes d’AA soit en partant de la gauche de la boucle (Tyr-211 vers Pro-217) ou de la droite (Pro-217 vers Tyr-211), nous avons montré que l’activité d’hydrolyse des carbapénèmes diminuait avec la taille des délétions, alors que celle des C3G augmentait. Les délétions de 4 AA présentent les plus fortes activités hydrolytiques des C3G et une perte totale de l’activité carbapénèmase, excepté pour le simple mutant, OXA-48∆P217, qui présentait un profile d’hydrolyse avec une forte activité carbapénèmase et C3G. La cristallographie et la modélisation moléculaire ont montré une grande flexibilité de la boucle, permettant l’entrée de b-lactamines de tailles variables. De plus, l’étude de nouveaux variants d’OXA-48 a permis d’identifier des déterminants structuraux importants dans le profil d’hydrolyse observé. Ainsi, la délétion I215-E216 associée à la substitution R214K dans la boucle b5-b6 de OXA-517 permet une forte hydrolyse des carbapénèmes et des C3G. De même, dans OXA-519, une substitution V120L située à proximité de la boucle b5-b6, a pour conséquence une diminution de l’affinité pour tous les substrats. La chaine latérale plus encombrante de la L120 empêche l’insertion des b-lactamines, diminuant l’affinité de l’enzyme. Finalement, nous avons caractérisé OXA-535, la b-lactamase naturelle et chromosomique de Shewanella bicestrii JAB-1 qui, n’ayant uniquement 91,5% d’identité en AA avec OXA-48, présente le même profil d’hydrolyse. OXA-535 présentait 98.9% d’identité en AA avec OXA-436, codé par un gène plasmidique, suggérant ainsi que S. bicestrii portant le gène blaOXA-535 pourrait être le progéniteur du gène plasmidique blaOXA-436.Nos travaux ont montré le formidable pouvoir d’adaptation de OXA-48 à évoluer par mutation afin d’accommoder différents substrats, et comment la nature et la longueur de la boucle b5-b6 pouvait influencer sur la spécificité de substrat. / Antimicrobial resistance is the most alarming emerging problem in infectious diseases. b-Lactams, due to their safety, reliable killing properties and clinical efficacy, are among the most frequently prescribed antibiotics used to treat bacterial infections. However, their utility is being threatened by the worldwide proliferation of b-lactamases (BLs). BL-mediated resistance does not spare even most powerful b-lactams, carbapenems, whose activity is challenged by carbapenemases. OXA-48, a carbapenem-hydrolyzing class D b-lactamase (CHDL) initially identified from a Klebsiella pneumoniae isolate from Turkey in 2001, has since spread globally with the isolation of more than 30 variants. Most OXA-48-like enzymes hydrolyze penicillins at high level, carbapenems at low level and lack significant expanded-spectrum cephalosporin (3GC) hydrolysis, others such as OXA-163 hydrolyze expanded-spectrum cephalosporins and poorly carbapenems. Comparison of OXA-48 tertiary structure with those of other CHDLs revealed small differences located mainly in the loops connecting secondary structure elements, which may vary in length and orientation. The loop located between the b5 and b6 strands (Tyr211 to Pro217) has been suggested to play a major role in carbapenem hydrolysis.To better understand the contribution of the b5-b6 loop in the carbapenem hydrolysis of OXA-48-like carbapenemases, we investigated, using biochemistry and structural biology, natural OXA-48 variants with changes in different loops, replaced each AA of the loop b5-b6 by alanines, performed increasing deletions or increased the size of this loop by replacing it with that of OXA-18, a clavulanic acid inhibited class D b-lactamase that presents activity against expanded-spectrum cephalosporins and none against carbapenems. The resulting OXA-48loop18 was able to hydrolyze expanded-spectrum cephalosporins and conserved partial carbapenem hydrolysis. Structural analysis demonstrated that the loop swap produced an opening of the active site, being now accessible to b-lactams with bulky sidechains e.g. ceftazidime. Additionally, by performing alanine replacements in the b5-b6 loop we could show reduced hydrolysis of carbapenems, mostly reflected by changes in kcat. By increasing deletions in the b5-b6 loop, starting from Tyr211 to Pro217 and from the Pro217 to Tyr211, the activity against carbapenems decreased with the size of the deletion whereas the activity against ceftazidime increased. 4 AA deletions revealed the highest 3GC activity, except for one single AA mutant, OXA-48∆P217, with high level carbapenem and ceftazidime hydrolysis. Crystallography along with molecular modelling showed an increased flexibility of this loop allowing different sized b-lactams to enter the active site. Moreover, the characterization of three novel natural OXA-48 variants revealed structural features important in the observed hydrolysis profile. Thus, the I215-E216 deletion and R214K substitution in the b5-b6 loop of OXA-517 induced the hydrolysis of carbapenems and C3G at high level. In OXA-519, the V120L substitution is located at the bottom of the binding site, in the close vicinity of the active Ser70 and the b5-b6 loop, and therefore overall higher Km values were observed compared to OXA-48. The bulkier side chain of L120 in OXA-519 hampers the approach of b-lactam substrate, resulting in a decrease of the substrate affinity. Finally, we have characterized the chromosomally-encoded OXA-535 that is more distantly related to OXA-48 (91.5% AA identity), despite similar hydrolysis profiles. Interestingly, OXA-535 presented 98.9% of AA identity with the plasmid-mediated OXA-436 suggesting that the blaOXA-535 gene might be the progenitor of the plasmid-encoded blaOXA-436 gene.Taken together, our work illustrates the propensity of OXA-48 to evolve through mutations to accommodate different substrates in its active site and how the b5–b6 loop determines the specificity of the enzyme.

Η Ecteinascidin 743 είναι ένα σπουδαίο αντικαρκινικό φάρμακο, που καταστρέφει μέσω αλκυλίωσης τα καρκινικά κυττάρα και είναι εμπορικά διαθέσιμο με το όνομα Yondelis. Χρησιμοποιείται στην Ευρώπη, τη Ρωσία και τη Νότια Κορέα για τη θεραπεία του σαρκώματος του μαλακού ιστού, δηλαδή καρκίνου των ιστών που υποστηρίζουν το σώμα, όπως οι μύες, τα αιμοφόρα αγγεία και άλλα είδη ιστών που υποστηρίζουν και προστατεύουν τα όργανα του σώματος. Η Ecteinascidin 743 βρίσκεται υπό κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία και άλλων μορφών καρκίνου, όπως του καρκίνου του μαστού, του προστάτη, των ωοθηκών, των νεφρών, των πνευμόνων και του μελανώματος. Απομονώθηκε από το μικρό θαλάσσιο οργανισμό, Ecteinascidia turbinate, που ζει στις θάλασσες της Καραϊβικής και ανακαλύφθηκε ότι έχει αντικαρκινική δράση το 1969. Αυτό το φυσικό προϊόν αποτέλεσε πηγή έμπνευσης για την παρούσα ερευνητική εργασία, όπου στην ρετροσυνθετική του πορεία (Εικόνα 3) περιλαμβάνεται η σύνθεση ενός μορίου πιπεραζίνης, καθώς και ενός β-λακταμικού δακτυλίου. Οι β-λακτάμες χρησιμοποιούνται σήμερα ως βακτηριοκτόνα, αντιβιοτικά, αναστολείς των πρωτεασών σερίνης και αναστολείς της ακυλομεταφεράσης της χοληστερολης (acyl-CoA: cholesterol acyltransferase, ACAT), η οποία είναι υπεύθυνη κυρίως για την αθηροσκληρωτική στεφανιαία καρδιακή νόσο. Η ασθένεια αυτή αποτελεί ήδη την πιο κοινή μορφή ασθένειας που προσβάλλει την καρδιά και μία σημαντική αιτία πρόωρου θανάτου στην Ευρώπη, σε κράτη της Βαλτικής, τη Ρωσία, τη Βόρεια και Νότια Αμερική, την Αυστραλία και τη Νέα Ζηλανδία. Η αθηροσκλήρωση σχετίζεται με την στεφανιαία καρδιακή νόσο, η οποία αποδίδεται στην ανικανότητα της στεφανιαίας κυκλοφορίας να τροφοδοτεί με επαρκές αίμα το μυ της καρδιάς και τους περιβάλλοντες ιστούς. Οι παράγοντες που οδηγούν στην αθηροσκλήρωση είναι τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης, η υπέρταση, ο διαβήτης, το κάπνισμα, οι κακές διατροφικές συνήθειες, η παχυσαρκία και η έλλειψη σωματικής άσκησης. Οι παραπάνω δράσεις των β-λακταμών έχουν καταστήσει πολύ ενδιαφέρουσα τη στερεοεκλεκτική και εναντιοεκλεκτική σύνθεση αυτών. Ένας β-λακταμικός δακτύλιος είναι μία λακτάμη με δομή ετεροατομικού τετραμελούς δακτυλίου, που αποτελείται από τρία άτομα άνθρακα και ένα άτομο αζώτου. Ο β-λακταμικός δακτύλιος είναι μέρος της δομής μερικών κατηγοριών β- λακταμικών αντιβιοτικών, όπως οι πενικιλίνες, οι κεφαλοσπορίνες, οι κεφαμυκίνες, οι καρβαπενέμες, οι μονοβακτάμες, και οι τρινέμες. Οι ενώσεις των β-λακταμών παρασκευάστηκαν σύμφωνα με την Mannich αντίδραση μέσω σουλφινιμινών. Οι πιπεραζίνες χρησιμοποιούνται σήμερα ως μυκητοκτόνα, αγχολυτικά, αντιικά, και ανταγωνιστές του υποδοχέα της σεροτονίνης (5-HT). Η τελευταία θεραπευτική ικανότητα των πιπεραζινών είναι πλέον ένα θέμα εκτενούς επιστημονικής έρευνας και περιλαμβάνει υποδοχείς-στόχους που ανήκουν στην κατηγορία των υποδοχέων συζευγμένων με G-πρωτεΐνη (G-ptotein-coupled receptors, GPCRs). Η εκλεκτικότητα των πιπεραζινών για τις GPCRs εμφανίζεται εξαιτίας της βασικότητας. Αυξάνοντας το μέγεθος του όρθο υποκαταστάτη σε Ν-άρυλο πιπεραζίνες, αυξάνεται η ικανότητα πρόσδεσής τους και η λειτουργική τους δραστικότητα. Οι πιπεραζίνες είναι οργανικές ενώσεις, που αποτελούνται από έναν εξαμελή δακτύλιο, ο οποίος περιέχει δύο άτομα αζώτου, που βρίσκονται στις θέσεις 1 και 4 του δακτυλίου. Οι ενώσεις των πιπεραζινών παρασκευάστηκαν σύμφωνα με την Diels-Alder αντίδραση μέσω σουλφινιμινών. Οι σουλφινιμίνες αποτέλεσαν το μόριο-κλειδί για την σύνθεση όλων των τελικών επιθυμητών προϊόντων και είναι γνωστές ως πολύ καλοί πρόδρομοι αμινών, όταν αντιδράσουν με οργανομεταλλικές ενώσεις [RLi, RMgX (αντιδραστήρια οργανολιθίου, αντιδραστήρια Grignard)]. Οι οπτικώς καθαρές σουλφινιμίνες είναι σημαντικές δομικές μονάδες (building blocks) στην ασύμμετρη σύνθεση άμινο παραγώγων, και παρασκευάζονται σε πολύ καλές αποδόσεις μέσω ενός σταδίου από αρωματικές, ετεροαρωματικές και αλιφατικές αλδεΰδες. Στην παρούσα ερευνητική μελέτη συντέθηκαν νέες β-λακταμικές ενώσεις και υποκατεστημένες ενώσεις πιπεραζίνης, συμπληρώνοντας έτσι και ενισχύοντας τα ήδη υπάρχοντα δεδομένα για τις συγκεκριμένες κατηγορίες ενώσεων αφενός και, αφετέρου, παρέχοντας νέα δεδομένα για την ολική σύνθεση του φυσικού προϊόντος, Ecteinascidin 743 (σύνθεση των εξαμελών αζόξυ προϊόντων 18, 19 και 20). Η ρετροσυνθετική ανάλυση της Ecteinascidin 743, που περιγράφηκε αρχικά, δύναται να εφαρμοστεί, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας ερευνητικής εργασίας. / Ecteinascidin 743 is an important antitumor drug that can service a novel way of killing cancer cells, and it is sold under the brand name Yondelis. It has been approved for use in Europe, Russia and South Korea for the treatment of advanced soft tissue sarcoma, cancers of the supporting tissues of the body, such as muscles, fat, blood vessels or in any other tissues that support, surround and protect the organs of the body. Ecteinascidin 743 is undergoing clinical trials for the treatment of breast, prostate, ovarian, renal, lung, and melanoma cancers. It is isolated from the Caribbean tunicate Ecteinascidia turbinate, and was found to have anticancer activity in 1969. We were inpired by this natural product and as we can observe from its retrosynthetic analysis (Scheme 3), the synthesis of a piperazine molecule and a β-lactam ring are involved. The extreme importance of β-lactams serving not only as bactericidal and as key structural units of several important antibiotics, but also as mechanism-based inhibitors of serine proteases and as inhibitors of acyl-CoA cholesterol acyltransferase (ACAT), which is mainly responsible for atherosclerotic coronary heart disease. Coronary heart disease is already the most common form of disease affecting the heart and is an important cause of premature death in Europe, the Baltic states, Russia, North and South America, Australia and New Zealand. Atherosclerosis is most commonly equated with atherosclerotic coronary artery disease, which is rendered in the failure of the artery circulation to supply with sufficient blood the heart muscle and the surrounding tissues. Risk factors for the coronary heart disease include high levels of cholesterol, hypertension, diabetes, smoking, bad diet habbits, obesity, and lack of excercise. The above activities of β-lactams have propelled strong resurgent interest toward their stereoselective and enantioselective synthesis. A β-lactam ring is a lactam with a heteroatomic four-membered ring structure, consisting of three carbon atoms and one nitrogen atom. Penicillins, cephalosporins, cephamycins, carbapenems, monobactams, and trinems are classified as b-lactam antibiotics. β-Lactams were prepared by the Mannich reaction using sulfinimines. Piperazines are used now-a-days as antifungals,antidepressants, antiviral, and serotonin receptor antagonists (5-HT). The latter therapeutic area of piperazines has been the subject of intense research and includes targets belonging to the G-Protein- Coupled Receptor (GPCR) superfamily. The selectivity of piperazines towards GPCRs has deen attributed to their basicity. Increasing the size of the ortho substituent in N-aryl piperazines resulted in an increase in binding affinity and functional potency. Piperazines are organic compounds that consists of a six-membered ring containing two opposing nitrogen atoms, at the 1 and 4 positions of the ring. Piperazines were prepared by the Diels-Alder reaction using sulfinimines. Sulfinimines are the key-compounds for the synthesis of the final desirable products described herein and excellent precursors of amines, when they react with organometallic compounds [RLi, RMgX (organolithium reagents, Grignard reagents)]. Enantiomerically pure sulfinimines representing, important building blocks in the asymmetric synthesis of amine derivatives, are prepared in high yields in one step from aromatic, heteroaromatic, and aliphatic aldehydes. In this project, novel β-lactam compounds and substituted piperazine compounds were synthesized, in order to complete and highlight the already existing data for these specific compounds classes and provide new data about the total synthesis of the natural product, Ecteinascidin 743 (synthesis of six-membered azoxy products 18, 19 and 20). The retrosynthetic analysis of Ecteinascidin 743 could be viable given the result described in Scheme 44.