The human gammaherpesviruses EBV and KSHV realize their oncogenic potential during latent infection. The species specificity of the human gammaherpesviruses has hindered the study of latency in animal models. Murine gammaherpesvirus MHV-68 (MHV-68) may be used as a representative gammaherpesvirus for the study of latency. The goal was to establish an in vitro model of MHV-68 latency using replication defective MHV-68. ORF50 has been identified as the major viral trans-activator essential for entry into the lytic replication cycle and necessary and sufficient for reactivation of MHV-68 virus from latency. ORF50 null mutants (A50) can theoretically be used to infect cells in vitro to facilitate an analysis of virus gene expression and episome maintenance during latency. In this project A50 mutants containing the luciferase or green fluorescence protein (GFP) under OW50 promoter control were used to infect a variety of cell types. 3T3 fibroblasts are a permissive cell line and were used for an initial characterization of the ability of A50 MHV-68 to establish latency. B lymphocytes and macrophages are the major reservoirs of persistence in vivo thus the ability of A50 mutants to establish latency in NSO B and RAW macrophage cell lines was explored. Latency was readily established and maintained in 3T3 and RAW cells. The low infectability of NSO B- cells restricted the utility of this cell line in studies of latency. Examination of patterns of lytic and latent transcription in 3T3 and RAW cells coordinately infected with A50 MHV-68 revealed reactivation efficiencies of 40-60%. Following long-term passage A50 exhibited stable transcription of two latency related genes M2 and ORF73, with episomal maintenance of the viral genome, in the absence of contaminating lytic infection. The results demonstrate the utility of A50 mutants for studies of gammaherpesvirus latency in vivo.

Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 115-127.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Göteborgs universitet, 2009. / Härtill 3 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 89-105).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 102-112).

The Bar-Or laboratory recently reported that human B cells from normal subjects can produce either pro-inflammatory (TNF-alpha; LT) or regulatory (IL-10) effector cytokines depending on their context of activation. It was of interest to investigate the change in B cell cytokine profiles from normal subjects when activated in the context of a Th1 pro-inflammatory environment or a Th2 anti-inflammatory environment. It was found that the B cell regulatory network of effector cytokines from normal subjects is significantly modulated depending on the local cytokine milieu. In addition, it was of interest to study how MS patients' B cell cytokine network would respond in a Th1 pro-inflammatory and a Th2 anti-inflammatory context. It was found that MS patients' B cell cytokine network was dysregulated compared to B cell responses from normal subjects. The findings define a novel regulatory network involving human B cells from normal subjects and point to a newly discovered abnormality in MS patients' B cells.

Bis heute sind über 50 Chemokine und fast 20 Chemokinrezeptoren identifiziert. Dennoch gibt es Chemokine und Chemokinrezeptoren, deren zugehörige Rezeptoren bzw. Liganden noch nicht bekannt sind. PARC (=CCL18) ist ein ausschließlich in Primaten nachgewiesenes, bisher nur wenig charakterisiertes, im Organismus jedoch weit verbreitetes Chemokin, für das bisher noch kein Rezeptor beschrieben wurde. Die Wirkung dieses Chemokins wurde bisher vor allem an T Lymphozyten nachgewiesen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von PARC auf B-Lymphozyten und das Vorkommen des putativen PARC-Rezeptors DRY12. Dabei wurden B-Zellen von CLL Patienten sowie mehrere standardisierte B-Zelllinien als Untersuchungsgut verwendet. In funktionellen Assays (Kalziummobilisation, Aktinpolymerisation und Chemotaxis) wurde die Wirkung von PARC auf diese Zellen charakterisiert. Untersuchungen zu beteiligten Signalkaskaden wurden durch Einsatz von spezifischen Inhibitoren (Pertussis-Toxin) und mittels Western Blot durchgeführt. Weiterhin wurde das Vorkommen des putativen PARC-Rezeptors DRY12 bei den verschiedenen B Lymphozyten mittels Antikörperfärbung und RT-PCR sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene nachgewiesen. Der Nachweis der genauen Lokalisation des Rezeptors in der Zelle erfolgte mittels Immunfluoreszenzcytologie. Abschließend wurde vergleichend das Vorkommen des DRY12 im Lymphknoten von CLL-Patienten und gesunden Spendern untersucht. PARC löst bei den B-Zellen der CLL-Patienten die Polymerisation von Aktin aus. Es induziert jedoch keine gerichtete Migration der Zellen. PARC wirkt auf die in dieser Arbeit untersuchten B-Zellen also nicht als Chemokin im klassischen Sinne. Seine Wirkung besteht möglicherweise in einem synergistischen Effekt, indem es im Zusammenspiel mit anderen Faktoren die Migration der Zellen beeinflusst. Weiterhin wäre denkbar, dass PARC das Verhalten von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen beeinflusst. Die beteiligte Signalkaskade beinhaltet ein Pertussis-Toxin-sensitives Gi-Protein und die Aktivierung der p42/44-MAP Kinase. Ein intrazellulärer Einstrom von Ca2+ spielt bei der Wirkungsvermittlung von PARC keine Rolle. Der putative PARC-Rezeptor DRY12 konnte bei verschiedenen B-Zellen in unterschiedlicher Intensität nachgewiesen werden. Die Expression des DRY12 scheint sowohl auf Ebene der mRNA als auch auf Proteinebene durch multiple Faktoren reguliert zu sein. Dazu gehören z.B. der Reifungs- und Aktivierungszustand der Zellen oder die Kultivierungsdauer nach dem Auftauen der Zellen bis zur Durchführung des Versuchs. Bisher konnten jedoch keine entsprechenden Zusammenhänge nachgewiesen werden. Der DRY12 ist demnach kein konstitutiv exprimierter Rezeptor. Durch Immunfluoreszenzcytologie konnte die Lokalisation des Rezeptormoleküls auf der Zelloberfläche gezeigt werden. Im Lymphknoten wird DRY12 v.a. von Lymphozyten exprimiert. Bei Makrophagen konnte das Rezeptorprotein nicht nachgewiesen werden. In den Lymphknoten von CLL-Patienten exprimieren die Lymphozyten deutlich mehr DRY12 als Lymphozyten im Gewebe gesunder Individuen. Ein direkter Zusammenhang zwischen Rezeptorexpression und Reaktion auf PARC konnte nicht sicher aufgezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit schließen aber auch nicht aus, dass PARC ein möglicher Bindungspartner von DRY12 ist. Bei der Wirkungsvermittlung spielen vermutlich auch andere Botenstoffe und weitere Faktoren eine Rolle, indem sie die Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber PARC bzw. die Rezeptorexpression des DRY12 beeinflussen. Hinsichtlich der Frage, ob es sich bei DRY12 um einen Rezeptor für PARC handelt, kann diese Untersuchung zu keinem abschließenden Ergebnis gelangen, so dass dieser Aspekt in weiterführenden Analysen eingehender betrachtet werden sollte. / Today there are more than 50 chemokines and almost 20 chemokine receptors described. Despite growing knowledge, the ligands for some orphan chemokine receptors have not been identified and for several chemokines the receptor has not been discovered. PARC (=CCL18) is one of these chemokines for which the receptor has not been recognized. It has been detected in primates only and, despite being widely spread in the organism, it is still poorly characterized. Up to now, the effects of PARC were mainly shown on T-lymphocytes. Therefore, the objective of this study was to investigate the function of PARC and the expression of the putative PARC-receptor DRY12 in B-lymphocytes. For the purpose of the present study, B-CLL-cells and several lymphocytic B-cell-lines served as models to cover different stages of B-cell maturation. In order to characterize the effect of PARC, several functional assays (calciummobilisation, actinpolymerisation and chemotaxis), specific inhibitors (pertussis toxin) and Western Blotting were used. Expression analyses of the DRY12-receptor were performed by FACS-analysis, RT-PCR and immunofluorescence cytochemistry. In addition, lymph nodes from patients with CLL and healthy donors were stained immunohistochemically. In B-CLL-cells, PARC stimulation leads to phosphorylation of p42/44-MAP-Kinase and polymerization of actin, which can be inhibited by pertussis toxin, but does not induce calcium signaling or chemotactic migration. In this case, PARC is no classical chemokine but may act as synergist to potentiate the effect of other chemokines or may influence the behavior of hematopoetic stemm-cells. The results of the study show expression of the putative PARC-receptor DRY12 present on several subsets of B lymphocytes. As they showed different intensity of expression, DRY12 may be regulated by different factors in translation as well as transduction. Among these factors might be their current state of maturation and activation and the time period from revitalization to the start of the experiments. The reasons for these differences are still unknown. According to these findings, the receptor is not constitutively expressed, but may be itself regulated by several chemokines and other factors. DRY12 is located at the surface of the cell, as shown by immunocytochemistry. In lymph nodes, particularly lymphocytes but not macrophages express DRY12. In lymph nodes of CLL-patients lymphocytes express much more DRY12 than in healthy samples. However, it could not be proved that DRY12 is the agonistic receptor for PARC, as the expression of DRY12 did not completely correlate with the effects on PARC stimulation. But results of this study do not exclude this possibility either, as different factors are considered to influence the effect of PARC and the expression of DRY12 in B-cells. Although there are hints to it, from this study we can not conclude that DRY12 is the agonistic receptor for PARC. Therefore, further investigation is necessary to find the answer to this question.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 4 uppsatser.