Bacillus cereus is a ubiquitously found foodborne pathogen that is frequently associated with two types of illness: emesis and diarrhea. Two heat labile enterotoxins have been associated with the diarrheal syndrome whereas a heat stable acid stable peptide toxin has been associated with the emetic syndrome. In the U.S, B. cereus is responsible for 1-2% of the total outbreaks from bacteria. Although there are reports of isolation and characterization of this pathogen from various food stuffs all around the world, there are no reports on the levels, toxin producing ability, or growth characteristics from U.S retail rice. Considering that rice is grown mostly in developing countries and most of the rice in the U.S is imported, there is a high chance of the rice being contaminated with B. cereus spores. Therefore, the major objective of this thesis was to characterize B. cereus spores from U.S retail rice. The levels were determined and further the enterotoxigenic ability and the growth characteristics along with the physical characteristics of the isolates were studied. Among the 178 samples analyzed, Spores of Bacillus species were found in 94 (52.8%) of the rice samples with an average concentration of 32.6 CFU/g (3.6-460 CFU/g). Eighty nine of the 94 isolates were tested positive for one of the two enterotoxins produced by B. cereus. none of the 94 isolates tested positive for the emetic gene. All the isolates generally grew well in cooked rice. Levels of 106/g were detected in cooked rice after 22h at 200C and after 34h at 170C whereas at 120C the counts did not go above 104/g even after 48h. A significant difference in the heat resistance of the emetic and the diarrheal strains was found. The emetic but not the diarrheal type grew well at inoculum levels of 102/g and 103/g level following cooking. So these results suggest although the diarrheal type are more predominant in U.S retail rice, the chances of foodborne illness arising from the diarrheal strains is low. B. cereus, B, thuringiensis and B. mycoides were investigated for their physical characteristics. Appendages were not found on B. mycoides. By contrast, all the isolates had exosporia. The isolates were characterized to be moderately to highly hydrophobic and all the isolates had a net negative charge. Judging by their physical characteristics, it can be concluded that these spores may have a high affinity for adhering to inert surfaces.

Qualità e sicurezza degli alimenti, inclusa la loro tracciabilità ed autenticità, è diventato ngli ultimi anni obiettivo primario per la salute e il benessere dei consumatori. Il progetto è diretto allo sviluppo e applicazione di metodiche DNA-based per la tracciabilità di specie vegetali, varietà di frumento duro e microorganismi a difesa della qualita’, salubrita’ ed autenticità della filiera grano e prodotti processati. Le attività progettuali dello studio sono finanziate da industria (Barilla S.P.A.) con il coinvolgimento di enti pubblici di ricerca (Università Cattolica Del Sacro Cuore Di Piacenza, CREA-GB di Fiorenzuola D’arda). Il progetto si articola in tre argomenti principali: WP1.Tracciabilità di specie vegetali nella filiera pasta. Tracciabilità di varietà di frumento duro nella filiera pasta A questo scopo sono state intraprese nel secondo anno di attività due azioni dirette allo sviluppo e validazione di due diverse metodiche di fingerprinting varietale. Partendo dalle direttive UPOV in materia di impiego di marcatori molecolari per la caratterizzazione varietale è stata applicata e validata su di un pool di 26 varietà di interesse per l’industria un’ analisi basata su di una combinazione di marcatori SSR (Simple Sequence Repeats) che ha consentito di identificare in maniera univoca ciascuna delle varietà in esame. Il saggio è stato trasferito ai laboratori dell’industria che lo applica attualmente nella routine per il controllo di partite di granella. A fronte della robustezza dell’analisi SSR si pongono però i lunghi tempi analitici. Per ottimizzare questo aspetto si è completata un’attività di sequenziamento parziale del genoma di 28 varietà presenti in due repliche biologiche (52 campioni) e 12 mix di DNA di due varietà (4 differenti percentuali per ogni coppia di varietà miscelate). I dati ottenuti hanno fornito circa 15.000 marcatori molecolari DArT-seq (Diversity Array Technology ) e SNP (Simple Nucleotide Polimorphisms). Dall’intero set di marcatori è stato quindi individuato, attraverso una procedura bioinformatica, un set ridotto di marcatori ad alta informatività in grado di identificare univocamente le singole varietà e di predire la presenza di altre varietà in miscela e la percentuale di contaminazione. WP2.Tracciabilità Di Microrganismi Fungini Nella Filiera Pasta Questo studio è volto al controllo e identificazione di specie microbiche patogene che possono svilupparsi lungo la filiera grano con conseguente impatto negativo sulla salubrità di granella, di semole e dei prodotti finiti. A questo scopo sono stati prodotti campioni di granella a contaminazione controllata. Si è costituita attraverso l’analisi delle sequenze Barcode una ceppoteca che comprende i maggiori patogeni fungini che possono contaminare la granella durante la crescita della pianta in campo o durante lo stoccaggio della granella. Dopo l’inoculo artificiale dei singoli ceppi in due varietà di frumento duro, sono stati raccolti, a tempi crescenti, campioni di spighe e granella. La metodica è risultata rapida e sensibile nell’identificazione di DNA fungino fin dalle prime fasi dell’infezione, quando i sintomi della malattia risultavano ancora non ancora visibili. Le informazioni di sequenza Barcoding, in prospettiva, potranno essere utilizzate per sviluppare nuovi metodi di identificazione fungina più sensibili e rapidi. WP3. Identificazione molecolare di microrganismi vivi o morti in pesto L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare metodiche di V-qPCR (Viability-PCR), per permettere l’identificazione, quantificazione e discriminazione cellule microbiche vive o morte in alimentiprocessati, come il pesto. Per lo studio è stato scelto il batterio patogeno B.cereus, microrganismo ubiquitario, patogeno e sporigeno di difficile identificazione soprattutto in matrici complesse. Durante questo lavoro è stato sviluppato un protocollo analitico che prevede l’estrazione del DNA batterico da pesto, matrice interferente e complessa. Parte del lavoro è stata svolta presso l’Istituto di Microbiologia dell’Università Cattolica e l’Istituto IATA CSIC Institut d’Agroquímica i Tecnologia dels Aliments in Valencia. / Food quality and safety, including food traceability and authenticity, have become crucial in the last decades. Today, molecular and genetic progress can support the agri-food industry, due to the improvement of new analytical tools. Among the available applications, DNA-based methods can detect the presence of a particular species or variety along the food supply chain, verify the genetic identity of food and feed ingredients and detecting the presence of contaminating organisms, thus becoming an essential tool to study patterns, causes, and risk factors of diseases and outbreaks. As a consequence, genetic analysis has become increasingly popular even among non-specialists and highly beneficial for consumers, agricultural farmers, governments, and the private sector (Reid, O’Donnell, and Downey 2006). In this framework, the research developed in this thesis arises by active collaboration between the private company Barilla G. & R. Fratelli S.p.A., the public research institute CREA-GB (Consiglio per la Ricerca in agricoltura e l'analisi dell Economia Agraria) and Università Cattolica del Sacro Cuore, to develop a set of DNA-based methods to improve the traceability and authenticity of plant and microbial species and durum wheat varieties applicable from farm to fork. Following these aims, the research developed in this thesis includes: 1. The optimization and validation of qPCR assay for the discrimination of plant species along the pasta production chain through the organization of a ring test involving nine Italian public and private laboratories. The results obtained in this study were published in the Journal of Cereal Science (Chapter 2); 2. The discrimination of durum wheat varieties by selecting SSRs and DarT molecular markers as reliable methods for variety fingerprinting (Chapter 3). The results confirm the sensitivity of the method and the feasibility to 7 protect the food industry from fraud and ensure the consumer a certified pasta quality; 3. The application of the Barcoding technique and the development of qPCR assay for the identification and quantification of field fungi (Fusarium, Alternaria, Michrodochium, Cochliobolus spp.) and saprophytic fungi (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus spp) along the wheat chain (Chapter 3). The sensitivity of the method was investigated by inoculating potted durum wheat plants at full anthesis and wheat kernels (pre and postharvest trials). The DNA-based methods demonstrate a key role in pathogen detection and the application in several points of the wheat chain (e.g., for control of both locally and imported grains, for storage lots, to evaluate the environmental risk associated with grain powder for farmers and workers); 4. The optimization of Viability q-PCR (V-qPCR) for the discrimination of dead and alive Bacillus cereus, a spore-forming bacteria (Chapter 4). The results of PMAxx, combined with qPCR, have demonstrated the selective discrimination of B.cereus viable cells, with no false-positive signals determined by dead cells, a peculiar aspect of thermally treated food; 5. The comparison of two DNA extraction kits (FastDNA® SPIN Kit for Soil – MB and NucleoSpin Tissue - Macherey Nagel) by detecting B.cereus spores in basil pesto sauce, selected as a model food matrix. Despite the limit of detection (LOD) achieved (respectively 1.8x102 spores/gr by using Fast DNA TM SPIN and 2.7 x 105 spores/gr by using NucleoSpin®), the principal challenge remains the spores' DNA extraction from the complex matrix. Lastly, the results obtained during the doctoral research project were globally discussed (Chapter 5).