Pseudomonas syringae delivers a plethora of effector proteins into host cells to sabotage host immune responses and physiology to favor infection. We have previously shown that P. syringae pv. tomato DC3000 effector HopF2 suppresses Arabidopsis innate immunity triggered by multiple pathogen-associated molecular patterns (PAMP) at the plasma membrane. We show here that HopF2 possesses distinct mechanisms in the suppression of two branches of PAMP-activated MAP kinase cascades. In contrast to blocking MKK5 in MEKK1-MKK4/5-MPK3/6 cascade, HopF2 targets additional component(s) upstream of MEKK1 in MEKK1-MKK1/2-MPK4 cascade and plasma membrane-localized receptor-like cytoplasmic kinase BIK1 and its homologs. We further show that HopF2 directly targets BAK1, a plasma membrane-localized receptor-like kinase involved in multiple PAMP signaling. The interaction between BAK1 and HopF2 or two additional P. syringae effectors AvrPto and AvrPtoB, was confirmed in vivo and in vitro. Consistent with BAK1 as a physiological target of HopF2, the lethality of overexpression of HopF2 in wild-type Arabidopsis transgenic plants was largely alleviated in bak1 mutant plants. Identification of BAK1 as an additional HopF2 virulence target not only explains HopF2 suppression of multiple PAMP signaling at the plasma membrane, but also supports the notion that pathogen virulence effectors have multiple targets in host cells.

Após a descoberta do primeiro peptídeo hormonal em 1991, uma nova família de moléculas de origem proteica, com características hormonais e que atuam na comunicação intracelular regulando crescimento, desenvolvimento, defesa e reprodução, vem sendo estudada em plantas. Após a descoberta das sisteminas em tabaco, foi isolada uma proteína com 5kDa que induz uma rápida alcalinização no meio de cultivo de células em suspensão. Este peptídeo, denominado RALF (Rapid ALkalinization Factor), é ubíquo no reino vegetal e na planta modelo Arabidopsis forma uma família de 37 isoformas (AtRALFs). O peptídeo AtRALF1 regula, negativamente, a expansão celular, atuando de forma antagônica aos brassinosteróides (BRs). Durante a busca por proteínas que interagissem com o AtRALF1, foi identificada a proteína de ligação a esteróide de membrana MSBP1 (MEMBRANE STEROID BINDING PROTEIN-1). A MSBP1 também atua como reguladora negativa da expansão celular e da sinalização de BRs. Este trabalho teve como objetivo a elucidação do papel da MSBP1 nas respostas mediadas por AtRALF1. Para tanto, buscou-se através de ferramentas genéticas e bioquímicas, um melhor entendimento da relação entre estas proteínas. No sistema de duplo híbrido de levedura, MSBP1 interage com AtRALF1, BAK1 e CML38, enquanto que BAK1 interage com AtRALF1, mas não interage com CML38. No mesmo sistema o peptídeo AtRALF1 interage com todas as proteínas, podendo então ser um ligante chave dessas interações, sugerindo a formação de um complexo. Plantas com baixa expressão de MSBP1 (irmsbp1) são, parcialmente, insensíveis ao peptídeo AtRALF1 e exibem raízes mais longas e células da endoderme maiores que as de plantas selvagens (Wt). Plantas com alta expressão de MSBP1 (35S:MSBP1) exibem raízes curtas e células da endoderme menores que as de plantas Wt. Resultados de expressão gênica em mutantes mostram que MSBP1 é essencial para a indução de genes responsivos ao peptídeo, que AtRALF1 induz a expressão do gene MSBP1 e que BAK1 é essencial para a indução de MSBP1 por AtRALF1. Os mutantes irmsbp1 mostraram uma alcalinização do meio quando tratados com AtRALF1, sugerindo que MSBP1 não é necessária para esta atividade. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a proteína MSBP1 interage com o peptídeo AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / After the discovery of the first hormonal peptide in 1991, a new family of peptide with hormonal characteristics and that act in the intracellular communication regulating growth, development, defense and reproduction, has been studied in plants. After the discovery of the sistemins in tobacco, a protein with 5kDa was isolated that induces a quick alkalinization in the culture medium of cells in suspension. This peptide, called RALF (Rapid AL kalinization Factor), is ubiquitous in the plant kingdom and in the model plant arabidopsis forms a family of 37 isoforms (AtRALFs). The AtRALF1 peptide negatively regulates cell expansion, acting in an antagonistic way to the brassinosteroids (BRs). During the search for proteins that interacted with AtRALF1, the membrane steroid binding protein MSBP1 (MEMBRANE STEROID BINDING PROTEIN-1) was identified. MSBP1 also acts as a negative regulator of cellular expansion and BRs signaling. This work aimed to elucidate the role of MSBP1 in the responses mediated by AtRALF1. In order to do so, a better understanding of the relationship between these proteins was sought through genetic and biochemical tools. In two-hybrid system, MSBP1 interacts with AtRALF1, BAK1 and CML38, whereas BAK1 interacts with AtRALF1, but does not interact with CML38. In the same system the AtRALF1 peptide interacts with all the proteins, being able to be a key ligand of these interactions, suggesting the formation of a complex. Plants with low expression of MSBP1 (irmsbp1) are partially insensitive to the AtRALF1 peptide and exhibit longer roots and endodermal cells larger than those of wild-type plants. Plants with high expression of MSBP1 (35S:MSBP1) exhibit short roots and endodermal cells smaller than those of Wt plants. Results of gene expression in mutants show that MSBP1 is essential for the induction of peptide responsive genes, that AtRALF1 induces MSBP1 gene expression and that BAK1 is essential for the induction of MSBP1 by AtRALF1. The irmsbp1 mutants did show an alkalinization of the medium when treated with AtRALF1, suggesting that MSBP1 is not required for this activity. Based on the results obtained, it is concluded that the MSBP1 protein interacts with the peptide AtRALF1, is involved in the perception of the peptide, is essential for the inhibition of primary root growth caused by AtRALF1 and for the induction of genes responsive to AtRALF1.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.