Il Fusarium verticillioides (Fv) causa il marciume rosa della spiga e contamina le cariossidi con fumonisine, una famiglia di micotossine che colpisce mangimi e alimenti considerata cancerogena per l'uomo e gli animali. Sono stati condotti diversi studi per identificare i geni del mais associati alla resistenza della pianta ospite all'infezione da Fv e l'accumulo di fumonisina. È noto che le ossilipine regolano la difesa contro i patogeni e che il cross-talk lipidico ospite-patogeno influenza la patogenesi. A questo proposito, i mutanti di mais trasposonici del gene ZmLOX4, la linea suscettibile W22 e la resistente TZI18 sono stati testati per la resistenza a Fv mediante il saggio biologico Rolled Towel Assay (RTA). Inoltre, sono stati studiati i profili di espressione di 16 geni coinvolti nella via LOX e volatili verdi (GLV) e l'attività della lipossigenasi è stata analizzata nelle stesse linee. Inoltre, è stata applicata la tecnologia di modifica del genoma di Clustered Shortspeed Palindromic Repeat / Cas9 associato (CRISPR / Cas9) regolarmente esaminata per indagare le possibili implicazioni del gene ZmLOX6 e del fattore di trascrizione ZmWRKY125 nei meccanismi di resistenza contro Fv. L'espressione di questi geni è stata precedentemente osservata dagli esperimenti di RNA - Seq in genotipi resistenti al mais e Studi di Genome Wide Association (GWAS) che hanno portato a un SNP significativamente associato a ZmWRKY125. Inoltre, il gene ZmLOX4 è stato overespresso nella linea A188 per valutare un possibile miglioramento della resistenza alla malattia verso Fv. Il lavoro molecolare del CRISPR si basa su una doppia clonazione utilizzando due diverse single guide RNA (sgRNA) per un bersaglio genico. I costrutti sotto il promotore ZmpUBI nel vettore binario p1609 sono stati trasformati nella linea A188 utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens. Le piante di mais modificate nei geni ZmLOX6 e ZmWRKY125 e ZmLOX4 che sovraesprimono saranno caratterizzate per RTA, prove sperimentali in campo e per il loro contenuto di fumonisina. Inoltre, saranno testati l’attività lipossigenasica totale, i suoi metaboliti derivati ​​e le osslipine, oltre all'analisi dell'espressione dei principali geni coinvolti nella via dell'acido jasmonico. / Fusarium verticillioides (Fv) causes ear rot in maize and contaminates the kernels with fumonisins, a family of mycotoxins that affects feed and food and considered carcinogenic for humans and animals. Several studies were conducted to identify maize genes associated with host plant resistance to Fv infection and fumonisin accumulation. It is known that plant lipoxygenase (LOX)-derived oxylipins regulate defense against pathogens and that the host-pathogen lipid cross-talk influences the pathogenesis. In this regard, maize mutants carrying Mu insertions in the ZmLOX4 gene, the susceptible W22 and the resistant TZI18 lines were tested for Fv resistance by the screening method rolled towel assay (RTA). Additionally, the expression profiles of 16 genes involved in the LOX and green leaves volatiles (GLV) pathway were studied and the lipoxygenase activity was investigated in the same lines as well. Furthermore, the genome editing technology of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/associated Cas9 (CRISPR/Cas9) was applied in order to investigate the possible implication of the lipoxygenase gene ZmLOX6 and the transcription factor ZmWRKY125 in the resistance mechanisms against Fv. The enhanced expression of these genes was previously observed by RNA - Seq experiments in maize resistant genotypes and Genome Wide Association Studies (GWAS) resulted in one SNP significantly associated with ZmWRKY125. Moreover, the gene ZmLOX4 was over-expressed in the line A188 for evaluating a possible improvement of the disease resistance towards Fv. The CRISPR cloning was based on a double cloning using two different guides (sgRNA) for one gene target. The constructs under the maize promoter ZmpUBI in the binary vector p1609 were transformed into the maize A188 line using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Maize plants edited in the genes ZmLOX6 and ZmWRKY125, and over-expressing ZmLOX4 will be characterized for Fv resistance using rolled towel assay, field assay and for their fumonisin content. Furthermore, the content of jasmonic acid, its derivative metabolites, and oxylipins will be tested, as well as the expression analysis of the main genes involved in the jasmonic acid pathway will be performed.

Il sorgo zuccherino utilizzato per produrre cibo, mangimi e carburante con limitato impiego di risorse, risponde ai criteri dell’agricoltura moderna ed è impiegato nella produzione di bioenergia. È una pianta C4 adattata agli ambienti semi-aridi, caratteristica che dovrebbe essere mantenuta e migliorata nel processo di ottenimento di nuovi genotipi. Per comprendere le basi genetiche e fisiologiche della tolleranza alla siccità, genotipi di sorgo (IS 19453, Mpwekwa, SDS19483, IS33350, BR505, BR501) sono stati valutati in camera di crescita e in serra. Lo stress idrico è iniziato quando le piante avevano consumato l'80% di acqua disponibile. L’RNA totale è stato estratto da piante irrigate e non a diversi livelli di stress idrico. L'analisi di espressione genica è stata eseguita attraverso l’uso delle tecniche microarray e q-RT PCR. Il numero dei geni differenzialmente espressi aumentava all’aumentare del livello di stress. Gran parte dei geni sovra espressi erano coinvolti nei meccanismi di difesa, di trasporto, di regolazione genica, e nel metabolismo lipidico, proteico e degli zuccheri. Nelle piante non irrigate, al più alto livello di stress, i geni sovra-regolati presentavano livelli di espressione di 2-5 volte superiori rispetto ai campioni di controllo. Questi risultati serviranno all’identificazione di ”single nucleotide polymorphisms” nelle sequenze dei geni candidati e al loro impiego come marcatori nel processo di miglioramento genetico assistito. / Sweet sorghum providing food, feed and fuel with a limited use of resources, responds to the criteria of sustainable bioenergy production. Sorghum is a C4 plant adapted to semi-arid environments, characteristic that should be maintained and further improved in the process of breding new genotypes for bioenergy production. To understand the genetic and physiological basis of drought tolerance, sorghum genotypes (IS 19453, Mpwekwa, SDS19483, IS33350, BR505, BR501) were evaluated in growth chamber and greenhouse experiments. Drought stress started when plants had consumed 80% of transpirable soil water. Total RNA was extracted from irrigated and not irrigated plants at different levels of water stress, and gene expression analysis was carried out using microarray and q-RT PCR techniques. The number of differentially expressed genes increased with the stress level. Most of the up regulated genes were involved in cell rescue, transport, nucleic acid binding, and in lipid, protein and sugar metabolism. In non-irrigated plants, at the higher stress level, up-regulated genes presented levels of expression 2-5 fold higher compared to control samples. These preliminary results will be useful for the identification of single nucleotide polymorphisms in candidate genes sequences in order to use them as markers for assisted breeding.

E’ stata approfondita l’espressione genica complessiva in spighe di mais, in seguito all’ infezione fungina. Nella prima parte del lavoro, sono stati valutati un genotipo di mais resistente ed uno suscettibile a F. verticillioides, campionando le cariossidi 48 ore dopo l’infezione. Sono state identificate circa 800 sequenze differenzialmente espresse e circa il 10% è stato assegnato alla categoria della difesa. Nel genotipo resistente, i geni coinvolti nella difesa hanno mostrato un tipo di risposta basale, mentre in quello suscettibile tali geni rispondevano specificamente all’infezione. Nella seconda parte del lavoro, l’analisi di espressione è stata estesa a fasi precoci e tardive dell’infezione utilizzando un ceppo normale ed uno mutante di F. verticillioides. Numerosi geni risultavano differenzialmente regolati 48 ore dopo l’infezione con entrambi i ceppi. Il ceppo normale era in grado di attivare i meccanismi di difesa prima del mutante. Nella terza parte del lavoro, 10 linee resistenti e suscettibili sono state infettate con 4 specie fungine. In tutti i genotipi l’espressione dei geni coinvolti nella difesa era indotta in seguito all’infezione, ma le linee resistenti presentavano una risposta basale di difesa. / We investigated global gene expression in maize ears at several time points after fungal infection. In the first part of the work, resistant and susceptible genotypes were tested in kernels sampled 48 h after infection with a wild type strain of F. verticillioides. About 800 differentially expressed sequences were identified and nearly 10% assigned to the category cell rescue, defense and virulence. In the resistant genotype, defense-related genes provided basic defense against the fungus, while in the susceptible genotype defense genes responded specifically to pathogen infection. In the second part of the work the expression analysis was extended to early and late phases of infection with a wild type and a mutant strains of F. verticillioides. Kernels were sampled in the area around the point of infection. Most of genes were differentially regulated 48 h after infection with both fungal strains. The wild type strain was able to activate host defense genes before the mutant strain. In the third part of the work, ten resistant and susceptible lines were infected by different fungal species. All genotypes were able to induce the expression of defense genes upon infection, but the resistant lines showed a basal defense response.

Fusarium verticillioides è l’agente responsabile della Fusariosi della Spiga del mais, contamina la granella con fumonisine, micotossine responsabili di diverse patologie umane e animali. Per la resistenza alla fusariosi e all’accumulo di fumonisine esiste variabilità tra genotipi diversi ma non sono ancora disponibili ibridi immuni. L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di individuare marcatori associati alla resistenza a F. verticillioides. Mediante un bioassay è stato testato un association panel per la resistenza a F. verticillioides. Al fine di identificare i marcatori di resistenza sono stati applicati un approccio GWAS e uno per geni candidati. L’analisi GWAS è stata eseguita con 227K SNPs restituendo 206 marcatori significativi. Da un lavoro di RNASequencing sono stati individuati i geni coinvolti nella risposta a F. verticillioides mentre i geni R sono stati recuperati della letteratura scientifica. Genotipi resistenti (CO433 e CO441) e suscettibili (CO354 e CO389) sono stati scelti per individuare polimorfismi nei geni candidati da associare ai fenotipi rilevati mediante il bioassay. Quattro marcatori sono risultati significativi. Infine, la correlazione tra l’incidenza della fusariosi rilevata in campo e mediante bioassay è stata analizzata in una popolazione di 172 RIL derivanti da CO441 x CO354, tuttavia, non è stata individuata alcuna corrispondenza. / Fusarium verticillioides is the causal agent of Fusarium ear rot (FER) in maize and contaminates grains with fumonisin, a family of mycotoxins involved in several human and animal diseases. Quantitative genetic variation exists for resistance to FER and fumonisin contamination among genotypes, however, resistant maize hybrids are currently not available. The aim of this work was the identification of genetic markers associated to resistance against F. verticillioides. A bioassay was used to screen inbred lines of the maize association population for FER resistance, GWAS and candidate gene approaches were applied to identify markers. GWAS was performed using a 227K SNP matrix and resulting in 206 significant markers. Genes involved in F. verticillioides response in developing maize kernels were retrieved from a previous RNASequencing study while maize R genes were retrieved from scientific literature. Resistant (CO433 and CO441) and susceptible genotypes (CO389 and CO354) were selected to amplify and sequence candidate genes. Polymorphisms detected were used to find association with phenotypes scored using the bioassay. Four significant markers were found. Finally, the correlation between FER phenotypes scored in field experiments and bioassay phenotypes was investigated. A population of 172 RILs (CO441 x CO354), was tested. No correlation was found.

Bacterial endophytes are the organisms that live inside the plant for a full or a part of their life cycle. Endophytic bacteria have captured the interest of agriculture industry due to their plant beneficial properties, such as synthesis of phytohormones, solubilization of soil nutrients, and alleviation of biotic and abiotic stresses. Several studies have reported that stress tolerant endophytic bacteria can work with a similar performance as non-stressed conditions when inoculated to the plants under stressed conditions. Combination of abiotic stresses such as salinity, drought and low nitrogen stress can have additive or agonistic effects on bacterial and plant growth, and their interactions. However, very few studies have reported the impact of combined stress on endophytic bacterial assisted plant growth promotion. Therefore, understanding the underlying mechanisms of endophytic bacterial assisted plant’s tolerance abiotic stresses may provide the means of better exploiting the beneficial abilities of endophytic bacteria in agricultural production. Thus, the aim of this thesis was to study the stress tolerance mechanisms, beneficial characteristics, and plant growth promotion characteristics of endophytic bacteria under individual and combined abiotic stresses. Transcriptome analysis of endophytic bacteria revealed that tolerance mechanisms to deal with one kind of stress is different than concurrent stresses. Salinity and drought stress largely modulated the genes involved in flagellar assembly and membrane transport, showing reduced motility under stress conditions to preserve the energy. Additionally, bacterial endophyte that can fix nitrogen was studied with maize plant growth promotion under drought and low nitrogen stress conditions. The results suggested that diazotrophic bacterial endophyte can promote plant growth under moderate individual and combined stress conditions. Plant growth promoting endophytic bacteria can be utilized as an efficient tool to increase crop production under individual and concurrent abiotic stresses.

L’incessante aumento della popolazione mondiale ed il conseguente incremento della richiesta di risorse alimentari ed energetiche, congiuntamente al mutevole scenario climatico, sempre più incline a periodi di siccità prolungata in misura sempre maggiore in alcune zone del pianeta, fa sì che sempre più attenzione sia rivolta allo sviluppo ed all’implementazione di risorse energetiche rinnovabili a bassi input. Il sorgo zuccherino (Sorghum bicolor Moench) è una coltura bioenergetica in grado di fornire cibo, bioetanolo e biogas. Lo studio di tale coltura in risposta al deficit idrico promuove una più approfondita conoscenza dei meccanismi alla base dei processi fotosintetici, e di come, e quanto, questi possano essere influenzati dall’assenza temporanea, o più o meno prolungata, di disponibilità idrica. La produzione di biomassa e la sua composizione chimica sono state valutate per genotipi di nuova costituzione in confronto a quelli già disponibili in commercio, ai fini della produzione di biogas e bioetanolo. Una più approfondita analisi fisio-fenologica e molecolare è stata condotta su sei genotipi di sorgo con lo scopo di combinare in una visione di insieme più integrata la risposta alla siccità in sorgo. Due genotipi (uno sensibile e l’altro tollerante la siccità) sono stati selezionati per l’analisi trascrittomica in risposta allo stress idrico al fine di individuare geni candidati potenzialmente utili ai fini di una selezione assistita da marcatore. / Due to the increasing human population and the consequent surging energy and water demand, it is necessary to implement energy and fuel production from low input renewable sources. Sweet sorghum (Sorghum bicolor Moench) is a low input multipurpose crop that provides food, feed and bioethanol from conversion of sugars accumulated in the stalk and biogas from anaerobic digestion of whole aboveground dry biomass. This multipurpose crop was studied in response to water deficit. In particular, the biomass production and its composition were evaluated in response to drought for new developed and commercial genotypes for biogas and bioethanol production. The physiologic and molecular approaches were combined in order to provide an integrated view on drought tolerance in sorghum enabling to know which are the mechanisms and with which extent they were affected by drought in this bioenergy crop. The transcriptomic analysis was performed on two sorghum genotypes (one sensitive and the other one tolerant to drought) with RNA-Seq technology in order to evaluate the diversity existing in the sorghum transcriptome that could be related to drought tolerance and to identify candidate genes that could be used as potentially marker for the marker assisted selection.