141 |
On the characterization of protein-DNA interactions using statistical potentials and protein-protein interactionsFornés Crespo, Oriol, 1983- 21 January 2015 (has links)
Protein-DNA interactions are indispensable players in the daily activities of cells. DNA-binding proteins regulate gene expression and are responsible of DNA replication, packaging, repair and recombination. Among them, transcription factors activate/repress gene transcription by binding to specific genomic sites. Hence, the characterization of transcription factor binding sites turns out to be crucial in order to understand gene regulation. In this context, the development of computational tools is foremost. Here, I show the prediction of redundant transcription factors in yeast using a combination of homology-based tools and protein-protein interactions. The approach was automated and incorporated into ModLink+, an online and user-friendly tool to infer the fold of remote homologs. Moreover, I describe split-statistical potentials for protein-DNA interactions. Finally, I present SHAITAN, a statistical/homology-based approach that can be used to both predict transcription factor binding sites and infer the more likely transcription factors to bind a DNA sequence of interest. / Les interaccions proteïna-ADN són indispensables en l’activitat diària de les cèl•lules. Les proteïnes que participen en aquestes interaccions s’encarreguen de la regulació de l'expressió gènica i són responsables de la replicació, l'empaquetament, la reparació i la recombinació de l’ADN. Entre aquestes proteïnes, els factors de transcripció activen/reprimeixen la transcripció de gens mitjançant la unió a llocs específics dins el genoma. Per tant, la caracterització dels llocs d'unió dels diferents factors de transcripció és crucial per tal d’entendre com funciona la regulació gènica. En aquest context, desenvolupar eines computacionals és importantíssim. En aquesta tesi predict redundància entre factors de transcripció de llevat eines fent servir eines basades en homologia i interaccions proteïna-proteïna. Aquesta aproximació va ser automatitzada i incorporada a ModLink+, una eina accessible des d’internet i fàcil d'usar per a inferir el plegament de proteïnes a partir d’homòlegs remots. D'altra banda, descric potencials estadístics fraccionats per a interaccions proteïna-ADN. Finalment presento SHAITAN, una aproximació basada en homologia i potencials estadistics que pot ser utilitzada per a predir els llocs d'unió de factors de transcripció així com per saber quins factors de transcripció són més probables que s’uneixin a una determinada seqüència d'ADN.
|
142 |
Predictions of RNA-binding ability and aggregation propensity of proteinsAgostini, Federico, 1985- 16 June 2014 (has links)
RNA-binding proteins (RBPs) control the fate of a multitude of coding and non-coding transcripts. Formation of ribonucleoprotein (RNP) complexes fine-tunes regulation of post-transcriptional events and influences gene expression. Recently, it has been observed that non-canonical proteins with RNA-binding ability are enriched in structurally disordered and low-complexity regions that are generally involved in functional and dysfunctional associations. Therefore, it is possible that interactions with RNA protect unstructured protein domains from aberrant associations or aggregation. Nevertheless, the mechanisms that prevent protein aggregation and the role of RNA in such processes are not well understood. In this work, I will describe algorithms that I have developed to predict protein solubility and to estimate the ability of proteins and transcripts to interact. I will illustrate applications of computational methods and show how they can be integrated with high throughput approaches. The overarching goal of my work is to provide experimentalists with tools that facilitate the investigation of regulatory mechanisms controlling protein homeostasis. / Las proteínas de unión de ARN son responsables de controlar el destino de una multitud de transcriptos codificantes y no codificantes. De hecho, la formación de complejos de ribonucleoproteínas (RNP) afina la regulación de una serie de eventos post-transcripcionales e influye en la expresión génica. Recientemente, se ha observado que las proteínas con capacidad no canónica de unión al ARN se enriquecen en las regiones estructuralmente desordenadas y de baja complejidad, que son las que participan generalmente en asociaciones funcionales y disfuncionales. Por lo tanto, es posible que interactuar con el ARN pudiera ser una manera de proteger las proteínas no estructuradas de asociaciones aberrantes o de agregación. Sin embargo, los mecanismos que impiden la agregación de proteínas y la función del ARN en tales procesos no están bien descritas. En este trabajo, se describen los me ́todos que he desarrollado para predecir la solubilidad de proteínas y para estimar la capacidad de transcriptos y proteínas de interactuar. De otra parte, voy a ilustrar sus aplicaciones y explicar como los métodos de bajo rendimiento han evolucionado a un mayor rendimiento. El objetivo final es proporcionar instrumentos a los investigadores experimentales que se pueden utilizar para facilitar la investigación de los mecanismos reguladores que controlan la homeostasis molecular.
|
143 |
Modeling the interplay between membrane lipids and GPCRsGuixà González, Ramon, 1978- 23 July 2014 (has links)
La composición lipídica de las membranas celulares determina en última instancia sus propiedades biofísicas, afectando así las dinámicas y organización de proteinas transmembrana claves como los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). El objetivo de esta tesis es avanzar en la comprensión y el alcance de la interacción entre lípidos de membrana y GPCRs. Para ello, hemos utilizado simulaciones de dinámicas moleculares para estudiar la complejidad de las membrana biológicas y su efecto en la organización de las GPCRs. Así, hemos desarrollado on marco computacional para analizar con detalle las simulaciones de bicapas lipídicas y de sistemas proteina-membrana. Además, combinando simulaciones computacionales y experimentos con células vivas, demostramos por primera vez que los lípidos de membrana poliinsaturados pueden modular la organización de las GPCRs. Estos resultados podrían abrir en el futuro nuevas puertas al tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia o la enfermedad de Parkinson, donde se ha demostrado que las GPCRs juegan un papel vital. / The lipid composition of cell membranes ultimately determines their biophysical properties, thereby affecting the dynamics and organization of key transmembrane proteins like G protein-couple receptors (GPCRs). The aim of this thesis is to make a step forward towards a better understanding of the nature and extent of the interplay between membrane lipids and GPCRs. We have used molecular dynamics simulations to study the complexity of biological membranes and the effect of the membrane environment on the organization of GPCRs. Thus, we developed a computational framework to comprehensively analyze the properties of lipid bilayers and membrane--protein simulations. In addition, by combining computer simulations and experiments in living cells we demonstrate for the first time that membrane polyunsaturated lipids can modulate the organization of GPCRs. These findings could open new doors to the treatment of several conditions like schizophrenia or Parkinson's disease, where GPCRs have been shown to play an vital role.
|
144 |
Study of the role of Pap1 as a sensor of H2O2 and as a transcriptional activator of stress responses in Schizosaccharimyces pombeCalvo Arnedo, María Isabel, 1983- 21 December 2012 (has links)
En el laboratorio se utiliza como sistema modelo la levadura Schizosaccaromyces pombe para poder estudiar la respuesta a estrés oxidativo. Las dos rutas principales de respuesta a estrés oxidativo son las del factor de transcripción Pap1 y la de la MAP quinasa Sty1. Cuando aplicamos a la célula bajas dosis de H2O2, Pap1 que se encuentra en el citoplasma en estado reducido, sufre un cambio conformacional, se oxida, y activo viaja al núcleo, donde se une a diferentes promotores para activar su transcripción.
La caracterización de Pap1 como sensor de H2O2 y como factor de transcripción centran el trabajo de esta tesis. Respecto al mecanismo molecular de activación de Pap1, esta proteína necesita de varias cisteínas que son esenciales para su activación. Así como intentar averiguar qué papel juegan las diferentes proteínas que componen el sistema tiorredoxina en la activación-inactivación de Pap1.
Con respecto al estudio de Pap1 como factor de transcripción, se ha visto que la expresión de genes Pap1 dependientes tiene diferentes requerimientos dependiendo de la localización y el estado de oxidación de Pap1, dando lugar a dos grupos de genes; antioxidantes y de resistencia a drogas. Para activar el primer grupo de genes, se necesita a Pap1 reducido y además la actividad conjunta con otra proteína, Prr1. Ambas necesitan de la presencia de la otra para llevar a cabo correctamente su función. Por el contrario, para activar los genes de resistencia a drogas es sólo suficiente con la localización nuclear de Pap1. / In our laboratory we used as a model the fission yeast S. pombe; which has specific sensors for oxidative stress, such as the transcription factor Pap1 (pombe AP-1-like). At the beginning of this project, it was known that the activation of Pap1, which is reduced and in the cytosol before stress, occurs mainly at low hydrogen peroxide (H2O2) concentrations, in a thioredoxin peroxidase (Tpx1)-dependent manner.
With this work we have characterized Pap1 as a sensor of H2O2 and as a transcriptor factor. Regarding its role as a sensor of H2O2, we studied the molecular mechanism for its activation, the role of its different cysteine residues, and the participation of Tpx1, Trx1 and Trr1 in the activation and inactivation of Pap1-dependent manner.
Secondly, we have studied the Pap1-dependent gene expression program. The expression of some Pap1-induced genes have different requirements regarding Pap1 activity/subcellular localization/oxidation state leading to two subsets of genes: the antioxidant and the drug resistance genes. Oxidized Pap1 forms a heterodimer with the constitutively nuclear transcription factor Prr1 to induce the antioxidant response. The ability of Pap1 to bind and activate drug tolerance promoters is independent on Prr1, whereas its ability to bind to the antioxidant promoters is significantly enhanced upon association with Prr1. Prr1 is recruited to promoters in an oxidized Pap1-dependent manner.
|
145 |
Molecular and functional characterization of irem-3, a new activating member of the cmrf/irem familyMartínez Barriocanal, Agueda 16 April 2009 (has links)
En los últimos años hemos sido testigos de la identificación de múltiples familias de receptores inmunológicos. En este contexto encontramos la recientemente descrita familia IREM/CD300 localizada en la región cromosómica 17q25.1 y restringida en expresión a las células de origen mieloide. El locus humano se compone de dos genes codificantes para receptores con propiedades inhibidoras (IRp60/CD300a y IREM-1/CD300f), dos genes codificantes para receptores con naturaleza activadora (IREM-2/CD300e y IREM-3/CD300b) y dos genes codificantes para receptores con características que no permiten su inclusión en ninguno de los anteriores grupos (CMRF-35/CD300c i IREM-4/CD300d). El presente trabajo describimos la caracterización molecular del receptor IREM-3/CD300b, las vías de señalización intracelular utilizadas por esta molécula y la relación funcional existente entre los diferentes miembros pertenecientes a la familia IREM/CD300. / In the last years, different multigenic families of immune receptors have been identified. In this context, we find the recently described IREM/CD300 family of immune receptors which maps in the 17q25.1 chromosomical region and is restricted in expression to the cells with a myeloid origin. The human locus is composed by two genes encoding for inhibitory receptors (IRp60/CD300a and IREM-1/CD300f), two genes encoding for activating receptors (IREM-2/CD300e and IREM-3/CD300b) and two genes encoding for receptors with features that make its classification uncertain (CMRF-35/CD300c and IREM-4/CD300d). In the present work we describe the molecular characterization of IREM-3/CD300b receptor, the dissection of the intracellular signaling pathways engaged by this molecule and the functional relationship between the different IREM/CD300 family members.
|
146 |
Molecular and functional characterization of the HP1c complex in Drosophila melanogasterKessler, Roman, 1983- 03 June 2014 (has links)
Unlike characteristic HP1 proteins, the HP1c isoform of Drosophila melanogaster is a euchromatic protein. HP1c forms a complex with the zinc finger proteins ROW and WOC, which are crucial for HP1c function. In the present work, we aimed to further characterize the HP1c complex. We purified several novel factors that are associated with the complex. In particular, we characterize the ubiquitin receptor Dsk2 as an intrinsic subunit of the HP1c complex. Further, we show that the HP1c complex binds to TSS of actively transcribed genes and contributes positively to their transcription. The HP1c complex promotes an active chromatin state at target genes. We show evidence that this role involves regulation of H2Bub1 levels through Dsk2. / Al contrario de proteinas HP1 características, la isoforma HP1c de Drosophila melanogaster es una proteína eucromatica. HP1c se encuentra en un complejo con las proteínas “zinc finger” ROW y WOC, que son esenciales para la función de HP1c. En este trabajo, quisimos caracterizar el complejo HP1c en más detalle. Purificamos varios factores nuevos que se unen al complejo. En particular, caracterizamos el receptor de ubiquitina Dsk2 como una unidad principal del complejo HP1c. Además, demostramos que el complejo HP1c se une a TSS de genes que se transcriben activamente y que influye positivamente en su transcripción. El complejo HP1c favorece un estado activo de cromatina en los genes donde se encuentra. Nuestros resultados indican que este mechansimo incluye una regulación de los niveles de H2Bub1 a través de Dsk2
|
147 |
Links between chromatin structure and regulation of alternative pre-mRNA splicing in mammalian cellsIannone, Camilla, 1984- 23 May 2014 (has links)
Intron removal is a necessary step for expression of most genes in higher eukaryotes, and alternative splice selection is a highly regulated mechanism that endows a single gene with the possibility to codify for multiple transcripts. Pre-mRNA splicing occurs largely co-transcriptionally, and its outcome is influenced by transcription elongation and chromatin structure. In this thesis we have used two different approaches to study novel links between chromatin structure and alternative splicing regulation.
In the first approach, we identified genome-wide progesterone-regulated cassette exons and compared them with nucleosome density profiles, with the aim of finding correlations between changes in nucleosome positioning and changes in alternative splicing. We find that, even if all exons harbor a well-positioned exonic nucleosome, four different classes of nucleosome density profiles can be identified around alternative exons, which strongly correlate with the DNA sequence GC content. Transitions between these profiles occur upon hormone stimulation and can be correlated with alternative splicing changes, although changes in nucleosome profiles are also observed in non-regulated exons. In particular hormone-induced exon inclusion is more frequently linked to changes in nucleosome density than hormone-induced skipped exons, which tend to have low nucleosome density profiles even before hormone treatment. Peaks of nucleosome density before alternative exons tend to correlate with exon inclusion.
In the second approach, we took advantage of ENCODE data of chromatin epigenetic signatures and RNA-Seq in multiple cell lines to evaluate functional enrichment of histone modifications over alternative exons. We find that three histone modifications (H3K4me3, H3K27ac and H3K9ac) co-occur in a subset of exons when they are highly included. These features are sufficient to predict differential inclusion levels in other cell lines. Moreover, they are enriched in exons characterized by the presence of DNase hypersensitive sites, promoter signatures and RNA Pol II accumulation. These observations suggest a functional role for 3-dimensional genome structure in the regulation of alternative splicing. / La eliminación de intrones es un paso necesario para expresar la mayoría de los genes en eucariotas superiores. La selección alternativa del corte y empalme (pre-mRNA splicing) es un mecanismo altamente regulado que dota a un solo gen con la posibilidad de codificar para múltiples transcritos. El splicing del pre-mRNA se produce en gran parte de manera cotranscripcional y por esto resultado está influenciado por la elongación de la transcripción y la estructura de la cromatina.
En esta tesis se han utilizado dos enfoques diferentes para estudiar nuevos vínculos entre la estructura de la cromatina y la regulación del splicing alternativo.
En el primer enfoque hemos identificado, a nivel de todo el genoma, exons internos regulados por progesterona y los hemos comparados con los perfiles de densidad de nucleosomas, con el objetivo de encontrar correlaciones entre los cambios en el posicionamiento de nucleosomas y en el splicing alternativo. Hemos encontrado que, aunque todos los exones albergan un nucleosoma bien posicionado, se pueden identificar cuatro clases diferentes de perfiles de densidad de nucleosomas alrededor de exones alternativos, que se correlacionan fuertemente con el contenido G+C en la secuencia del ADN. Las transiciones entre estos perfiles se producen tras la estimulación con la hormona y se pueden correlacionar con los cambios en splicing alternativo, aunque se observan también cambios en los perfiles de nucleosomas en exones no regulados. La inclusión de exones inducida por la hormona está relacionada más a menudo con cambios en la densidad de nucleosomas que la exclusión. Estos exones excluidos tienden a tener perfiles de baja densidad nucleosomal incluso antes del tratamiento hormonal. Los picos de densidad de nucleosomas antes de exones alternativos tienden a correlacionarse con la exclusión de exones.
En el segundo enfoque nos aprovechamos de los datos de ENCODE de marcas epigenéticas de la cromatina y de RNA-Seq en múltiples líneas celulares, para evaluar el enriquecimiento funcional de las modificaciones de histonas en exones alternativos. Encontramos que tres modificaciones de las histonas (H3K4me3, H3K27ac y H3K9ac) co-ocurren en un subconjunto de exones mas incluidos. Estas características son suficientes para predecir los niveles de inclusión diferenciales de estos exones entre líneas celulares. Además, estos exones se caracterizan también por la presencia de sitios hipersensibles a la DNasa, de marcas de promotores y la acumulación de ARN Pol II . Estas observaciones sugieren un papel funcional para la estructura en 3 dimensiones del genoma en la regulación del splicing alternativo.
|
148 |
Effects of dietary catechins and proanthocyanidins on zinc homeostasis in hepatic cellsQuesada, Isabel Maria 29 October 2010 (has links)
Les catequines i els seus polímers, les procianidines, són flavonoids presents en hortalissesi fruits amb efectes beneficiosos sobre la salut. Actuen com a antioxidants segrestantespècies reactives d'oxigen (ROS) i quelant els metalls ferro i coure. També es comportencom a molècules senyalitzadores, modulant múltiples vies de senyalització i metabòliques il'expressió gènica, incloent-hi la d'enzims antioxidants. Resultats previs del Grup de Recercaen Nutrigenòmica mostren que una dosi oral aguda d'un extracte de procianidines de llavorde raïm (GSPE) reprimeix l'expressió de les metal·lotioneïnes (MT), proteïnes lligadores dezinc, a fetge de rates, i tanmateix incrementa l'expressió del receptor nuclear orfe smallheterodimer partner.(SHP/Nr0b2) (Del Bas et al., 2005). Igualment, es va demonstrar que lesprocianidines actuen com a coactivadors transcripcionals del receptor nuclear d'àcids biliarsFarnesoid X Receptor (FXR), el qual es responsable de la sobre-expressió de SHP causadaper GSPE a cèl·lules hepàtiques, i de l'efecte hipotrigliceridèmic de les prociandines effect(Del Bas et al., 2008; Del Bas et al., 2009).Els objectius d'aquesta Tesi van ser determinar si les catequines i procianidinesinteraccionen amb el zinc, avaluar el seu efecte sobre l'homeòstasi del zinc en cèl·luleshepàtiques -incloent l'efecte sobre l'expressió de genes MT, utilitzats aquí com abiomarcadors de l'activitat de les procianidines a cèl·lules hepàtiques-, i disseccionar elsmecanismes pels quals les procianidines afecten l'homeòstasi del zinc, en particularconfirmar si els gens MT són dianes de SHP i FXR.Els resultats obtinguts mostren que GSPE, així com diverses catequines i procianidinespures, incloent-hi el flavonoid del te verd (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), lliguencations de zinc en solució amb una afinitat més gran que el quelant específic de zincZinquin. En cèl·lules d'hepatocarcinoma humanes HepG2, GSPE inhibeix l'acumulacióintracel·lular de zinc i contraresta els efectes tòxics de dosis elevades de zinc sobre laviabilitat cel·lular. GSPE reprimeix l'expressió de gens de MTs i d'exportadors de zinc mentreque estimula l'expressió d'importadors de zinc. L'expressió dels importadors de zinc de laxarxa Trans-Golgi és estimulada per GSPE. A més a més, GSPE bloqueja la inducció del'expressió de MTs per la citoquina proinflamatoria IL-6, pel generador de ROS tBOOH, perl'agonista de receptors de glucocorticoids dexametasona, i pels metalls coure i zinc.EGCG reprodueix els efectes de GSPE sobre l'homeòstasi del zinc en HepG2, reprimintl'expressió de MTs i d'exportadors de zinc, estimulant l'expressió d'importadors de zinc, iUNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILIEFFECTS OF DIETARY CATECHINS AND PROANTHOCYANIDINS ON ZINC HOMEOSTASIS IN HEPATIC CELLSIsabel Maria QuesadaISBN:978-84-694-1258-9/DL:T-322-2011inhibint l'acumulació de zinc intracel·lular i la toxicitat de dosis elevades de zinc. Laprocinidina dimèrica B1 i la trimèrica C1 es comporten tenen efectes contraris als de GSPE iEGCG pel que fa a l'expressió de MT i l'acumulació de zinc total en cèl·lules HepG2.Pel que fa al zinc làbil citoplasmàtic, la minúscula fracció del total del zinc cel·lular quemodula múltiples vies metabòliques i senyalitzadores, tant GSPE com EGCG i C1 eleven engran manera els nivells de zinc làbil detectable per Zinquin a cèl·lules HepG2.Experiments amb ratolins KO per SHP o per FXR han demonstrat que GSPE reprimeixl'expressió postprandrial de gens MT a fetge per una via que no depen de SHP però que ésdepenent de FXR. A més, l'àcid biliar CDCA, un lligand fisiològic i activador de FXR,reprimeix l'expressió de gens MT a cèl·lules HepG2. Per tant, els gens MT són diana de FXRi, conseqüentment, FXR apareix com un receptor nuclear que modula l'homeòstasi del zinc.Per explicar aquests resultats, proposem que catequines i procianidines poden actuar tantcom a segrestadors de zinc -evitant la seva entrada a la cèl·lula a través dels transportadorsde zinc de membrana plasmàtica-, com d'ionòfors de zinc -cotransportant cations zinc através de la bicapa lipídica i incrementant així els nivells de zinc làbil citoplasmàtic. Larepressió de gens MT induïda per l'activació de FXR per GSPE podria també contribuir al'increment de zinc làbil, en impedir que els cations zinc siguin segrestats per apo-tioneïnasintetitzada de novo.Donat el paper del zinc làbil com a modulador de múltiples víes de senyalització imetabòlics, formulem la hipòtesi que la quelació extracel·lular de cations de zinc i l'elevacióde zinc làbil citoplasmàtic són mecanismes subjacents a l'activitat biològica de catequines iprocianidines i, per tant, que les vies metabòliques i de senyalització afectades pel zinc làbil,ho seràn també per aquests flavonoids.Effects of dietary catechins and proanthocyanidins on zinc homeostasis inhepatic cells.Catechins and their polymers procyanidins are health-promoting flavonoids found in ediblevegetables and fruits. They act as antioxidants by scavenging reactive oxygen species andby chelating the redox-active metals iron and copper. They also behave as signalingmolecules, modulating multiple cell signaling and metabolic pathways and gene expression,including that of antioxidant enzymes. Previous results of the Nutrigenomics Reseach Groupshowed that an oral acute dose of a grape-seed procyanidin extract (GSPE) represses theexpression of the zinc-binding protein metallothionein (MT) genes in rat liver, and enhancesthe expression of the orfan nuclear receptor small heterodimer partner (SHP/Nr0b2) (Del Baset al., 2005). In addition, it was shown that procyanidins act as transcriptional coactivators ofthe nuclear bile acid receptor Farnesoid X Receptor (FXR), which in turns upregulates SHPexpression, thereby exerting an hypotrygliceridemic effect (Del Bas et al., 2008; Del Bas etal., 2009).The objectives of this Ph.D. Thesis were to determine whether catechins and procyanidinsinteract with the redox-inactive metal zinc, to evaluate their effect on zinc homeostasis inhepatic cells -including the expression of MT genes, used here as a biomarkers ofprocyanidin activity in hepatic cells-, and to disect the mechanisms by which procyanidinsaffect cellular zinc homeostasis, in particular to asses whether MT genes are targets of SHPand FXR.Our results show that GSPE, as well as individual catechins and procyanidins tested,including the green tea flavonoid (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), bind zinc cations insolution with higher affinity than the zinc-specific chelator Zinquin. In humanhepatocarcinoma HepG2 cells, GSPE inhibits intracellular zinc accumulation and counteractsthe toxic effects of excess zinc on cell viability. At the mRNA expression level, GSPEdownregulates MTs and zinc-efflux transporters while upregulating zinc-influx transporters.Zinc importers of the Trans-Golgi network are upregulated by GSPE. In addition, GSPEblocks the induction of MTs expression by the proinflammatory cytokine IL-6, the ROSgenerator tBOOH, the glucocorticoid receptor agonist dexamethasone, and the metalscopper and zinc.EGCG reproduces the major effects of GSPE on zinc homeostasis in HepG2, downregulingthe expression of MTs and zinc-efflux transporters, while upregulating the expression of zincinfluxtransporters, concomitantly inhibiting intracellular zinc accumulation and the toxicity of high zinc doses. Procyanidin dimer B1 and trimer C1 behave opposite to GSPE and EGCGwith regard to MT expression and intracellular zinc accumulation in HepG2 cells.Concerning cytoplasmic labile zinc, the tiny fraction of total cellular zinc that modulatessignaling and metabolic pathways, we found that GSPE, EGCG and trimeric procyanidin C1greatly elevate Zinquin-detectable labile zinc in HepG2 cells.Experiments with SHP-null and FXR-null mice demonstrate that GSPE downregulatespostprandial expression of MT genes in the liver, in a SHP-independent but FXR-dependentmanner. In addition, chenodeoxycholic acid, a physiological ligand and activator of FXR,represses the expression of MT genes in HepG2 cells. Thus, MT genes are targets of FXRand, consequently, FXR is revealed as a modulator of zinc homeostasis.To explain these results, we postulate that catechins and procyanidis may act both assequestrants of zinc -thereby impeding the entrance of zinc cations to the cell throughplasma membrane zinc transporters-, and as zinc ionophores -thereby cotransporting zinccations through the lipid bilayer and increasing the levels of cytoplasmic labile zinc.Repression of MT expression by procyanidin-activated FXR might also contribute to theincrement of the labile pool of zinc, by hindering the sequestration of zinc-cations by de novosynthesized apo-thionein.Given the role of labile zinc as modulator of multiple intracellular signaling and metabolicpathways, we forward the hypothesis that extracellular complexation of zinc cations andsubsequent elevation of cytoplasmic labile zinc may be relevant mechanisms underlying thehealth-promoting activity of catechins and procyanidins and, therefore, that the signaling andmetabolic pathways modulated by labile zinc will be aslo a target of these flavonoids.
|
149 |
A theoretical approach to the engineering of bioinspired systems: design, applications & information managementRevilla López, Guillem 17 February 2011 (has links)
L’enginyeria de sistemes bioinspirats ha crescut en importància i nombre d’aplicacions en el últims anys, atraient
l’atenció dels científics sobre els seus usos potencials en camps com ara la bionanotecnologia, la nanomedicina i la
ciència de materials.
En aquesta tesis, es presenta una aproximació mitjançant mètodes computacionals a l’enginyeria de sistemes
biomimètics. Em posat la nostra èmfasi en l’estudi teòric basat en principis fonamentals de sistemes peptídics, això
vol dir des de mètodes mecànic quàntics d’alt nivell per als elements més bàsics fins a la simulació de tot o part del
sistema en un ambient més realista a partir de diferents aproximacions computacionals. Un altre objectiu del present
treball és la recopilació exhaustiva de la informació derivada dels estudis fets així com dels potencials usos en un
sistema informàtic orientat a l’usuari d’emmagatzemament de dades.
S’han caracteritzat anàlegs conformacionalment restringits de l’arginina, prolina i fenilalanina a través de càlculs
mecànic quàntics d’alt nivell. Aquest aminoàcids no codificats (és a dir que no estan entre els 20 aminoàcids
naturals) han demostrat la seva capacitat de modulació del perfil conformacional dels pèptids a on són introduïts. A
més a més, indueixen resistència a l’acció de les proteases a banda d’introduir noves propietats electròniques i
espectroscòpiques útils en aplicacions tals com els sistemes de diagnòstic, alliberadors de fàrmacs i del camp de
l’enginyeria de materials. Els aminoàcids obtinguts són emprats per a modificar pèptids de “homing”, blocs proteics
autoagregants i superfícies actives recobertes de pèptids.
La remarcable quantitat d’informació sobre aminoàcids no codificats accessible en publicacions científiques expressa
la necessitat urgent de sistemes que, basant-se en ordinadors recopilin, organitzin i ofereixin aquesta informació de
manera intel·ligible per a l’usuari final. Una base de dades ha estat dissenyada, creada i posada en funcionament per
tal d’emmagatzemar dades conformacionals teòriques sobre aminoàcids no codificats. La base de dades també conté,
en cas que la informació sigui accessible, dades experimentals referents a aplicacions, caracterització estructural i
propietats espectroscòpiques.
En resum, aquests treball ofereix un nou enfoc a l’enginyeria assistida per ordinador i la gestió de la informació de
sistemes bioinspirats des de les seves unitats més elementals fins al disseny de les aplicacions de major complexitat / The engineering of systems inspired by biochemical molecules has grown in importance and number of applications
in the recent years, focusing the researchers’ attention in its potential uses in fields such as nanotechnology,
bionanotechnology, nanomedicine and material sciencie.
A computational approach to engineering of biomimetic systems is presented in this work. Our emphasis is put on
theoretical studies of some peptidic systems from scratch, this means from the use high level quantum mechanics
studies of their primary building blocks to the simulation using different computational approaches of their behavior
as part of an entire system in a more realistic environment. The thorough compilation of the derived information and
its potential uses in a proper user-friendly data-storage support is also a question dealt in the thesis.
Conformationaly restricted analogues of arginine, proline and phenylalanine amino acids are designed and fully
characterized using high level quantum mechanics methods. These new non-coded amino acids (non-naturally
occurring amino acids in proteins) demonstrate to modulate the conformational profile of peptides where they are
inserted. Furthermore, they induce resistance to proteolysis altogether with new electronic and spectroscopic features
useful in diagnostics, drug delivery and material engineering. The developed non-coded amino acids are used to
engineer systems such as homing peptides, self-aggregating protein building blocks and peptide-coated active
surfaces.
The remarkable amount of information available about non-coded amino acids in scientific publications stressed out
the dire need of computer-based systems to gather, to organize and to display in a user-friendly way the information
about these compounds. A data base has been designed, implemented and run to store theoretically-obtained
conformational information on non-coded amino acids. The data bases also contains, if available, experimentallyacquired
knowledge such us structural and spectroscopic characterizations and reported applications.
To conclude, this thesis offers a successful approach to the computer-aided engineering and information
management of bioinspired systems from their basics to high complexity design.
|
150 |
Estudis estructurals de complexos de les proteïnes HMG amb DNASánchez Giraldo, Raquel 24 October 2014 (has links)
High Mobility Group proteins (HMG) are architectural factors involved in modulating chromatin structure and influencing a myriad of cellular processes such as transcription, replication and DNA repair. Altered levels of expression and mislocalization of these proteins have several pathological outcomes such as cancer and inflammatory processes.
Understanding how the different HMG proteins recognize DNA and which changes can induce in it is still a challenge, and will be of great importance to interpret their activities in vivo. For this purpose, the aim of this work is to obtain the atomic structure of HMG proteins in complex with DNA using X-ray crystallography.
In this work, we have studied two HMG families: HMGA and HMGB. Both bind to the minor groove of the DNA but are distinguished by their binding motifs: AT-hook motif (HMGA) and HMG-box motif (HMGB). AT-hooks are short positively charged flexible segments that bind preferentially to AT rich regions whereas HMG-box domains contain ~75 amino acids and have a characteristic L-shaped fold consisting of three a-helices and bind to DNA with limited or no sequence specificity.
We have expressed and purified the HMGA1a protein, the fragment HMGA1b(1-79), the fragments Box A, Box B and Box A+B of the HMGB1 and the NHP6A (yeast HMGB). We have performed crystallographic assays of the complexes of AT rich oligonucleotides with these proteins (as well as with synthetic peptides corresponding to the AT-hook motif). We have studied the packing of some of the obtained crystals.
As a major contribution of this thesis, we report the crystal structure of the HMGB1 Box A domain bound to the oligonucleotide ATATCGATAT at a resolution of 2 Å. It demonstrates a new mode of DNA recognition for HMG-box proteins. Two Box A domains act together kinking the DNA by 85º. In this unusual configuration the Phe37 of both domains stack together and intercalate the same CG base step. This duplex shows the greater distortion in just a base pair step that we have evidence for complexes with HMG-box domains. / Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són considerades com a factors arquitectònics del DNA que modifiquen l'estructura de la cromatina afectant així diversos processos cel·lulars com la transcripció, la replicació i la reparació del DNA. L'alteració en els nivells d'expressió normals d'aquestes proteïnes i la seva deslocalització estan relacionades amb nombrosos processos patològics com ara el càncer o la inflamació. Per a poder interpretar l'activitat de les proteïnes HMG in vivo és molt important entendre els mecanismes de reconeixement en la unió al DNA que presenten les diferents famílies d'HMG així com els canvis que poden provocar en aquest, fet que representa encara un repte. Amb aquesta finalitat, en aquest treball ens hem proposat obtenir l'estructura atòmica dels complexos de diverses proteïnes HMG amb DNA mitjançant cristal·lografia de raigs X. Hem treballat amb dues famílies de proteïnes HMG: les HMGA i les HMGB. Ambdues s'uneixen al solc menor del DNA però es diferencien pels seus motius d'unió: motiu AT-hook (les HMGA) i motiu HMG-box (les HMGB). Els AT-hooks són cadenes curtes bàsiques i flexibles que s'uneixen preferentment a regions riques en ATs, mentre que els dominis HMG-box, compostos per uns 75 aminoàcids, presenten una forma d'L constituïda per tres hèlixs alfa i una especificitat de seqüència d'unió al DNA reduïda o inexistent. Durant el transcurs d'aquest treball s'han expressat i purificat la proteïna HMGA1a, el fragment HMGA1b(1-79), els fragments corresponents al Box A, Box B i Box A+B de l'HMGB1 i la proteïna NHP6A (HMGB de llevat) i s'han dut a terme assajos cristal·logràfics dels complexos d'oligonucleòtids rics en ATs amb aquestes proteïnes (així com amb pèptids sintètics corresponents als motius AT-hook). S'ha pogut estudiar l'empaquetament d'alguns dels cristalls obtinguts d'aquests complexos. L'aportació més important d'aquesta tesi és la resolució de l'estructura tridimensional d'un complex del domini Box A de l'HMGB1 amb l'oligonucleòtid ATATCGATAT a una resolució de 2 Å. Aquesta demostra un nou mode de reconeixement de DNA lineal per part dels dominis HMG-box. En l'estructura, dos dominis Box A s'uneixen a un mateix dúplex de DNA provocant un doblegament d'aquest de 85º. En aquest mode d'unió inusual, les Phe37 d'ambdós dominis s'intercalen en el mateix pas CG. Aquesta estructura presenta un dúplex amb la major distorsió en un únic pas de la que tenim constància per un complex del domini HMG-box.
|
Page generated in 0.037 seconds