The ferric hydroxamate uptake (Fhu) system of Escherichia coli transports ferric hydroxamate-type siderophores. This system comprises outer membrane (OM) receptor FhuA, periplasmic binding protein FhuD, and ABC permease FhuB/C. In addition, transport through FhuA requires energy input provided by the cytoplasmic membrane (CM)-embedded TonB/ExbB/ExbD multi-protein complex. / This thesis focuses on identification and characterization of protein-protein interactions that facilitate siderophore transport. Phage display technology predicted protein-protein interactions involved in TonB-dependent transport; peptide motifs predicted to bind TonB were identified from phage panning experiments using purified TonB. Peptide sequences that were displayed on TonB-interacting phage were similar to sequences of periplasm-exposed regions on FhuA and therefore predicted FhuA regions that TonB might bind to. Binding to these regions was confirmed by ELISA; predicted TonB-binding sequences were fused to maltose-binding protein (MBP) and binding to TonB was confirmed by immunoreactivity towards monoclonal antibodies directed against MBP. / TonB was also found to bind FhuD. Peptide sequences displayed on TonB-binding phage identified regions within FhuD to which TonB was predicted to bind. Furthermore, phage panning experiments against purified FhuD predicted complementary regions on TonB that FhuD was predicted to bind. Binding between TonB and FhuD was confirmed in vitro. Accordingly, biophysical methods confirmed that TonB and FhuD formed a 1:1 siderophore-independent complex with an affinity (KD) ranging from 20-200 nM. / Further analyses demonstrated that regions proximal to TonB's C-terminus were essential for interaction with FhuD. Binding was characterized between FhuD and three periplasmic TonB derivatives: a derivative possessing residues 33-239, a derivative with a deletion of TonB's central proline-rich region, and a derivative possessing residues 103-239. Surface plasmon resonance technology confirmed that all derivatives bound FhuD in concentration-dependent manners with similar low nanomolar affinities. TonB-derived oligopeptides that were predicted to bind FhuD were computationally docked to a FhuD crystal structure. Docking solutions suggested that, when bound to TonB in vivo, FhuD's siderophore binding site would orient towards the OM where it could bind siderophore as it emerges from FhuA's lumen during transport. These findings increase our knowledge of TonB-dependent transport by delineating regions of interaction between protein partners of a siderophore transport system. / Le transport des sidérophores de type hydroxamique de la bactérie Escherichia coli est effectué par le système d'acquisition du fer hydroxamique (Fhu) qui comprend FhuA, le récepteur de la membrane externe, FhuD, une protéine périplasmique de liaison et FhuB/C, une perméase de type ABC. De plus, pour effectuer le transport, FhuA requiert de l'énergie qui lui est fournie par le complexe de protéines TonB/ExbB/ExbD situé dans la membrane cytoplasmique. / Cette thèse se concentre sur l'identification et la caractérisation des intéractions protéine-protéine impliquées dans le transport des sidérophores. La technique de phage display, en déterminant des motifs peptidiques qui se lient à la protéine TonB, a permis d'identifier des intéractions protéine-protéine impliquées dans le transport TonB-dépendant. Les séquences peptidiques de phage qui se sont liées à la protéine TonB correspondent à des régions de FhuA exposées au périplasme, ce qui permet d'avancer que les deux protéines entrent en contact en ces endroits. Pour confirmer ces résultats, les séquences peptidiques présumées se lier à TonB ont été fusionnées à la protéine de liaison du maltose (MBP) pour être testées contre TonB par ELISA. L'immunoréaction de ces constructions avec des anticorps monoclonaux contre MBP ont permis de confirmer ces intéractions. / TonB se lie aussi à FhuD. La séquence peptidique des phages qui ont liés TonB correspond à certaines régions de la protéine FhuD. De plus, l'utilisation de phage display contre FhuD a permis de déterminer une autre série de séquences peptidiques qui correspondent à la protéine TonB. Ensemble, ces deux séries de séquences peptidiques identifient des sites d'intéractions complémentaires entre FhuD et TonB. Des méthodes biophysiques ont permis de confirmer l'intéraction entre TonB et FhuD in vitro. Celles-ci montrent la formation d'un complexe ayant une stoechiométrie de liaison de 1:1 ayant une affinité (KD) se situant entre 20 et 200 mM et qui est indépendante de la présence d'un sidérophore. / Des analyses plus poussées ont permis de démontrer que la région la plus proche de l'extrémité carboxy-terminale de TonB était essentielle pour l'intéraction avec FhuD. Les caractéristiques de liaison entre FhuD et trois différentes constructions de TonB ont été étudiées: une construction incluant les acides aminés 33 à 239, une construction dénuée de la partie centrale riche en proline et une construction comprenant les acides aminés 103 à 239. La technique de résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de confirmer l'intéraction entre FhuD et les trois différentes constructions comme étant dépendante de leur concentration et ayant un niveau d'affinité similaire d'ordre nanomolaire. / L'intéraction entre FhuD et les séquences de peptides de TonB prédites a été étudié par simulation informatique d'ancrage avec la structure cristalline de FhuD. Les résultats obtenus suggèrent que lorsque FhuD se lie à TonB in vivo, il se positionne de façon à ce que le site de liaison du sidérophore s'oriente vers la membrane externe, d'où il pourrait se lier avec le sidérophore dès que celui-ci quitte la cavité de FhuA. Ces résultats améliorent notre compréhension du transport TonB-dépendant en cernant plus précisément les régions d'intéraction entre les différentes protéines impliquées dans l'acquisition des sidérophores.

Previous research has demonstrated that the DosR/DosS two-component signaling system is constitutively overexpressed in modern Beijing strains of Mycobacterium tuberculosis (M. tb). It is hypothesized that constitutive overexpression of this regulatory system is related to the unique pathogenic properties reported for this important strain lineage. Within this thesis we attempted to determine the cause of this overexpression phenotype. We first compared known DosR signaling stimuli between different strains of M. tb, looking specifically at NO (nitric oxide) and redox (reduction-oxidation) balance. We demonstrated that there was no difference in endogenous NO production between strains, but we showed that there was a significantly more reductive NADH/NAD pool in modern Beijing strains. To determine the specific factor responsible, we transformed four independent strains of M. tb with a DosR-dependent XylE reporter and developed a novel colony-screening assay to determine DosR activity. We then performed whole-genome transposon mutagenesis to screen for genes that are potentially able to modify DosR expression and/or activity. After screening ~80,000 transductants, we identified 49 genes that appear to influence reporter activity. Surprisingly, when analyzed by qRT-PCR, we were not able to demonstrate a modulation in dosR expression for any of these putative candidates, which suggested that expression of our reporter was being modified in a DosR-independent manner. Further analysis has revealed that many candidate genes directly affect the activity of the reporter protein by modulating H2O2 levels within the bacteria. Intriguingly, this lead us to the observation that modern Beijing strains have elevated catalase activity compared to other strains of M. tb. This work further characterizes the unique properties of the Beijing lineage of M. tb and identifies a novel phenotype that may be associated with its pathogenesis. / Des recherches antérieures ont démontré que le système de signalisation DosR/DosS est surexprimé dans les souches de Beijing moderne, une sous-catégorie du Mycobacterium tuberculosis (M tb). Une hypothèse explique que la surexpression du système règlementaire est la raison des propriétés plus pathogénique de la souche Beijing moderne. Dans cette thèse, nous avons fait une tentative pour trouver la cause de la surexpression. Pour débuter, les stimuli de signalisation DosR connu a été comparé entre différentes souches de M. tb, en regardant spécifiquement les données concernant l'oxydenitrique (NO) et l'équilibre d'oxydo-réduction (redox). Nous avons démontré que la production NO endogène est semblable aux autres souches. Par contre, nous avons prouvé que les souches Beijing moderne expriment une plus grande proportion de NADH/NAD, ce qui lui donne une propriété plus réduisant que les autres souches. Pour trouver l'unique facteur responsable, nous avons transformé quatre souches de M. tb possédant un reporteur DosR-dépendant et développé une analyse innovatrice : un criblage de colonie. Ceci a pu évaluer l'activité du DosR. Ensuite, nous avons exécuté une mutagénèse utilisant un transposon pour déterminer les gênes capables de modifier l'expression et/ou l'activité du DosR. Après l'analyse d'environ 80,000 colonies, nous avons identifié 49 gênes qui semblaient avoir influencé l'activité du reporteur. À notre surprise, vérifiant l'analyse du qRT-PCR sur nos bactéries, nous étions incapable de démontrer une modulation dans l'expression du dosR. Ceci suggérait donc que l'expression du reporteur était en fait modifiée de manière indépendante du DosR. De plus profondes analyses ont révélé que plusieurs gênes bactériennes, dont nous avons antérieurement identifié, jouent directement un rôle sur l'activité du reporteur en contrôlant les niveaux de H2O2 de la bactérie. Cette découverte a mené à la conclusion que les souches Beijing moderne ont un niveau plus élevé de catalase comparé aux autres. En outre, cette thèse s'interroge plus profondément sur les propriétés uniques de la souche Beijing moderne et identifie un nouveau phénotype qui pourrait être associé au pathogène.

Gram-negative bacteria such as Escherichia coli possess a cell envelope composed of an outer membrane (OM) and a cytoplasmic membrane (CM). Widespread antibiotic resistance among these bacteria has necessitated the elucidation of novel therapeutic targets. Scarce nutrients such as iron and vitamin B12 cross the OM by energy-dependent transport. Since the OM lacks a source of energy, bacteria couple the energized CM to drive this process. The TonB-ExbB-ExbD integral membrane protein complex in the CM harnesses the proton gradient and transduces this energy to OM receptors. Despite decades of informative genetic and biochemical research, limited structural and functional information is available on this complex. In particular, only partial structures of the periplasmic domains of TonB and ExbD are known and all structural information is lacking for ExbB, considered to be the scaffold protein of the complex. Furthermore, the stoichiometry of the complex and the putative proton translocation pathway remain controversial. To gain insight into the molecular mechanisms of bacterial scarce nutrient transport, we produced, purified and characterized the ExbB and ExbD proteins before initiating lipid-based crystallization trials. The proteins were produced in milligram amounts and purified as a complex. The complex was found to be ~400 kDa and monodisperse by analytical size exclusion chromatography (SEC). Nuclear magnetic resonance-based detergent quantitation identified excess detergent that concentrated as a function of protein concentration. This led to greater apparent molecular weight of the complex by SEC. The excess detergent was able to be diminished by adsorbent beads or exchanged to a related, dialyzable detergent. Bicelle and in meso crystallization trials were initiated with purified ExbB-ExbD complexes, with promising leads identified. Optimization is ongoing to develop X-ray diffraction-quality crystals of ExbB-ExbD. These preliminary successes have formed the basis for the pursuit of ExbB-ExbD complex structure determination by lipid-based crystallization, a key to understand scarce nutrient import in Gram-negative bacteria. / L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques est rendue nécessaire par la fréquence des cas de résistance aux agents antimicrobiens chez les bactéries. Les bactéries à Gram négatif tel Escherichia coli possèdent une enveloppe cellulaire constituée d'une membrane externe (ME) et d'une membrane cytoplasmique (MC). Par ailleurs, les nutriments rares tel le fer et la vitamine B12 doivent traverser la ME par un transport exigeant de l'énergie. Cependant, puisque la ME est dénuée d'une source d'énergie, les bactéries doivent la coupler à la MC énergisée pour alimenter ces processus de transport. On sait déjà que le complexe protéique membranaire TonB-ExbB-ExbD, situé à la MC, harnache la force proton-motrice et achemine l'énergie aux récepteurs de la ME. Malgré des décennies de recherche sur la génétique et la biochimie de ce complexe, on ne dispose que d'informations limitées sur sa structure et sa fonction. En particulier, seules les structures des domaines périplasmiques de TonB et ExbD sont connues et aucune information structurale n'est disponible pour ExbB, dont le rôle de protéine d'échafaudage est connu. Qui plus est, la stoechiométrie du complexe et le chemin supposé des protons à travers la MC restent sujets à controverse. Afin de mieux connaître les mécanismes moléculaires du transport des nutriments rares chez les bactéries à Gram négatif, nous avons produit, purifié et charactérisé les protéines ExbB et ExbD et avons démarré des essais de cristallisation en phase lipidique. Nous arrivons à produire plusieurs milligrammes de ces protéines sous la forme d'un complexe. Par filtration sur gel (FG), nous avons évalué le poids moléculaire du complexe, qui est monodispersé, à ~400 kDa. En outre, nous avons établi par résonance magnétique nucléaire que nos échantillons d'ExbB-ExbD contenaient un excès de détergent et que la concentration de ce dernier et celle du complexe étaient corrélées. De ce fait, la taille du complexe parait plus élevée par FG. Nous avons diminué le surplus de détergent grâce à des billes adsorbantes ou en échangeant le détergent pour un amphiphile similaire mais dialysable. Nos essais de cristallisation d'ExbB-ExbD in meso et en bicelles ont identifié des pistes prometteuses. Des efforts d'optimisation sont en cours pour développer des cristaux d'ExbB-ExbD d'une qualité permettant la diffraction des rayons X. Ces réussites préliminaires permettent de poursuivre les efforts de cristallisation du complexe ExbB-ExbD en phase lipidique et ouvrent la voie à la résolution de sa structure. Une telle structure serait une contribution importante à notre compréhension du transport des nutriments rares chez les bactéries Gram-négatives.

Arsenic contamination of groundwater sources is a major issue worldwide. Over 100 million people are estimated to be exposed to toxic levels of arsenic. Effective methods of detection are thus greatly needed as preventive measures. Recently, arsenic-detecting bacterial biosensors have been developed to replace the chemical detection methods. Issues with stability and specificity however, have limited their use in the field. There is thus a pressing need for a better method of detection. In an effort to develop a fungal biosensor for arsenic, we first identified seven putative arsenic metabolism and transport genes in Aspergillus niger, a widely-used industrial organism that is generally regarded as safe (GRAS status granted by the U.S. Food and Drug Administration). Among the genes tested for expression in response to arsenate, a putative plasma membrane arsenite efflux pump acrA, displayed an over 200-fold increase in gene expression in response to arsenate. We characterized the function of this A. niger protein in arsenic efflux by gene knockout and confirmed that AcrA was located at the cell membrane using an eGFP fusion construct. Based on our observations, we developed a putative biosensor strain containing a construct of the native promoter of acrA fused with egfp. We analyzed the fluorescence of this biosensor strain in the presence of arsenic using confocal microscopy and spectrofluorimetry. The biosensor strain reliably detected both arsenite and arsenate in the range of 1.8-180 μg/L, which encompass the threshold concentrations for drinking water set by the World Health Organization (10 and 50 μg/L). / La contamination de la nappe phréatique par l'arsenic est un problème récurrent à travers le monde, car plus de 100 millions de personnes sont exposés à des niveaux d'arsenic jugés toxiques. Ainsi, des méthodes de détection efficaces sont nécessaires pour assurer une meilleure prévention. Récemment, plusieurs biocapteurs bactériens pour la détection de l'arsenic ont été développés pour remplacer les dosages chimiques. Cependant, des problèmes de stabilité et de spécificité ont limité leur usage. Afin de développer un biocapteur fongique pour la détection de l'arsenic, nous avons choisi Aspergillus niger, un organisme bien connu pour ses applications industrielles, et ayant l'avantage d'être classifié comme non pathogène, ou G.R.A.S. (Generally Regarded As Safe permis par U.S. Food and Drug Administration). Premièrement, nous avons identifié sept gènes hypothétiquement impliqués dans le métabolisme et le transport de l'arsenic chez A. niger. L'étude de l'expression de ces gènes en présence d'arséniate a révélé que le gène codant pour la pompe hypothétique AcrA est surexprimé d'un facteur 200 après une exposition à l'arséniate. Nous avons ensuite réalisé l'étude de la fonction de la protéine AcrA dans le pompage de l'arsenic, puis la confirmation de sa localisation au niveau de la membrane plasmique. Pour ce faire, nous avons réalisé la délétion du gène acrA, puis nous avons introduit dans la même souche une fusion du promoteur de acrA avec egfp, codant pour la protéine fluorescente eGFP. Après avoir confirmé fonction et localisation, nous avons construit et validé un biocapteur, en transformant une souche d'A. niger avec le promoteur du gène acrA fusionné avec l'ORF du gène egfp. Enfin, nous avons quantifié la fluorescence émise par le biocapteur en présence de l'arsenic, par imagerie confocale et par spectrofluorimétrie. Notre souche d'A. niger transformée a permis de détecter de façon reproductible l'arsénite et l'arséniate dans une gamme de concentrations de 1.8 à 180 μg/L. Cette gamme inclut les concentrations seuils pour l'eau potable telles qu'établies par l'Organisation Mondiale de la Santé (10 et 50 μg/L).

Membrane proteins (MPs) are the coveted, yet elusive, targets of structural genomics, structural proteomics, and the pharmaceutical industry. Characterized by amphiphilic surfaces, and lipid stabilized in vivo, MPs require unique combinations of detergent and additives for solubility and stability in vitro. We sought to bypass the exhaustive, and often unsuccessful exploration of detergents and additives for our target hemoglobin binding protein (HgbA): a 105 kDa, 22-stranded ß-barrel outer membrane protein (OMP) from Actinobacillus pleuropneumoniae. To address requirements of structural studies for milligram amounts of soluble target protein, a novel series of fractionating steps was developed to extract and isolate soluble HgbA. Two well established OMP properties were exploited in this pursuit: sarkosyl-insolubility and a robust structural architecture. Total membrane solubilization by sarkosyl detergent was modified for efficiency and fractionated insoluble OMPs from cytoplasmic membrane and soluble cytoplasmic proteins. Liberation of HgbA from the insoluble fraction required treatments more aggressive than variations of detergent and additives. Rigidified with extensive hydrogen bonding, the structural tolerance of ß-barrel proteins was exploited against elevated temperatures. Heat treatment of insoluble OMP fractions at 55 oC preferentially solubilized HgbA yielding 5mg HgbA per litre culture that retained its ability to bind hemoglobin. Protein profiles of these extraction products resolved one major band representing excess amounts of HgbA in the presence of limited quantities of minor species. This extraction protocol produces high quality HgbA that is markedly enriched from fractions that are otherwise inaccessible. Such preparations are advantageous for structural studies as well as promising for application to other ß-barrel proteins. / Les protéines de la membrane externe (OMPs) sont les plus en demande pour les études structurales et pharmacologiques, mais sont en même temps les plus difficiles à travailler. Ces protéines, qui sont caractérisées par des surfaces amphiphiles et stabilisées par les lipides in vivo, requièrent des combinaisons uniques de détergents et d'additifs pour les solubiliser et les stabiliser in vitro. Pour des études structurales, nous avons voulu étudier la protéine HgbA (hemoglobin binding protein), une OMP de 105 kDa de la bactérie Actinobacillus pleuropneumoniae, comportant 22 feuillets ß antiparallèles organisés en un tonneau transmembranaire. Comme ces études demandent une grande quantité de protéine soluble, nous avons développé une nouvelle méthode d'extraction et d'isolation de HgbA par fractionnation, qui va au-delà du choix d'un détergent et d'un additif. Nous avons décidé d'exploiter deux propriétés établies des OMPs: leur insolubilité dans le détergent sarkosyl ainsi que leur structure robuste. Les OMPs ne sont pas solubilisées dans le sarkosyl et peuvent ainsi être séparées des protéines du cytoplasme et de la membrane interne. L'isolation de HgbA à partir de la fraction insoluble s'est avérée nécessiter des procédés plus agressifs que la combinaison de détergents et d'additifs. Les protéines à tonneau ß sont stabilisées par de nombreuses liaisons hydrogène, et de ce fait présentent une forte résistance structurale aux hautes températures. L'incubation à 55 oC de fractions OMP insolubles a ainsi permis de solubiliser préférentiellement HgbA, avec un rendement de 5 mg par litre de culture et une préservation de sa capacité de se lier à l'hémoglobine. La résolution de cette fraction solubilisée sur un gel SDS-PAGE montre une bande majeure, correspondant à une grande quantité de HgbA, ainsi qu'un nombre faible d'espèces mineures. Ce protocole d'extraction permet un fort enrichissement en

Enteropathogenic and Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EPEC and EHEC) utilize a type three secretion system to secrete effector proteins directly into the cytoplasm of infected host cells. NleA, (non-LEE encoded effector A) is an effector that localizes to the Golgi and is necessary for virulence. NleA associates tightly with membranes of infected cells, in a manner similar to integral membrane proteins, and bioinformatics predicts two putative transmembrane domains in NleA. Here, we utilize immunofluorescence microscopy in conjunction with selective permeablization of the EPEC infected host cell plasma membrane to determine the accessibility of different domains of NleA to specific antisera. All domains of NleA examined were found to be cytoplasmically exposed, suggesting that NleA interacts with the Golgi as a peripheral membrane protein. These findings indicate the need for further study of NleA association with the host cell Golgi membrane. / Les Escherichia coli entéropathogéniques (EPEC) et les Escherichia coli entérohémorrhagiques (EHEC) utilisent un système de sécrétion de type III afin d'injecter des protéines effectrices directement dans le cytoplasme des cellules hôtes infectées. NleA (non-LEE encoded effector A) est une protéine effectrice essentielle à la virulence qui, une fois injectée dans la cellule hôte, est localisée à l'appareil de Golgi. NleA s'associe fortement aux membranes des cellules infectées de façon similaire aux protéines intégrales de membrane; la bioinformatique prédit qu'il existe deux domaines transmembranaires putatifs chez NleA. Dans cette étude, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence ainsi que des techniques de perméabilisation sélective et spécifique pour la membrane plasmique des cellules hôtes infectées par les EPEC afin de déterminer l'accessibilité des différents domaines de NleA à des antisérums spécifiques. Tous les domaines de NleA examinés ont été localisés du côté cytoplasmique, suggérant que NleA interagit avec l'appareil de Golgi de manière similaire à une protéine de membrane périphérique. Ces résultats démontrent la nécessité d'étudier plus en détails l'association de NleA avec la membrane de l'appareil de Golgi de la cellule hôte.

Semiconductor nanocrystals known as quantum dots (QDs) are emerging as an important new class of fluorescent probes in cell biology due to their many advantageous optical properties. Various methods have devised that allow for the selective targeting of QDs to biological cells. Conjugation of QDs to small biomolecules has proven effective, allowing for their uptake into mammalian cell lines. We explored the use of folate conjugated QDs in the selective targeting of model cell lines known to have high expression of the folate receptor (FR). Characterization of QDs and QD conjugates is examined using techniques such as spectroscopy, transmission electron microscopy, dynamic light scattering, and zeta potential measurements. Uptake of QDs into cells is examined using both epifluorescence microscopy with multispectral imaging as well as confocal microscopy. Finally the implications for the selective targeting of QDs into cells via the FR are discussed, given their potential use in photodynamic therapy. / À cause de leurs multiples et uniques propriétés optiques, les nanocristaux semi-conducteurs ou points quantiques (PQs) émergent comme une nouvelle classe de sondes fluorescentes en biologie moléculaire. Diverses méthodes ont été conçues pour optimiser l'interaction des PQs avec les cellules biologiques. La conjugaison de PQs à de petites biomolécules est efficacement maîtrisée, permettant ainsi leur entrée dans une variété de cellules. Nous avons exploré l'utilisation des conjugués foliques de PQs dans l'interaction sélective avec une variété de cellules modèles connues pour avoir des niveaux élevés de récepteurs foliques (FR). La caractérisation des PQs ou des conjugués de PQs est examinée en utilisant une variété des techniques. La prise de PQs par des cellules est examinée aussi bien avec la microscopie d'épifluorescence, qu'avec la microscopie confocale. Enfin, vu leur potentiel d'application en thérapie photo dynamique, les implications d'une meilleure interaction entre les PQ et les cellules ayant des FR sont discutées.

We have investigated the effect of Trypanosoma cruzi on the structural and functional properties of high density lipoprotein (HDL). These studies revealed that infection with T. cruzi leads to truncation of apoA-I with subsequent loss of HDL species, most notably, poorly lipidated prebeta-HDL subparticles. When lipid-free apoA-I or lipid-reconstituted apoA-I were incubated with various forms of T. cruzi, either alone or during macrophage infection, loss of full-length apoA-I was readily apparent, with concomitant replacement by lower molecular weight peptides. In vitro evidence points to the highly abundant cysteine protease cruzipain as responsible for this degradation. We suggest that degradation of apoA-I alters the functional properties of HDL, as indicated by the increased levels of cholesterol efflux achieved by T. cruzi infected mice. Since HDL is a known modifier of the macro- and microvasculature, these functional alterations may be partially responsible for the vascular abnormalities seen in chronic chagasic cardiomyopathy. / Nous avons examiné l'effet de Trypanosoma cruzi sur les propriétés structurelles et fonctionnelles des lipoproteins de haute densité (HDL), constituées d'apoA-I et reconnue pour leur rôle dans le système atheroprotective. Ces études ont révélé que l'infection avec T. cruzi mène à la troncation d'apoA-I avec la perte de certaines particules HDL, notamment, le prebeta-HDL. Lors de l'incubation de d'apoA-I avec diverses souches de T. cruzi, seul ou en présence du macrophage, la molécule d'apoA-I se transforme à des peptides de poids moléculaires inférieurs. Les résidus cysteine fortement abondant dans la structure de la protease cruzipain sont responsables de la dégradation d'apoA-I. Nous suggérons que la trancation d'apoA-I change les propriétés fonctionnelles du HDL, comme indiqué par l'augmentation la désorption du cholestérol cellulaire en présence du HDL des souris infectées. Il est connu que le HDL est un modificateur de la macro- et microvasculature, ces changements fonctionnels peuvent être partiellement responsables des anomalies vasculaires comme la cardiomyopathie chronique chez les patients atteints de cette maladie.

Specific immunotherapy (SIT) treatment of allergies is the controlled administration of a specific allergen to an allergic patient towards the alleviation or remediation of the disease. Successful immunotherapy is associated with a shift in the immune response from type 2 to type 1 phenotype away from IgE production. But the main obstacles in SIT include the need for a standardized source for the allergen and for an adjuvant/delivery system that would promote type 1 immunity to allergens. This work focuses on the recombinant expression of European birch (Betula verrucosa) pollen's main allergen Betv1a with covalent modifications with hydrophobic structures whose additions were made to increase immunogenicity and to facilitate the process of complexing to the hydrophobic Proteosome adjuvant/delivery system. Proteosomes consist of outer membrane proteins extracted from Neisseria meningitidis which are known to favor type 1 immunity to antigens. (Abstract shortened by UMI.)

Superantigens (SAgs) are bacterial (bSAgs) or viral (vSAgs) proteins that can trigger a large number of T lymphocytes bearing specific Vbeta regions. This results in either anergy or deletion of those activated T cells. SAgs have long been implicated in various disease as well as autoimmune conditions. SAgs require binding to the Major Histocompatability Complex (MHC) class II molecules on antigen presenting cells (APC) to be presented to their responsive T cells. The work presented in this thesis represents a study of the different cellular factors implicated in MHC class II maturation pathway that could affect its ability to present viral SAgs and how this affects the functional outcome for SAg induced stimulation. Here, we show that the binding site of vSAgs on MHC class II molecules spans the peptide-binding groove and is highly affected by the nature of the peptide present in the groove. In addition, cellular factors that can alter the peptide repertoire presented by MHC class II molecules like MHC polymorphism and chaperones e.g. HLA-DM have a drastic effect on vSAg function. In the second part of the study we address the role of proteolytic processing in vSAg function. Unlike what was previously observed, we demonstrate that vSAg processing by pro-protein convertases is not essential for vSAg activity. In addition, we demonstrate alternative proteolytic processing by the cathepsin family of proteases. This study delineates the different modes of interaction of bacterial versus retroviral superantigens with MHC class II molecules. While bSAgs are potent stimulators of the immune system that resemble nominal peptide antigens in their kinetics of interaction with the TCR, they bind MHC and are presented in a different manner. On the contrary, vSAg interaction with both MHC and the TCR and their processing requirement tend to mimic more closely interaction of nominal peptide antigens.