Transport of iron-siderophores and vitamin B12 across the outer membrane (OM) of Gram-negative bacteria requires energy from the proton motive force delivered by the TonB/ExbB/ExbD complex. TonB-dependent OM receptors such as FhuA, FepA, FecA and BtuB possess a Ton box: a conserved motif located proximal to their N-terminus that has been shown to interact with TonB. However, other sites on OM receptors have been proposed to participate in interactions with TonB. To identify novel sites of interactions with TonB, we selected TonB-binding peptides from a random library of peptides displayed on phages. Fifteen peptides displayed sequence similarities to known TonB-dependent OM receptors. Of the fifteen, eight were mapped to regions of FhuA, FepA and FecA for which crystal structures are available. DNA sequences for selected peptides were fused to malE and displayed at the N-terminus of the E. coli maltose binding protein (MBP) for further characterization. Surface plasmon resonance experiments revealed that when the peptides were monovalently displayed on MBP, they retained TonB-binding activity thereby permitting assessments of their binding characteristics. In vitro and in vivo assays demonstrated that only FhuA-mapping peptides could disrupt TonB-FhuA interactions, indicating that TonB selectively binds to multiple regions distinct for each OM receptor.

Mouse serum amyloid A 1 (SAA1), an apolipoprotein is found in the serum complexed with high density lipoprotein (HDL). Expression of SAA1 is increased during acute phase response following infection, inflammation or trauma. Evidence shows that SAA1 is cleared from the circulation following endocytosis by macrophages and endothelial cells; incomplete degradation of SAA1 leads to intracellular AA fibril formation and induction of life-threatening systemic AA amyloidosis. In this context, at least two important mechanisms remain to be elucidated: first, identification of putative SAA receptors mediating endocytosis of SAA by activated monocytoid cells, and second, the conditions that promote intracellular amyloidogenesis. The data presented in this thesis address the first query. / To characterize the putative SAA receptor protein, mouse recombinant SAA1 (rSAA1) was generated and purified using gel filtration, immunoaffinity and GST affinity purification methods. (Abstract shortened by UMI.)

p-Cumate-2,3-dioxygenase (CDO) from Pseudomonas putida F1 converts p-cumate to cis-2,3-dihydroxy-2,3-dihydro-p-cumate, a potential useful acid cis-diol. To enhance the activity of CDO for the production of this acid cis-diol, the recombinant CDO expressed in Escherichia coli Top10 strain was evolved by directed evolution using the error-prone polymerase chain reaction (EP-PCR) method. The mutant library was screened in a 96-well format based on the enzyme's ability to transform colorless indole-2-carboxylate to the water-insoluble blue dye indigo. Screening of 300 colonies resulted in four variants, termed CDO1, CDO2, CDO3, CDO4, that have increased ability (15-38%) in the transformation of indole-2-carboxylate compared to the wild type. Determination of the specific enzyme activity of the four variants confirmed that the activity of CDO1 and CDO4 have increased 20.2% and 28.7%, respectively, while CDO2 and CDO3 have only a slight increase (4.5% and 7.6% respectively). DNA sequencing and deduced amino acid analysis of the mutated region of CDO1 and CDO4 revealed that the histidine at position 345 of CmtAa in CDO1 was substituted with leucine (H345L); in CDO4, the glutamic acid at position 37 of CmtAc was substituted with alanine (E37A). CDO1 and CDO4 can serve as templates for further round of EP-PCR mutagenesis.

The present study focuses on the development of a two-stage, self-cycling process for the production of bacteriophages, viruses which use bacteria as host. The first stage, operating as a self-cycling fermentation (SCF) is used to grow and synchronize the host population. The synchronized host population is passed to the second stage, operated as a self-cycling infection (SCI), where the infection and phage production occurs. Both stages are automated and they are decoupled from one another. Escherichia coli and bacteriophage T4 were used as a model host/virulent phage system for the development of this process. From the initial experiments with E.coli, it was found that the SCF could be efficiently and reliably operated using the derivation of carbon dioxide evolution rate (CER) as the control parameter. A significant level of synchronization was obtained after 3 cycles. It was found that synchronization led to a slower cell metabolism and that cell division occurred in the middle of the SCF cycle. These facts were surprising as they differed from observations made in previous SCF synchronization studies performed with other microorganisms. Experiments were conducted to determine an appropriate control parameter for the second stage of the system - the SCI. CER and CER-derived data proved to be not only well-behaved parameters for the control strategy, but also provided information on the dynamics of infection throughout the infection process. Five events in the host and phage populations (most notably the onsets of lysis inhibition and of population-wide lysis) were easily identified by features in the CER and CER-derived data. The effects of varying the initial multiplicity of infection (MOI) on both the CER trend and the production of phages were evaluated to determine the optimal conditions to be used for infection in the SCI stage. The CER trends proved to be reliable for a wide range of initial MOIs although the magnitude of the individual values decreased / La présente étude visait le développement d`un procédé auto-cyclant à deux étapes pour la production de bactériophages, des virus ayant pour hôte des bactéries. La première étape, effectuée en fermentation auto-cyclante (SCF), est utilisée pour la croissance et la synchronisation des cellules hôtes. La population d`hôtes synchronisés est ensuite dirigée dans la deuxième étape pour être infectée. Cette étape est effectuée en infection auto-cyclante (SCI), où la production du phage a lieu. Les deux étapes sont automatisées et leur contrôle est découplé. La bactérie Escherichia coli et le phage T4 furent utilisés comme modèle hôte/phage virulent pour le développement du procédé. L`impact de la SCF sur les populations d`E. coli a été étudié. Il a été démontré que la SCF pouvait être opérée efficacement et de façon fiable lorsque la dérivée du taux d`évolution du dioxyde de carbone (CER) était utilisée comme paramètre de contrôle. Un niveau de synchronisation significatif fut obtenu après trois cycles. Il a été établi que la synchronisation menait à un ralentissement du métabolisme cellulaire et que la division cellulaire avait lieu au milieu des cycles de SCF. Ces faits étaient étonnants puisqu`ils différaient des observations obtenues lors d`études de SCF faites antérieurement avec d`autres micro-organismes. Des expériences ont été réalisées dans le but d`identifier un paramètre de contrôle approprié pour la deuxième étape du procédé (SCI). Il a été démontré que le CER et sa dérivée étaient, non seulement des paramètres bien définis, mais aussi qu`ils pouvaient fournir de l`information importante sur la dynamique d`une infection. Cinq événements liés aux populations d`hôtes et de virus (entre autres, le début de l`inhibition de la lyse et le début de la lyse de l`ensemble de la population d`hôtes) pouvaient être facilement identifiés grâce à des particularités dans l

Six members of the Actinobacillus minor/"porcitonsillarum" complex, strains 33PN and 7ATS, Actinobacillus minor strains NM305T and 202 and "Actinobacillus porcitonsillarum" strains 0347 and 9953L55, were investigated with respect to iron acquisition and haemolysin production. Haemolytic activity has been used, traditionally, to distinguish A. minor and "A. porcitonsillarum", the latter organism being haemolytic and the former, non-haemolytic. Analyses of whole genome shotgun sequences revealed, however, that A. minor strain 202, like "A. porcitonsillarum", possesses a haemolysin-encoding apxII operon while strain NM305T does not. PCR approaches allowed the amplification of apxII genes from strain 33PN, but not from strain 7ATS, suggesting that strain 33PN, but not 7ATS, also possesses an apxII operon. All six strains produced haemolysins that could lyse rabbit erythrocytes. The erythrocyte specificities of the haemolysins produced by strains 202 and 33PN suggested very strongly that the haemolytic activities exhibited by these organisms were due to ApxII. Analysis of the predicted amino acid sequence of ApxII of strain 202, using the bioinformatics tool MitoProt II, revealed that the N-terminal region of this protein has the potential to serve as a mitochondrial targeting signal. In keeping with the apparent lack of apxII genes in strains NM305T and 7ATS, the haemolysins produced by these organisms were not erythrocyte-specific and haemolytic activity appeared to be due to a combination of heat-labile and heat-stable components.All six strains acquired iron from porcine, bovine and human haemoglobins but not from porcine transferrin. Analyses of whole genome shotgun sequences revealed that strains NM305T and 202 lack not only the transferrin-binding protein genes, tbpA and tbpB, but also the haemoglobin-binding protein gene, hgbA. Strains NM305T and 202, however, were found to possess other putative haemin/haemoglobin-binding protein genes that were predicted to encode mature proteins of ~72 and ~75 kDa, respectively. An affinity procedure based on haemin-agarose allowed the isolation of ~65- and ~67-kDa iron-repressible outer-membrane polypeptides from membranes derived from strains NM305T and 202, respectively, and mass spectrometry revealed that these polypeptides were the products of the putative haemin/haemoglobin-binding protein genes. PCR approaches allowed the amplification and sequencing of homologues of both haemin/haemoglobin-binding protein genes from each of the other four strains, strains 33PN and 7ATS and "A. porcitonsillarum" strains 9953L55 and 0347, suggesting that such proteins are involved in the utilization of haemoglobin-bound iron, presumably as surface receptors, by all six strains investigated. / Six membres du complexe d'Actinobacillus minor/"porcitonsillarum", souches 33PN et 7ATS, souches NM305T et 202 d'Actinobacillus minor, et souches 0347 et 9953L55 d'Actinobacillus 'porcitonsillarum', ont été étudiés en ce qui concerne l'acquisition du fer et la production d'hémolysine. Traditionnellement, l'activité hémolytique a été employée afin de distinguer entre A. minor et 'A. porcitonsillarum', le dernier organisme étant hémolytique tandis que le premier étant non hémolytique. Cependant, l'analyse génomique des séquences entières de shotgun ont indiqués que la souche A. minor 202, tel que 'A. porcitonsillarum', possède un opéron d'apxII qui code pour l'hémolysine alors que la souche NM305T n'en possède pas. Les approches de PCR ont permis l'amplification des gènes d'apxII de la souche 33PN, mais pas de la souche 7ATS, suggérant que la souche 33PN, mais pas 7ATS, possède également un opéron d'apxII. Tous les six souches ont produit des hémolysines qui pourraient lyser des érythrocytes provenant du lapin. Les spécificités d'érythrocyte des hémolysines produites par les espèces 202 et 33PN ont indiqué que les activités hémolytiques de ces souches étaient dues à ApxII. L'analyse de la séquence d'acides aminés de la souche de Apxll 202, en utilisant les outils de bioinformatique MitoProt II, a révélé que la région N-terminale de cette protéine a le potentiel pour servir de signal d'adressage mitochondrial.En accord avec la possibilité d'un manquement de gènes d'apxII chez les souches NM305T et 7ATS, les hémolysines produites par ces organismes n'étaient pas spécifiques à l'érythrocyte et l'activité hémolytique semblait être due par une combinaison des composants labiles à la chaleur et thermostables.Tous les six souches avaient acquis le fer provenant de l'hémoglobines porcines, bovines et humaines mais pas de la transferrine porcine. Les analyses génomiques des séquences entières de shotgun ont démontré que les souches NM305T et 202 manquaient non seulement des gènes codant pour des protéines pouvant lier la transferrine, en particulier le tbpA et du tbpB, mais également le gène hgbA qui code pour le protéine pouvant lier des hémoglobines. Cependant, les souches NM305T et 202 se sont avérées de posséder d'autres gènes putatif codant pour des protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine qui ont été prévus de coder pour des protéines matures de ~72 et ~75 kDa, respectivement. Une procédure d'affinité basée sur l'agarose de haemin a permis l'isolement des polypeptides répressif du fer provenant de la membrane externe des souches de NM305T and 202, respectivement, et ayant une masse entre ~65 et ~67-kDa, tandis que la spectrométrie de masse a démontré que ces polypeptides étaient les produits des gènes putatif codant pour des protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine. Les approches de PCR ont permis l'amplification et le séquencement des homologues de gènes codant pour les protéines pouvant lier le haemin/hémoglobine de chacune des quatre autres souches, notamment les souches 33PN et 7ATS, et souches 9953L55 et 0347 d'A. "porcitonsillarum", suggérant que de telles protéines sont impliquées dans l'utilisation du fer lier a l'hémoglobine, vraisemblablement en tant que des récepteurs trouvant sur la surface, par chacune des six souches étudiées.

Candida albicans is a major fungal pathogen that causes systemic bloodstream infections with high mortality rate in immune-compromised patients. Current treatment of candidiasis involves the use of azoles (the most widely used antifungal agents that target ergosterol biosynthesis) and echinocandins (the latest approved drugs that target cell wall). However, the efficacy of these drugs can be compromised by the emergence of C. albicans drug-resistant strains. Thus, understanding the molecular mechanisms of azole resistance as well as identifying new biological targets are important for the development of novel and effective therapeutic strategies. In this thesis, I report our research findings on the contribution of ABC transporters Cdr1p and Cdr2p to azole resistance in a clinical azole resistant strain and show that Cdr1p is a major determinant of azole resistance. Furthermore, we also discovered that phosphorylation plays a positive regulatory role on Cdr1p function and is important for Cdr1p-mediated azole resistance. In an effort to search for new antifungal targets, we explored the function of genes involved in the acetylation of histone H3 lysine 56 (H3K56) in C. albicans. We found that the gene encoding H3K56 deacetylase Hst3p is essential for cell growth and survival of C. albicans. Inhibition of Hst3p using nicotinamide, a form of vitamin B3, is fungicidal for both drug-susceptible and drug-resistant C. albicans as well as another important human fungal pathogen Aspergillus fumigatus, making it a promising target to develop a novel class of antifungal agents with broad antifungal properties. Taken together, these studies provide fundamental knowledge of molecular determinants contributing to C. albicans azole resistance and pathogenesis. / Candida albicans est un pathogène fongique responsable d'infections systémiques dont le taux de mortalité est élevé chez les patients immunocompromis. À l'heure actuelle, le traitement de la candidose est rendu possible par l'utilisation de deux classes d'agents antifongiques aux modes d'actions distincts : les azoles (les plus couramment utilisés, ils ciblent la biosynthèse de l'ergostérol) et les échinocandines (nouvellement mises sur le marché, elles interfèrent avec la synthèse de la paroi fongique). Toutefois, face à l'émergence de résistances développées par certaines souches de C. albicans l'efficacité de ces antifongiques se trouve compromise. Il est donc capital de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance aux azoles, ainsi que d'identifier de nouvelles cibles biologiques pour permettre le développement d'approches thérapeutiques innovantes et efficaces. Dans ce manuscrit de thèse, je décris nos travaux portant sur la contribution relative des transporteurs ABC Cdr1p et Cdr2p à la résistance aux azoles en utilisant une souche clinique résistante de C. albicans, et démontre que Cdr1p contribue majoritairement à cette résistance. D'autre part, nous montrons que la phosphorylation a un effet positif sur la régulation de Cdr1p, et également que cette modification post-traductionnelle joue un rôle important dans la résistance aux azoles Cdr1p-dépendante. Dans l'optique d'identifier de nouvelles cibles antifongiques, nous avons étudié la fonction des gènes impliqués dans l'acétylation de la lysine 56 de l'histone H3 (H3K56) chez C. albicans. Nous avons découvert que le gène codant pour la déacétylase de H3K56, à savoir Hst3p, est essentiel pour la survie et la croissance cellulaire chez C. albicans. L'inhibition de Hst3p par la nicotinamide, une forme de vitamine B3, a un effet fongicide sur de multiples souches de C. albicans, qu'elles soient normales ou résistantes aux médicaments, ainsi que sur un autre pathogène important chez l'humain, Aspergillus fumigatus, faisant de cette enzyme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux agents antifongiques à large spectre. L'ensemble des connaissances fondamentales générées au cours de mes travaux de doctorat permettra de mieux comprendre certains déterminants moléculaires clés qui contribuent à la résistance de C. albicans envers les médicaments azolés, ainsi qu'à sa pathogénicité.

Lactococcus lactis is a Gram-positive lactic acid bacterium commonly used in the dairy industry. It has been deemed safe for human consumption by the United States Food and Drug Administration and holds Generally Recognised As Safe (GRAS) status. L. lactis is non-pathogenic, non-colonizing and non-invasive. The utility of this bacterium as a cell "factory" able to synthesis heterologous proteins is now well established. Previous work in our lab has also shown that L. lactis has the ability to stimulate the innate immune system. All these properties make L. lactis a suitable vector for biological delivery of antigens to stimulate an immune response.Visceral leishmaniasis is a disseminated protozoan infection, caused by the species of the Leishmania donovani complex, which affects the liver, spleen and bone marrow. There are 500,000 new cases of visceral leishmaniasis every year and 90% of clinical cases are fatal if left untreated. In addition to the disadvantages of high cost and side effects of chemotherapy, there is also emerging resistance of parasites to anti-leishmanial drugs. In light of these facts, the development of a vaccine against visceral leishmaniasis is a priority. We have engineered L. lactis (strains NZ9000 and PH3960) to heterologously express the protective Leishmania antigen, sterol 24-c-methyltransferase (SMT), in the cytoplasm. In separate studies, these strains of L. lactis were assessed for their protective capability as live vaccines against L. donovani in BALB/c mice, both individually and adjuvanted with IL-12-secreting L. lactis. Immune responses to subcutaneous immunizations were monitored by measuring serum antibody titers against SMT and cytokine production from splenocytes upon stimulation by soluble Leishmania antigen at the end point of infection. Mice immunised with SMT-expressing clones of L. lactis NZ9000 had high titers of both serum IgG1 and IgG2a as well as splenocyte cytokine response profiles which demonstrated a mixed Th1/Th2 response. The co-administration of SMT- and murine IL-12-producing L. lactis clones was able to reduce parasite load in the liver significantly in the case of L. lactis NZ9000. Overall, we demonstrated that L. lactis is a suitable vehicle for the delivery of vaccine antigens and generation of protective immune responses against visceral leishmaniasis. / Lactococcus lactis est une bactérie lactique Gram-positive couramment utilisée dans l'industrie laitière. Elle a été jugée sans danger pour la consommation humaine par la "United States Food and Drug Administration" et elle détient le statut "GRAS" (Generally Recognised As Safe). L. lactis est non pathogène, non-colonisatrice et non-invasive. L'utilité de cette bactérie comme une cellule «usine» capable de synthétiser des protéines hétérologues est maintenant bien établie. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont également montré que L. lactis a la capacité de stimuler le système immunitaire inné. Toutes ces propriétés font de L. lactis un vecteur approprié pour l'administration biologique d'antigènes afin de stimuler une réponse immunitaire. La leishmaniose viscérale est une infection protozoaire diffuse, causée par les espèces du complexe Leishmania donovani, qui affecte le foie, la rate et la moelle osseuse. Chaque année, 500,000 nouveaux cas de leishmaniose viscérale sont déclarés et 90% des cas cliniques sont mortels s'ils ne sont pas traités. En plus des inconvénients de coût élevé et les effets secondaires de la chimiothérapie, un autre problème majeur est l'émergence de parasites résistants aux médicaments anti-Leishmania. C'est pourquoi le développement d'un vaccin contre la leishmaniose viscérale est une priorité. Nous avons modifié L. lactis (souches NZ9000 et PH3960) afin qu'elle exprime l'antigène protecteur de Leishmania, stérol 24-C-méthyltransférase (SMT), de façon hétérologue dans le cytoplasme. Dans des études distinctes, ces souches de L. lactis ont été évaluées pour leur capacité de protection comme vaccins vivants contre L. donovani chez la souris BALB/c, individuellement, mais aussi en présence de L. lactis sécrétant de l'IL-12 en tant qu'adjuvant. Les réponses immunitaires à ces vaccinations sous-cutanées ont été suivies en mesurant les titres d'anticorps sériques dirigés contre SMT et la production de cytokines provenant de splénocytes stimulués par les antigènes solubles de Leishmania au point final de l'infection. Les souris immunisées avec les clones de L. lactis NZ9000 exprimant SMT montrent des taux sériques élevés d'IgG1 et d'IgG2a, ainsi qu'un profil de cytokines splénique démontrant une réponse mixte Th1/Th2. La co-administration de clones de L. lactis exprimant SMT et de l'IL-12 murin a permis de réduire la charge parasitaire dans le foie de manière significative dans le cas de L. lactis NZ9000. Dans l'ensemble, nous avons démontré que L. lactis est un vecteur approprié pour l'administration d'antigènes vaccins et la génération de réponses immunitaires protectrices contre la leishmaniose viscérale.

Cranberry-derived materials (CDMs) have recently been shown to block the group associated swarming motility in Pseudomonas aeruginosa without blocking swimming or twitching motilities. However, their mechanism of action is as of yet unknown. We hypothesized that these CDMs interfere with communication pathways important in swarming called quorum sensing (QS) and measured the impact of the CDMs on QS at three levels: QS signalling gene transcription, QS signal production, and activity/production of QS-controlled virulence factors. Crude cranberry powder extract (CP) repressed the las and rhl systems, the two main QS systems in P. aeruginosa, – as measured by the use of a lacZ bioreporter and β-galactosidase assay. CP also reduced the accumulation of both las and rhl QS signals in the medium. Exposure to 5 mg/mL or 10 mg/mL CP stimulated cell growth but still resulted in the reduction of the growth-normalized activity of key virulence factors. Cranberry-derived proanthocyanidins (cPACs) had little direct effect on the regulatory QS gene transcription or QS signal production in P. aeruginosa but reduced the activity/production of key virulence factors. Compounds found in cranberries may be clinically useful; however, further research is required to isolate the active compound(s) from CP and overcome the associated increased cell growth. / Les matériaux dérivés des canneberges (MDC) ont été récemment démontré ayant la capacité de bloquer le mode de déplacement communautaire de type swarming au Pseudomonas aeruginosa sans bloquer les modes de déplacement individuels de type swimming et twitching. Pourtant, leur mode d'action est inconnu. Nous avons supposé que ces MDC interférent avec une voie de communication essentiel pour le mode de déplacement de type swarming appelé quorum sensing (QS), et nous avons mesuré l'impact des MDC sur QS à trois niveaux : la transcription des gènes de signalisation QS, la production des signaux QS, et l'activité/production des facteurs de virulence contrôlées par le QS.L'extrait de canneberges en poudre brut (CP) a réprimé la transcription des gènes de signalisation dans les systèmes las et rhl, les deux systèmes de QS majeurs au P. aeruginosa, utilisant un rapporteur biologique lacZ et un essai β-galactosidase. Le CP a aussi causé une réduction de l'accumulation des signaux pour les systèmes las et rhl dans le médium. L'addition du CP aux concentrations de 5 mg/mL ou 10 mg/mL a stimulé la croissance des cellules mais a aussi réduit l'activité et la production de plusieurs facteurs de virulence. Les proanthocyanidines d'origine de canneberges (cPACs) ont eu peu d'effet sur les systèmes QS de P. aeruginosa mais ont quand même réduit l'activité et la production de plusieurs facteurs de virulence, normalisée pour la croissance des cellules. Les MDC pourraient un jour être cliniquement utiles, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour isoler le(s) composé(es) actif(s) du CP et de surmonter le problème de la croissance cellulaire augmenté.

Regulatory T (Treg) cells are important to maintain immune tolerance and homeostasis. Previous genome-wide transcriptional profiles have defined canonical signatures of Treg cells that distinguish them from effector T (Teff) cells. However, compelling evidence shows that changes in total mRNA levels do not always correlate with the protein levels due to post-transcriptional regulation. Our laboratory recently has performed the first genome-wide study on translational control of gene expression in primary CD4+ T cell subsets, and eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) is found to be translationally suppressed in activated Treg cells compared to activated Teff cells. We also showed that differential eIF4E levels in CD4+ T cell subsets correlated with translation of eIF4E-sensitive cell cycle-related mRNAs, and modulated proliferation and Foxp3 expression in activated CD4+ T cells. Thus, CD4+ T cell subsets exhibit specific translational programs that orchestrate expression of genes which play important roles in the regulation of fundamental cellular processes in CD4+ T cells lineage commitment, genetic programming and function. In this study, we hypothesized that differential expression of eIF4E impacts proliferative and cytokine responses in T cells. We first show that shRNA knockdown of eIF4E dramatically reduces CD4+ T cell proliferation and inflammatory cytokine secretion. As eIF4E activity is directly repressed by the eIF4E-binding proteins (4E-BPs), we hypothesized that CD4+ T cell responses may be skewed in 4E-BP1/2 deficient mouse model. Interestingly, 4E-BP1/2 deficient T cells are not enhanced in their proliferative response following activation, and 4E-BP1/2 deficiency does not abrogate the suppressive function of Treg cells. Moreover, Teff cells lacking 4E-BP1/2 are less sensitive to TGF-b-mediated induction of Treg cells, although rapamycin-mediated Treg induction is not abolished. Collectively, our findings demonstrate that eIF4E could regulate some CD4+ T cell responses in a 4E-BPs-dependent or –independent manner. Specific targeting of eIF4E prominently affects the T cell functional properties, which could open a new era for therapeutic treatment of some autoimmune disease. / Les cellules régulatrices T (Treg) sont importantes pour la maintenance de la tolérance et de l'homéostasie immunitaires. Des analyses pan-génomiques ont précédemment permis d'établir les signatures transcriptionnelles distinguant les cellules Treg des cellules effectrices T (Teff). Toutefois, de nombreuses études montrent que les changements dans les niveaux d'ARN messager totaux ne correspondent pas toujours avec les niveaux des protéines à cause de la régulation post-transcriptionnelle. Notre laboratoire a récemment effectué la première analyse pan-génomique du contrôle traductionnel de l'expression des gènes dans les sous-populations des cellules T CD4 primaires, montrant que la traduction du facteur d'initiation eucaryote 4E (eIF4E) est réduite dans les cellules Treg activées comparées aux cellules Teff activées. Nous avons également montré que les différents niveaux de eIF4E présents dans les sous-populations des cellules T CD4 corrèlent avec le niveau de traduction des ARN messager régulés par eIF4E relatifs au cycle cellulaire, a la modulation de la prolifération et a l'expression de Foxp3 dans des cellules T CD4 activées. Ainsi, les sous-populations de cellules T CD4 présentent des programmes spécifiques de traduction qui régissent l'expression de gènes qui jouent un rôle important dans la régulation de processus cellulaires fondamentaux pour l'engagement dans une lignée, la programmation génétique et de la fonction des cellules T CD4. Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que l'expression différentielle d'eIF4E affecte la prolifération et les réponses cytokiniques des les cellules T. Nous montrons d'abord que la répression de eIF4E par shRNA réduit considérablement la prolifération des cellules T CD4 et la sécrétion de cytokines inflammatoires. Comme l'activité d'eIF4E est directement réprimée par les protéines liées à eIF4E (4E-BP), nous avons émis l'hypothèse que les réponses des cellules T CD4 peuvent être affectées dans un modèle de souris déficientes pour 4E-BP1/2. Les cellules T déficientes 4E-BP1/2 ne sont pas rehaussée dans leur réponse proliférative après activation, et la déficience en 4E-BP1/2 n'abroge pas la fonction suppressive des cellules Treg. En outre, les cellules Teff qui n'expriment pas 4E-BP1/2 sont moins sensibles à l'induction de cellules Treg médiée par le TGF-b, alors que l'induction médiée par la rapamycine n'est pas abolit. Collectivement, nos résultats démontrent qu'eIF4E pourrait réguler certaines réponses des cellules T CD4 d'une manière 4E-BP-dépendante ou -indépendante. Le ciblage précis d'eIF4E affecte significativement les propriétés fonctionnelles des cellules T, ce qui pourrait ouvrir une nouvelle ère pour le traitement thérapeutique de certaines maladies auto-immunes.

The stringent response (SR) is a conserved bacterial stress response mechanism that allows bacteria to survive during stress and starvation. This response is mediated by (p)ppGpp, a hyperphosphorylated guanosine signal that regulates expression of genes to inhibit cellular proliferation and induce genes important for survival and adaptation. This study investigates the role of the SR in regulating oxidative stress pathways in Pseudomonas aeruginosa (PA), a human opportunistic pathogen that can cause infections in immunocompromised patients, and patients suffering from cystic fibrosis. Our results demonstrate that inactivation of the SR significantly increased susceptibility to killing by multiple oxidants, impaired anti-oxidant defenses, and increased the levels of endogenous reactive oxygen species (ROS). In addition, we demonstrated that overexpressing KatA, the primary catalase in PA, protected the ΔSR mutant from hydrogen peroxide killing as well as several antibiotics. Our results also suggested that hydroxyalkyl quinolone molecules were responsible for increased intracellular levels of ROS but did not impair catalase activity. In summary, we found that the SR was required for tolerance against oxidative stress, and regulated expression of both catalases katA and katB. Finally, overexpression of the KatA catalase was sufficient to protect against hydrogen peroxide killing, and partially protected against antimicrobial killing. / La réponse stringente (RS) est un mécanisme commun aux bactéries qui leur permet de répondre et survivre aux stress nutritionels et environmentaux. Cette réponse est médiée par le signal (p)ppGpp, une petite molécule de guanosine hyperphosphorylée. Celle-ci régule l'expression des gènes afin d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire des gènes importants pour la survie et d'adaptation au stress. Cette étude porte sur le rôle de la RS dans la régulation des voies de stress oxydatif chez Pseudomonas aeruginosa (PA), un pathogène humain opportuniste qui peut causer des infections chez les patients immunosupprimés et les patients souffrant de fibrose kystique. Nos résultats démontrent que l'inactivation de la RS augmente grandement la susceptibilité aux oxidants, diminue les défenses anti-oxidantes, et induisent une production endogènes dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) plus élevée. Nous avons également démontré que la sur-expression de KatA, l'enzyme catalase principale chez PA, protège le mutant ΔRS contre le peroxyde d'hydrogène ainsi que plusieurs antibiotiques bactériocides. Finalement, nos résultats suggèrent aussi que les molécules hydroxyalkyl quinolones sont responsables de l'augmentation des niveaux intracellulaires de DRO, mais n'altèrent pas l'activité des superoxide dismutases ou catalases. En résumé, la RS est nécessaire à la tolérance contre le stress oxidatif, et régule l'expression des deux catalases katA et katB. De plus, l'activité de la catalase KatA est suffisante pour protéger le mutant RS contre le peroxide d'hydrogène, et partiellement protéger contre l'effect bactericide des antibiotiques.