Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-12T17:27:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 435818 bytes, checksum: 11ac8d55485121ae9e428811aa3efe1c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T17:27:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 435818 bytes, checksum: 11ac8d55485121ae9e428811aa3efe1c (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A microbiota do rúmen bovino é complexa, incluindo organismos dos três domínios da vida, potencial hospedeiros de vários vírus. A população viral do rúmen desempenha um papel importante na manutenção do equilíbrio da população bacteriana e na transferência horizontal de genes. Além disso, bacteriófagos pode ser usada como uma possível estratégia para a mitigação de metano. Isso requer a identificação de espécies de bacteriófagos que infectam a principal Archaea produtora de metano no rúmen. O objetivo deste estudo foi caracterizar o viroma do rúmen de bovinos leiteiros da Universidade Federal de Viçosa usando uma abordagem metagenômica. Para acessa a diversidade viral,nós sequenciamos (Illumina HiSeq2000) partículas vírus-like do líquido de rúmen de dois bovinos leiteiros (amostras 08 e 11). Cada bibliotaca continha cerca de 49 milhões de sequências em pares. De novo assembly gerou 294.757 contigs para a amostra 08 e 193.262 para a amostra 11. Apenas 2% das sequências a partir de cada uma das duas amostras pode ser identificado através da comparação dos contigs com o banco de dados viral RefSeq, do NCBI. As famílias virais mais abundantes foram Siphoviridae, Myoviridae e Podoviridae. Para determinar se o alto número de contigs sem identificação eram possíveis sequências virais, alguns contigs das duas amostras que não mostraram nenhuma identidade com sequências depositadas no banco de dados foram escolhidos aleatoriamente e as ORF’s presentes nesses contigs foram identificadas usando a ferramenta ORFinder. Similaridade com proteínas virais conhecidas, foram detectadas em todas os contigs, sugerindo que a diversidade viral no rúmen é em grande parte desconhecida. Mesmo com o recente avanço nas tecnologias modernas de sequenciamento pouco se avançou no sentido de elucidar a verdadeira importância dos bacteriófagos no funcionamento do ecossistema ruminal, com muitas sequências permanecendo desconhecidas. Palavras-chaves: Metagenômica, rúmen, bacteriófagos / The microbiota of bovine rumen is complex, including organisms of the three domains of life, potential hosts of numerous viruses. The viral population of the rumen plays an important role in maintaining the balance of the bacterial population and in horizontal gene transfer. In addition, bacteriophages can be used as a possible strategy for methane mitigation. This requires the identification of bacteriophage species that infect the dominant methane-producing Archaea in the rumen. The purpose of this study was to characterize the rumen virome in dairy cattle from the University Federal of Viçosa using a metagenomic approach. To access the viral diversity we sequenced (Illumina HiSeq2000) virus-like particles from the rumen fluid of two dairy cattle (samples 08 and 11). Each library contained about 49 million pair-ended sequences. De novo assembly generated 294.757 contigs for sample 08 and 193.262 for sample 11. Only 2% of the sequences from each of the two samples could be identified by comparing the contigs with the viral RefSeq database of the NCBI. The most abundant viral families were Siphoviridae, Myoviridae and Podoviridae. To determine if the high number of contigs without a positive identification were possible viral sequences, some contigs that showed no identity from each of the two samples were randomly selected and the ORFs present in these contigs were identified using the ORFinder tool. Similarity to known viral proteins were detected in all contigs, suggesting that viral diversity in the rumen is largely unknown. Even with the recent advances in modern sequencing technology, little progress has been achived towards elucidating the true importance of bacteriophages in the functioning of the rumen ecosystem, with many sequences remaining unknown. Key words: Metagenomics, rumen, dairy cattle, phage.

Introdução: Apesar dos avanços nas técnicas de diagnóstico e tratamento, o câncer de próstata avançado ainda é uma condição letal. Terapêuticas mais eficazes são necessárias para reduzir as taxas de morbi-mortalidade associadas à doença. A Proteína-78 regulada pela glicose (GRP78), uma proteína de choque térmico envolvida na apresentação de antígenos, foi recentemente descrita como sendo um possível marcador molecular para o câncer de próstata. Ainda mais, a resposta imune a essa proteína mostrou correlação com o desenvolvimento de doença hormônio-independente e com pior sobrevida para a doença. Objetivos: Neste estudo, avaliou-se a hipótese de que a GRP78 poderia ser usada como marcador molecular em câncer de próstata no desenvolvimento de um sistema de receptor-ligante, através do uso da tecnologia de apresentação de fagos. Casuística e métodos: Inicialmente, foram clonados dois peptídeos que apresentam afinidade à proteína regulada pela GRP78 (os peptídeos WIFPWIQL e WDLAWMFRLPVG) no vetor fUSE5, criando-se fagos com capacidade teórica de ligação à mesma proteína. Posteriormente foi testada a capacidade de ligação desses fagos à GRP78 na membrana de células prostáticas malignas em solução, em xeno-tumores in vivo e em metástases ósseas de câncer de próstata humano. Resultados: Demonstrou-se que ambos os fagos se ligam especificamente à GRP78 in vitro, em comparação à proteínas com seqüência semelhante (proteínas de choque térmico 70 e 90) e não semelhante (albumina sérica bovina). Em seguida, mostrou-se que esses fagos se ligam com afinidade pelo menos 30 vezes maior à células de câncer de próstata que o fago controle, e que os fagos são internalizados por essas células. Posteriormente, mostrou-se que os fagos rastrearam xeno-tumores prostáticos quando injetados in vivo num modelo animal de câncer de próstata. Finalmente, mostrou-se que os fagos ligam-se especificamente à GRP78 expressa em metástases ósseas de adenocarcinoma prostático humano. Conclusões: Os fagos criados apresentam capacidade de ligação específica à GRP78 in vitro, em células em suspensão e in vivo. A estratégia e o sistema de receptor-ligante definidos no presente estudo podem ter implicacões relevantes no desenvolvimento de terapias dirigidas para o tratamento do câncer de próstata. / Introduction: Despite the advances in diagnosis and treatment, advanced prostate cancer remains a lethal condition. Improved methods of therapy are needed to reduce the morbidity and mortality rates associated with this disease. The Glucose-regulated protein-78 (GRP78), a stress-responsive heat-shock protein involved in antigen presentation, was recently described as a possible molecular marker for prostate cancer. Moreover, immune response against this protein was shown to have correlation with the development of androgen-independent prostate cancer and shorter overall survival. Objectives: We hipothesized that GRP78 could be used as a molecular marker for prostate cancer in the development of a receptor-ligand system, by using phage display technology. Patients and methods: We initially cloned two GRP78-targeting peptides (WIFPWIQL and WDLAWMFRLPVG) into a fUSE5-based phage. We then tested binding capacity of the phage to GRP78 in vitro, to GRP78 expressed in intact prostate cancer cell membranes, to a prostate cancer xenograft and to human bone metastases. Results: We showed that both phage created bound specifically to GRP78 in vitro, in comparison to related (Heat-shock proteins 70 and 90) and unrelated control proteins (bovine serum albumin). Next, we showed that these phage bound at least 30 times more to prostate cancer cells than the control phage, and were also internalized into these cells. Both GRP78-binding phage showed a strong homing in vivo to a human prostate cancer xenograft in a mouse model. Finally, we showed that both phage bound specifically to GRP78 expressed in human prostate cancer bone metastases. Conclusions: Both phage are capable of binding specifically to GRP78 in vitro, in the context of intact prostate cancer cells and in vivo. The strategy and the ligand-receptor system we have defined in this study may have relevant implications in the development of targeted therapies for the treatment of prostate cancer.

Introdução: Apesar dos avanços nas técnicas de diagnóstico e tratamento, o câncer de próstata avançado ainda é uma condição letal. Terapêuticas mais eficazes são necessárias para reduzir as taxas de morbi-mortalidade associadas à doença. A Proteína-78 regulada pela glicose (GRP78), uma proteína de choque térmico envolvida na apresentação de antígenos, foi recentemente descrita como sendo um possível marcador molecular para o câncer de próstata. Ainda mais, a resposta imune a essa proteína mostrou correlação com o desenvolvimento de doença hormônio-independente e com pior sobrevida para a doença. Objetivos: Neste estudo, avaliou-se a hipótese de que a GRP78 poderia ser usada como marcador molecular em câncer de próstata no desenvolvimento de um sistema de receptor-ligante, através do uso da tecnologia de apresentação de fagos. Casuística e métodos: Inicialmente, foram clonados dois peptídeos que apresentam afinidade à proteína regulada pela GRP78 (os peptídeos WIFPWIQL e WDLAWMFRLPVG) no vetor fUSE5, criando-se fagos com capacidade teórica de ligação à mesma proteína. Posteriormente foi testada a capacidade de ligação desses fagos à GRP78 na membrana de células prostáticas malignas em solução, em xeno-tumores in vivo e em metástases ósseas de câncer de próstata humano. Resultados: Demonstrou-se que ambos os fagos se ligam especificamente à GRP78 in vitro, em comparação à proteínas com seqüência semelhante (proteínas de choque térmico 70 e 90) e não semelhante (albumina sérica bovina). Em seguida, mostrou-se que esses fagos se ligam com afinidade pelo menos 30 vezes maior à células de câncer de próstata que o fago controle, e que os fagos são internalizados por essas células. Posteriormente, mostrou-se que os fagos rastrearam xeno-tumores prostáticos quando injetados in vivo num modelo animal de câncer de próstata. Finalmente, mostrou-se que os fagos ligam-se especificamente à GRP78 expressa em metástases ósseas de adenocarcinoma prostático humano. Conclusões: Os fagos criados apresentam capacidade de ligação específica à GRP78 in vitro, em células em suspensão e in vivo. A estratégia e o sistema de receptor-ligante definidos no presente estudo podem ter implicacões relevantes no desenvolvimento de terapias dirigidas para o tratamento do câncer de próstata. / Introduction: Despite the advances in diagnosis and treatment, advanced prostate cancer remains a lethal condition. Improved methods of therapy are needed to reduce the morbidity and mortality rates associated with this disease. The Glucose-regulated protein-78 (GRP78), a stress-responsive heat-shock protein involved in antigen presentation, was recently described as a possible molecular marker for prostate cancer. Moreover, immune response against this protein was shown to have correlation with the development of androgen-independent prostate cancer and shorter overall survival. Objectives: We hipothesized that GRP78 could be used as a molecular marker for prostate cancer in the development of a receptor-ligand system, by using phage display technology. Patients and methods: We initially cloned two GRP78-targeting peptides (WIFPWIQL and WDLAWMFRLPVG) into a fUSE5-based phage. We then tested binding capacity of the phage to GRP78 in vitro, to GRP78 expressed in intact prostate cancer cell membranes, to a prostate cancer xenograft and to human bone metastases. Results: We showed that both phage created bound specifically to GRP78 in vitro, in comparison to related (Heat-shock proteins 70 and 90) and unrelated control proteins (bovine serum albumin). Next, we showed that these phage bound at least 30 times more to prostate cancer cells than the control phage, and were also internalized into these cells. Both GRP78-binding phage showed a strong homing in vivo to a human prostate cancer xenograft in a mouse model. Finally, we showed that both phage bound specifically to GRP78 expressed in human prostate cancer bone metastases. Conclusions: Both phage are capable of binding specifically to GRP78 in vitro, in the context of intact prostate cancer cells and in vivo. The strategy and the ligand-receptor system we have defined in this study may have relevant implications in the development of targeted therapies for the treatment of prostate cancer.