Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Knegt_FabioHenriquePfeilstickerde_M.pdf: 9266031 bytes, checksum: 2e50ca8e5e73fdfda6471f84b5b94011 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans é uma bactéria Gram-negativa, de metabolismo diazotrófico, estritamente autotrófico e quimiolitotrófico que pode utilizar Fe2+ e SO como doadores de elétrons em sua respiração celular. A. ferrooxidans possui importância econômica, uma vez que um dos microrganismos envolvidos no processo de biolixiviação, processo em que metais existentes em minérios na forma de compostos insolúveis são solubilizados pela ação de comunidades de microrganismos. O fosfato é um nutriente que pode limitar o crescimento de A. ferrooxidans em ambientes de biolixiviação. A despeito disto, pouco se sabe a respeito das respostas molecular e morfológica desta bactéria ao estresse de privação deste nutriente. A linhagem brasileira A. ferrooxidans LR foi utilizada para o estudo de genes expressos diferencialmente e de alterações morfológicas de células cultivadas em condições de privação de fosfato. Foram feitos experimentos de curva de crescimento em várias concentrações de fosfato. Com base nestes experimentos foram escolhidas as condições para a realização de experimentos de RAP-PCR. A confirmação da expressão diferencial dos cDNAs isolados foi realizada por slot blot de DNA. Os cDNAs com maiores coeficientes de expressão foram c1onados e seqüenciados. A análise das seqüências mostrou que três cDNAS apresentaram similaridade significativa com a enzima 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintase (DHBP sintase - RibB) e com o domínio DHBP sintase de enzimas bifuncionais que possuem um domínio DHBP sintase e outro GTP cic1ohidrolase 11 (RibBA). Estas enzimas estão envolvidas na síntese de riboflavina. A análise da seqüência genômica de A. ferrooxidans revelou que esta bactéria possui genes para ambas enzimas e que o cDNA c1onado correspondia ao gene ribB. O gene ribBA, amplificado a partir do DNA genômico de A. ferrooxidans LR, foi c1onado e seqüenciado. Outro cDNA apresentou similaridade significativa com proteínas heat shock da super-família a-HSP. A análise do genoma não anotado de A. ferrooxidans indicou a presença de outras duas prováveis ORFs que codificam a-HSPs. A expressão dos cDNAs e do gene ribBA foi analisada em várias condições de estresse através de slot blot de RNA. A morfologia de A. ferrooxidans LR foi analisada através de microscopia de força atômica (AFM). Células de A. ferrooxidans cultivadas em meio sem fosfato sofrem drásticas alterações em sua superfície. As células crescidas em condições controle possuíam superfícies lisas, ao passo que células submetidas à privação de fosfato apresentaram superfícies irregulares. As células cultivadas em meio sem fosfato são mais largas e em média três vezes maiores que células cultivadas nas condições controle / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans is a Gram-negative, diazotrophic, strictly, autotrophic and chemolithotrophic bacterium which can oxide Fe2+ and SO in its metabolismo A. ferrooxidans is an economically important bacterium, being a member of bacteria consortia involved in bioleaching, a process in which metaIs are solubilized from ores as a result of the action of microorganism' s communities. Phosphate is a possible limiting factor for A. ferrooxidans growth in bioleaching environments, nonetheless, little is known about this bacterium molecular and morphological response to phosphate starvation. The Brazilian strain A. ferrooxidans LR was used in the study of differentially expressed genes and morphological alterations under phosphate starvation growth conditions. Growth curve experiments were used to determine experimental conditions to the RAP-PCR experiments. The obtained bands had their differential expression confirmed through DNA slot blot experiments. The most strongly induced phosphate stress expressed cDNAs were c1oned and sequenced. Three of theses cDNAs were significantly similar to the enzyme 3,4-dihydroxi-2-butanone 4-phosphate synthase (DHBP synthase - RibB) and to the RibB domain of bifunctional DHBP synthase / GTP cic1ohydrolase enzymes. These enzymes are part of the riboflavin synthesis pathway. The ribBA gene was sequenced and c1oned. Another cDNA was significantly similar to heat shock proteins of the a-HSP superfamily. The non-annotated A. ferrooxidans genome analysis resulted in the identification of two other ORFs coding for a-HSP proteins in this bacterium. The expression of the identified cDNAs and the ribBA gene on other stress conditions was studied with RNA slot blot. Atomic Force Microscopy (AFM) was used to study the morphological response of A. ferrooxidans LR to phosphate starvation. Phosphate starved cell showed drastically altered surfaces. Control cells had smooth surfaces, conversely, phosphate limited cells had highly irregular surfaces. Cells grown on the absence of phosphate were wider and, on average, three times larger than control cells / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular