Enteric infections are widespread throughout the world and continue to pose a serious health threat, especially to younger children. Bacterial pathogens apply a plethora of distinct virulence mechanisms to efficiently infect and establish host colonization, consequently leading to various diseases. Campylobacter jejuni is currently the leading cause of bacterial foodborne diarrheal disease worldwide. However, in comparison to other enteric pathogens, relatively little is known about how this bacterium establishes infections and mediates virulence in humans. Its genome lacks classical virulence factors or toxins known from other enteric pathogens and only encodes three known sigma factors, suggesting additional layers of gene regulation. Recent transcriptome studies in C. jejuni confirmed the existence of several small regulatory RNAs (sRNAs). However, their function remains largely elusive. This thesis aimed to uncover novel regulators of C. jejuni virulence and physiology. Therefore, a dual RNA sequencing (dual RNA-seq) experiment was performed upon infection of Caco-2 cells in a recently advanced human intestinal three-dimensional (3D) infection model, in parallel to standard two-dimensional (2D) infection of monolayers. This deep-sequencing approach allows for the simultaneous quantification of host and pathogen transcriptomes on a global scale and was intended to unravel new bacterial host-adaptation and virulence-associated factors, as well as to assess host measures in response to C. jejuni infection. While only a small number of human genes were differentially regulated upon infection with C. jejuni NCTC11168 wild-type (WT) bacteria, a large proportion of bacterial genes were found to be differentially expressed. A closer look at the bacterial transcriptome post infection revealed little overlap between up- or downregulated genes in the 3D tissue model compared to 2D cell culture. In addition, different functional classes were enriched in adhered and internalized bacteria within these two different infection environments. Strikingly, several sRNAs were found to be upregulated during infection, highlighting their potential importance for host-pathogen interactions. In many bacterial species, sRNAs are involved in post-transcriptional regulation and fine-tuning of diverse fundamental processes including pathogenesis. Since their role in C. jejuni physiology was largely unexplored, candidates from the dual RNA-seq experiment were selected to uncover their putative targets and characterize their function in C. jejuni NCTC11168. Therefore, sRNA mutant strains were generated and tested for distinct phenotypic traits such as growth defects, protein expression, and motility in comparison to WT bacteria. Furthermore, growth-dependent differences in sRNA expression were determined and total RNA sequencing (RNA-seq) experiments with sRNA deletion mutants were performed to unravel their targetome, in combination with in-silico predictions. Since flagellar motility is a crucial virulence factor that allows Campylobacter to navigate through the viscous mucus of the human intestine, sRNA involvement in this process was explored in more detail. In contrast to transcriptional control of the hierarchically expressed flagellar components, little is known about post-transcriptional regulation of the flagellar biosynthesis cascade in C. jejuni. To this end, one sRNA (CJnc230), encoded downstream of the flagellar hook structural gene flgE and strongly upregulated after infection of the 3D tissue model, was selected to investigate a potential functional link to bacterial motility. CJnc230 is dependent on the flagellar sigma-54 factor (RpoN) and was found to be co-transcribed with the upstream gene flgE, requiring three distinct ribonucleases (RNases) for its processing and maturation. Termination site sequencing (term-seq) and differential RNA sequencing (dRNA-seq) techniques were used to further dissect CJnc230 biogenesis, revealing the boundaries of the most abundant CJnc230 fragment and the presence of an alternative transcriptional start site (TSS) originating from an independent promoter. RNA-seq was performed with an overexpression mutant of CJnc230 to decipher its biological function. In-vitro and in-vivo approaches confirmed direct interaction of the CJnc230 single-stranded region with the ribosome binding site (RBS) of Cj1387c (putative transcriptional regulator) and flgM (anti-sigma-28 factor) mRNAs, thereby repressing their translation. Phenotypic characterization further demonstrated that the CJnc230 overexpression mutant exhibits increased motility and flagellar filament length. The latter is most likely due to increased expression of the major flagellin flaA after repression of FlgM and indirect transcriptional activation of late flagellar genes, dependent on the flagellar sigma-28 factor (FliA). In contrast to CJnc230, the FliA-dependent sRNA CJnc170 was shown to decrease filament length and motility when overexpressed with a heterologous promoter. These observations suggest renaming CJnc230 and CJnc170 to FlmE and FlmR (flagellar length and motility enhancer/repressor), respectively, and that sRNA-mediated post-transcriptional regulation fine-tunes C. jejuni flagellar biosynthesis through balancing of the hierarchically expressed components. In summary, this thesis reveals the importance of C. jejuni sRNAs during infection and dissects the molecular targetome of selected candidates. Moreover, validation of target interactions and downstream functions uncovered a previously uncharacterized role for the CJnc230 sRNA in flagellar biogenesis and its effect on motility, a key determinant of C. jejuni virulence. / Infektionen des Gastrointestinaltrakts sind weltweit verbreitet und stellen nach wie vor eine Gesundheitsbedrohung, insbesondere für Kleinkinder, dar. Bakterielle Krankheitserreger nutzen eine Vielzahl unterschiedlicher Virulenzmechanismen, um den Wirt effizient zu infizieren und zu besiedeln, was zu verschiedenen Krankheiten führen kann. Campylobacter jejuni ist momentan die häufigste Ursache für über die Nahrung übertragene, bakterielle Durchfallerkrankungen weltweit. Im Vergleich zu anderen Darmpathogenen ist jedoch relativ wenig darüber bekannt, wie dieses Bakterium eine Infektion auslöst und welche Virulenzmechanismen diese beim Menschen vermitteln. Dem Genom von C. jejuni fehlen klassische Virulenzfaktoren oder Toxine, die von anderen Darmpathogenen bekannt sind, und es enthält nur drei bekannte Sigmafaktoren, was auf zusätzliche Ebenen der Genregulation schließen lässt. Jüngste Transkriptomstudien an C. jejuni bestätigten die Existenz mehrerer kleiner regulatorischer RNAs (sRNAs). Deren Funktion ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Regulatoren der Virulenz und Physiologie von C. jejuni aufzudecken. Dazu wurde ein duales RNA-Sequenzierungsverfahren (dual RNA-seq) nach Infektion von Caco-2-Zellen in einem kürzlich entwickelten dreidimensionalen (3D) Infektionsmodell des menschlichen Darms angewendet, parallel zu herkömmlichen Infektionen in zweidimensionaler (2D) Zellkultur. Diese Hochdurchsatz-Sequenziermethode ermöglicht die globale Quantifizierung des Transkriptoms von Wirt und Erreger in derselben Probe und sollte neue bakterielle Anpassungs- und Virulenzfaktoren aufdecken, sowie die Reaktion des Wirts auf die Infektion mit C. jejuni erfassen. Während nach der Infektion mit C. jejuni NCTC11168 Wildtyp (WT)-Bakterien nur wenige menschliche Gene dereguliert waren, wurde bei einem großen Teil des bakteriellen Transkriptoms eine veränderte Genexpression festgestellt. Ein genauerer Blick verriet, dass es nur wenige Überschneidungen zwischen hoch- und herunterregulierten bakteriellen Genen im 3D-Gewebemodell im Vergleich zu 2D-Zellkultur gab. Darüber hinaus waren, je nach Infektionsumgebung, verschiedene funktionelle Klassen von Genen unterschiedlich stark in adhärenten und internalisierten Bakterien repräsentiert. Auffallend war außerdem, dass mehrere sRNAs während der Infektion hochreguliert waren, was deren mögliche Bedeutung für die Interaktion zwischen Wirt und Erreger unterstreicht. In vielen Bakterienarten sind sRNAs an der post-transkriptionellen Regulierung und Feinabstimmung verschiedener grundlegender Prozesse beteiligt, unter anderem auch an der Pathogenese. Da ihre Rolle in der Physiologie von C. jejuni aber weitgehend unerforscht ist, wurden Kandidaten aus dem dualen RNA-seq Experiment ausgewählt, um mögliche Zielgene aufzudecken und ihre Funktion in C. jejuni NCTC11168 zu charakterisieren. Dazu wurden sRNA-Mutantenstämme erzeugt und auf unterschiedliche phänotypische Merkmale, wie Wachstumsdefekte, Proteinexpression und Motilität, im Vergleich zu WT-Bakterien getestet. Darüber hinaus wurden wachstumsabhängige Unterschiede in der sRNA-Expression bestimmt und RNA-Sequenzierungsexperimente (RNA-seq) mit den Deletionsmutanten durchgeführt, um deren Zielgen-Repertoire in Kombination mit in-silico Vorhersagen zu entschlüsseln. Da flagellare Motilität ein wichtiger Virulenzfaktor ist, der es Campylobacter ermöglicht, durch die zähflüssige Mukusschicht des menschlichen Darms zu navigieren, wurde die Beteiligung von sRNAs an diesem Prozess genauer untersucht. Im Gegensatz zur hierarchisch geordneten Transkription der einzelnen Komponenten der bakteriellen Geißel, ist über die post-transkriptionelle Regulation der Flagellen-Biosynthese in C. jejuni nur wenig bekannt. Daher wurde eine sRNA (CJnc230) ausgewählt, die hinter dem Strukturgen flgE (flagellarer Haken) liegt und nach Infektion des 3D-Gewebemodells stark hochreguliert war, um eine mögliche funktionelle Verbindung zur bakteriellen Motilität zu untersuchen. CJnc230 ist abhängig vom alternativen Sigmafaktor RpoN (Sigma 54) und wird zusammen mit dem vorgelagerten Gen flgE transkribiert, wobei drei verschiedene Ribonukleasen (RNasen) für die Prozessierung und Reifung erforderlich sind. Mit Hilfe von termination site sequencing (term-seq) und differential RNA sequencing (dRNA-seq) wurde die Biogenese von CJnc230 weiter aufgeschlüsselt. Dabei wurden die Enden des am häufigsten vorkommenden CJnc230-Fragments und die Existenz einer alternativen Transkriptionsstartstelle (TSS), die von einem unabhängigen Promotor stammt, aufgedeckt. Um die biologische Funktion von CJnc230 zu entschlüsseln, wurde RNA-seq mit einer Überexpressionsmutante der sRNA durchgeführt. In-vitro und in-vivo Ansätze bestätigten die direkte Interaktion der einzelsträngigen Region von CJnc230 mit der Ribosomenbindestelle (RBS) der mRNAs von Cj1387c (potenzieller Transkriptionsfaktor) und flgM (anti-Sigma-28-Faktor), wodurch die Translation unterdrückt wird. Die phänotypische Charakterisierung zeigte außerdem, dass die CJnc230-Überexpressionsmutante eine erhöhte Motilität und Länge des Geißelfilaments aufweist. Letzteres ist höchstwahrscheinlich auf eine verstärkte Expression des Hauptflagellins flaA nach Repression von FlgM und eine indirekte transkriptionelle Aktivierung von späten flagellaren Genen, die vom alternativen Sigmafaktor FliA (Sigma 28) abhängig sind, zurückzuführen. Im Kontrast zu CJnc230 wurde gezeigt, dass die FliA-abhängige sRNA CJnc170 die Filamentlänge und Motilität verringert, wenn sie mit einem heterologen Promotor überexprimiert wird. Diese Beobachtungen legen eine Umbenennung von CJnc230 und CJnc170 in FlmE bzw. FlmR (flagellar length and motility enhancer/repressor) nahe und zeigen, dass die Flagellen-Biosynthese in C. jejuni zusätzlich durch sRNA-vermittelte, post-transkriptionelle Feinabstimmung der hierarchisch exprimierten Komponenten im Gleichgewicht gehalten wird. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit die Bedeutung von C. jejuni sRNAs während der Infektion auf und entschlüsselt die Zielgene ausgewählter Kandidaten. Darüber hinaus wurde durch die Validierung von sRNA-mRNA Interaktionen und nachgeschalteten Funktionen eine bisher nicht charakterisierte Rolle für die CJnc230 sRNA in der Flagellen-Biogenese und ihre Auswirkung auf die Motilität, ein Hauptmerkmal der Virulenz von C. jejuni, aufgedeckt.

Clostridium difficile infection (CDI) is the most common cause of health-care-associated infectious diarrhea. Recurrence rates are as high as 20–30% after standard treatment with metronidazole or vancomycin, and appear to be reduced for patients treated with fidaxomicin. According to the literature, the risk of CDI recurrence increases after the second relapse to 30–65%. Accurate data for Germany are not yet available. Methods: Based on the research database of arvato health analytics (Munich, Germany), a secondary data analysis for the incidence, treatment characteristics and course of CDI was performed. The database included high granular accounting information of about 1.46 million medically insured patients covering the period 2006–2013, being representative for Germany. The analysis was based on new-onset CDI in 2012 in patients which either received outpatient antibiotic therapy for CDI or were hospitalized. Results: The ICD-10 coded incidence of CDI in 2012 was 83 cases per 100,000 population.

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Kulturunabhängige 16S rRNA Analyse des subgingivalen bakteriellen Biofilms bei der aggressiven Parodontitis und Vergleich mit bekannten Bakterien bzw. Phylotypen, die im Zusammenhang mit der parodontalen Flora nachgewiesen wurde. Putative Pathogene wurden bestimmt. / In this culture independent 16S rRNA study cloning and sequencing was used to analyse gingival samples from a population of 26 persons suffering from aggressive periodontitis and six healthy adult individuals.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Prä- und Probiotika auf bakterielle Translokation (BT) und postoperative Infektionen nach großen viszeralchirurgischen Eingriffen untersucht. Dabei wurde aus methodischen Gründen zunächst BT nach Leber- (LR) und Colonresektion (CR) allein oder in Kombination experimentell im Rattenmodell quantifiziert und deren potentielle Pathomechanismen untersucht. Anschließend wurde der Einfluss von einzelnen Probiotika und einer Kombination verschiedener Probiotika und Präbiotika auf die Inzidenz bakterieller Infektionen nach Lebertransplantation (LTX) und pyloruserhaltender Pankreaskopfresektion (PPPD) in zwei prospektiv randomisierten klinischen Studien analysiert. Im experimentellen Teil der Untersuchungen wurde BT nach LR vor allem in Leber und Milz, nach CR hauptsächlich in mesenterialen Lymphknoten (MLK) und Milz nachgewiesen. Kombination von LR und CR führte zu einer Potenzierung der BT, parallel zum Ausmaß der LR. Durch Gabe von Probiotika wurde die Konzentration von Bakterien in den MLK signifikant gesenkt. Tiere mit einer hohen coecalen Laktobazillenkonzentration hatten eine signifikant niedrigere bakterielle Konzentration in allen untersuchten Organen als Tiere mit weniger Laktobazillen. CR führten zu einer Zunahme der coecalen gramnegativen Bakterienkonzentration und zu einer Abnahme der Laktobazillen. Histologische Veränderungen der Darmmukosa wurden nicht beobachtet. Die parazelluläre Permeabilität für Ionen, nicht aber für die höhermolekulare Laktulose war im Colon in allen Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht. Probiotika beeinflussten die Zusammensetzung der coecalen Flora und damit auch die BT. In der ersten klinischen Studie verminderte postoperative orale Gabe von Laktobazillus plantarum und einer ballaststoffhaltigen Ernährungslösung die Inzidenz von bakteriellen Infektionen nach LTX im Vergleich zu selektiver Darmdekontamination und ballaststofffreier Ernährung signifikant. Die Gabe von Ballaststoffen und hitzeinaktivierten Laktobazillen führte zwar auch zu einer geringen Reduktion der Infektionen; diese war jedoch nicht signifikant. In der Mehrzahl wurden enteropathogene Bakterien isoliert. Die zweite klinische Studie untersuchte den Einfluss einer Kombination von vier verschiedenen Milchsäurebakterien und vier Präbiotika auf die Inzidenz bakterieller Infektionen nach LTX und PPPD. Im Vergleich zu Präbiotika und Placebo kam es zu einer deutlichen Verminderung der Infekte, die nach LTX auch signifikant war. In beiden Studien wurde die enterale Ernährung gut vertragen mit relativ wenig Nebenwirkungen. BT tritt somit sehr häufig auch nach kleineren viszeralchirurgischen Eingriffen auf und hat organspezifisch verschiedene Ursachen. Probiotika konnten sowohl tierexperimentell die BT vermindern als auch klinisch die Inzidenz bakterieller Infektionen nach großen viszeralchirurgischen Eingriffen senken. Da sie leicht zu verabreichen sind und wenig Nebenwirkungen verursachen, könnten sie breit eingesetzt werden. / In the present study, the impact of pre- and probiotics on bacterial translocation (BT) and postoperative bacterial infection rates was assessed. Due to methodological reasons, we first quantified BT following single liver (LR) and colon resection (CR) or a combination of both and analysed potential pathogenic mechanisms for BT. Then, we performed two prospective randomised clinical studies to analyse the influence of a single probiotic strain and a combination of different pre- and probiotics on the incidence of bacterial infections in patients with liver transplantation (OLT) or pylorus preserving partial pancreatoduodenectomy (PPPD). In the rat model, BT after LR mainly occurred in the liver and spleen, after CR mainly in the mesenteric lymph nodes (MLN) and spleen. BT was increased in the animals with combined operation, in parallel to the extent of liver resection. Probiotics significantly decreased the bacterial concentration in the MLN. Animals with a high cecal concentration of lactobacilli had significantly less BT than the others. CR led to an increase of cecal gramnegative bacterial concentrations and to a decrease of lactobacilli. No histological changes were observed in the intestine. Paracellular permeability for ions, but not for the larger molecule lactulose, was increased in the colon in all groups compared to the sham group. Probiotics had an influence on cecal bacterial concentration. In the first clinical study, postoperative oral administration of Lactobacillus plantarum and a fibre-enriched enteral diet significantly decreased bacterial infection rates after OLT compared to selective bowel decontamination and a fibre-free diet. Fibre and heat-inactivated Lactobacillus also led to a slight, but not significant decrease of infections. Mainly gut-derived bacteria were isolated. The second clinical study analysed the influence of a combination of four different lactic acid bacteria and fibres on bacterial infection rates after OLT and PPPD. Compared to fibres and placebo, infection rates were significantly lower after OLT and markedly lower after PPPD. In both studies, the study substances were well tolerated without serious side effects. BT even occurs following minor abdominal surgery and is caused by different mechanisms related to the kind of operation. Probiotics were able to diminish BT in the rat model as well as to decrease bacterial infection rates following major abdominal surgery in the clinical studies. As they are easy to administer and do not cause severe side effects, they could be useful in clinical practice.