京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第22707号 / 農博第2423号 / 新制||農||1080(附属図書館) / 学位論文||R2||N5300(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 本田 与一, 教授 田中 千尋, 教授 吉村 剛 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

The transport and intracellular distribution of iron in Ustilago sphaerogena via the native siderochrome ferrichrome A has been examined. Evidence is presented which suggests the involvement of deferriferrichrome in iron transport when the metal is supplied to the cell as ferrichrome A. This process requires both oxygen and ATP synthesis and may require a transmembrane electrochemical gradient. Once inside the cell, iron derived from ferrichrome A is rapidly distributed, with a major fraction found in the mitochondria, presumably as heme. The kinetics of ferrichrome and ferrichrome A uptake have also been investigated. The Km of transport of ferrichrome was determined to be 0.6 μM with a maximum velocity of 1.55 nmoles/min/mg. For ferrichrome A the Km was found to be 7.6 μM; Vmax was 0.85 nmoles/ min/mg. Ferrichrome functions as a competitive inhibitor of ferrichrome A transport with a Ki of 14 μM, while ferrichrome A inhibited ferrichrome transport in a noncompetitive manner. Together these data are consistent with a two-site model for siderochrome transport. A model for the transport process is presented. The exchange of iron from fcA to deferrifch has also been examined. The ratio of the binding constants between fcA and fch was found to be 5.29. From this data the binding constant for fcA was determined to be 6.82x10^29.

In the majority of sexual eukaryotes, mitochondria are inherited predominantly from a single, usually the female, parent Like the majority of higher plants and animals, the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans has two mating types (sexes), however, these two sexes are morphologically similar. In this study, I examined the distribution of the mating types and how mating types influence the inheritance of mitochondria in C. neoformans. My survey of mating type alleles in 358 isolates collected from four geographic areas in the US showed a biased distribution of mating type alleles with most isolates containing mating type a alleles. To characterize the role of mating type locus on mitochondrial inheritance, I constructed two pairs of congenic strains that differed only at the mitochondrial genome and mating type locus. Mating between these two pairs of strains demonstrated that uniparental inheritance in C. neoformans was controlled by the mating type locus and progeny predominantly inherited mitochondria from the mating type a parent. Specifically, we identified two genes within the mating type locus, SXIIa in mating type a strain and SXI2a in mating type a strain, that control mitochondrial inheritance. Disruption of these two genes resulted in biparental mitochondrial inheritance in sexual crosses. These two genes are the first ones identified capable of controlling uniparental mitochondrial inheritance in any organism. In addition, we determined that the deletion of the SXIIa gene enhanced the spread of mitochondrial introns in sexual crosses. This discovery is consistent with the hypothesis that uniparental lnheritance might have evolved to prevent the spread of selfish cytoplasmic elements. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第23521号 / 農博第2468号 / 新制||農||1087(附属図書館) / 学位論文||R3||N5352(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 本田 与一, 教授 田中 千尋, 准教授 坂本 正弘 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

A utilização de inóculos líquidos na produção de Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) é uma tecnologia promissora para a industrialização do cultivo em sistema axênico, uma vez que permite a inoculação do micélio de forma rápida e bem distribuída, reduzindo riscos de contaminação e o período de incubação dos substratos. Neste trabalho, o cultivo submerso para a produção de micélio de Shiitake foi avaliado em um biorreator airlift de circulação externa, idealizado e projetado no grupo, utilizando o meio de cultura Mushroom Complete Medium adicionado de micronutrientes, nas condições de operação: taxas de aeração: 0.16, 0.20, e 0.24 vvm e tamanhos de inóculo (i.s.): 1.0 g.L-1 e 2.0 g.L-1. Na melhor condição de operação (0.16 vvm e 1.0 g.L-1 i.s.), um modelo matemático foi desenvolvido usando o software EMSO para descrever a cinética da cultura em ajuste aos dados experimentais. Foram atingidos 15,47 g.L-1 de biomassa total, após 10 dias de cultivo, 0,516 d-1 de taxa máxima de crescimento específico, fatores de rendimento Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 e produtividade PX 0,061 (g.L-1).h-1. A predição do modelo demonstrou ser um parâmetro confiável para estudos de aumento de escala já que descreveu bons resultados preditivos para biomassa em relação aos produtos do metabolismo (CO2 e síntese de H+ pela acidificação do meio) e ao consumo de nutrientes (O2 e glicose). A seleção e a avaliação de linhagens no cultivo também são fatores a serem considerados para obtenção de boas produtividades e, deste modo, o desempenho produtivo de cinco linhagens de Shiitake foi avaliado em cultivo axênico, utilizando um planejamento composto central (CCD) para avaliar as variáveis independentes: tempo de incubação I(t), e percentual de farelo de trigo em relação a serragem Eucalypitus saligna (representada pela relação carbono/nitrogênio (RC/N)), tendo a eficiência biológica (BE) e o peso unitário dos cogumelos como resultados de destino . Os substratos utilizados tiveram sua composição físico-química determinada e as taxas de suplementação do substrato foram otimizadas, não só para o rendimento em cultivo, mas também para o crescimento vegetativo do micélio. Os melhores resultados de BE em todas as linhagens foram obtidos em cultivos com RC/N 57,62/1, com indução dos primórdios em 130 dias de I(t). Os cogumelos colhidos nesta condição de produção tiveram sua composição centesimal determinada. Atividades enzimáticas amilolíticas e celulolíticas, β-glicosidase e proteases específicas foram realizadas em ensaios de colonização do substrato. Três linhagens foram selecionadas para o isolamento de esporos e hibridização intraespecífica. As linhagens híbridas foram comparadas com as parentais em termos de rendimento e síntese das enzimas extracelulares. Os resultados deste trabalho demonstraram que a linhagem cultivada tem um efeito considerável sobre o rendimento, sobre o peso unitário e sobre a síntese de enzimas extracelulares produzidas pelo fungo, tanto pelas linhagens híbridas, como pelas parentais. / The use of liquid inoculant production of Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) is a promising technology for the industrialization farming of this fungus in axenic system because it allows the mycelium inoculation in a quick and well distributed way, thus reducing the risks of contamination and the incubation time of cultures. In this work, the submerged cultivation for the production of Shiitake mycelium was evaluated in an airlift bioreactor of external circulation, conceived and designed in the group, using the culture medium Mushroom Complete Medium added of micronutrients, under the operating conditions: rates of aeration: 0.16, 0.20, and 0.24 vvm and inoculum sizes (i.s.): 1.0 g. L-1 and 2.0 g. L-1. Under the best operating condition (0.16 vvm and 1.0 g L-1 i.s.), a mathematical model was developed using the EMSO software to describe the kinetics of culture fittnes to experimental data. It was possible to obtain 15.47 g L-1 of total biomass, after 10 days of cultivation, a maximum specific growth rate of 0.516 d-1, yields of Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 and PX (productivity) 0.061 (g.L-1).h-1. The prediction of the model has proven to be a reliable parameter for studies for scaling up because it was predictive for biomass considering the products of metabolism (CO2 and H+ synthesis by acidification of the medium) and nutrient consumption (O2 and glucose). The selection and evaluation of strains in cultivation are also factors to be considered to obtain good productivity and, therefore, the productive performance of five strains of Shiitake cultivated under axenic system, was carried out using a central composition design (CCD) to evaluate the independent variables: incubation time I(t), and percentage of wheat bran in relation to sawdust of Eucalypitus saligna (represented by the carbon/nitrogen ratio (RC/N)), and having the biological efficiency (BE) and the unit weight of the mushrooms as target results. The best results for BE for all the strains were obtained in cultures with RC/N 57.62/1, with primordia induced at 130 days of I(t). The substrates used had their physico-chemical composition determined and the rates of substrate supplementation have been optimized, not only for the cultivation yields, but also for vegetative growth of the mycelium. The mushrooms harvested in this condition of production had their centesimal composition determined. Amilolytic, cellulolytic, β-glucosidase and specific proteases activities were performed in tests of colonization of the substrate. Three strains were selected for the isolation of spores and intraspecific hybridization was carried out. Hybrid strains were compared with the parental strains in terms of yields and synthesis of extracellular enzymes. The results of this study showed that strain has a considerable effect on both the yield and the unit weight of mushrooms.

A utilização de inóculos líquidos na produção de Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) é uma tecnologia promissora para a industrialização do cultivo em sistema axênico, uma vez que permite a inoculação do micélio de forma rápida e bem distribuída, reduzindo riscos de contaminação e o período de incubação dos substratos. Neste trabalho, o cultivo submerso para a produção de micélio de Shiitake foi avaliado em um biorreator airlift de circulação externa, idealizado e projetado no grupo, utilizando o meio de cultura Mushroom Complete Medium adicionado de micronutrientes, nas condições de operação: taxas de aeração: 0.16, 0.20, e 0.24 vvm e tamanhos de inóculo (i.s.): 1.0 g.L-1 e 2.0 g.L-1. Na melhor condição de operação (0.16 vvm e 1.0 g.L-1 i.s.), um modelo matemático foi desenvolvido usando o software EMSO para descrever a cinética da cultura em ajuste aos dados experimentais. Foram atingidos 15,47 g.L-1 de biomassa total, após 10 dias de cultivo, 0,516 d-1 de taxa máxima de crescimento específico, fatores de rendimento Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 e produtividade PX 0,061 (g.L-1).h-1. A predição do modelo demonstrou ser um parâmetro confiável para estudos de aumento de escala já que descreveu bons resultados preditivos para biomassa em relação aos produtos do metabolismo (CO2 e síntese de H+ pela acidificação do meio) e ao consumo de nutrientes (O2 e glicose). A seleção e a avaliação de linhagens no cultivo também são fatores a serem considerados para obtenção de boas produtividades e, deste modo, o desempenho produtivo de cinco linhagens de Shiitake foi avaliado em cultivo axênico, utilizando um planejamento composto central (CCD) para avaliar as variáveis independentes: tempo de incubação I(t), e percentual de farelo de trigo em relação a serragem Eucalypitus saligna (representada pela relação carbono/nitrogênio (RC/N)), tendo a eficiência biológica (BE) e o peso unitário dos cogumelos como resultados de destino . Os substratos utilizados tiveram sua composição físico-química determinada e as taxas de suplementação do substrato foram otimizadas, não só para o rendimento em cultivo, mas também para o crescimento vegetativo do micélio. Os melhores resultados de BE em todas as linhagens foram obtidos em cultivos com RC/N 57,62/1, com indução dos primórdios em 130 dias de I(t). Os cogumelos colhidos nesta condição de produção tiveram sua composição centesimal determinada. Atividades enzimáticas amilolíticas e celulolíticas, β-glicosidase e proteases específicas foram realizadas em ensaios de colonização do substrato. Três linhagens foram selecionadas para o isolamento de esporos e hibridização intraespecífica. As linhagens híbridas foram comparadas com as parentais em termos de rendimento e síntese das enzimas extracelulares. Os resultados deste trabalho demonstraram que a linhagem cultivada tem um efeito considerável sobre o rendimento, sobre o peso unitário e sobre a síntese de enzimas extracelulares produzidas pelo fungo, tanto pelas linhagens híbridas, como pelas parentais. / The use of liquid inoculant production of Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) is a promising technology for the industrialization farming of this fungus in axenic system because it allows the mycelium inoculation in a quick and well distributed way, thus reducing the risks of contamination and the incubation time of cultures. In this work, the submerged cultivation for the production of Shiitake mycelium was evaluated in an airlift bioreactor of external circulation, conceived and designed in the group, using the culture medium Mushroom Complete Medium added of micronutrients, under the operating conditions: rates of aeration: 0.16, 0.20, and 0.24 vvm and inoculum sizes (i.s.): 1.0 g. L-1 and 2.0 g. L-1. Under the best operating condition (0.16 vvm and 1.0 g L-1 i.s.), a mathematical model was developed using the EMSO software to describe the kinetics of culture fittnes to experimental data. It was possible to obtain 15.47 g L-1 of total biomass, after 10 days of cultivation, a maximum specific growth rate of 0.516 d-1, yields of Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 and PX (productivity) 0.061 (g.L-1).h-1. The prediction of the model has proven to be a reliable parameter for studies for scaling up because it was predictive for biomass considering the products of metabolism (CO2 and H+ synthesis by acidification of the medium) and nutrient consumption (O2 and glucose). The selection and evaluation of strains in cultivation are also factors to be considered to obtain good productivity and, therefore, the productive performance of five strains of Shiitake cultivated under axenic system, was carried out using a central composition design (CCD) to evaluate the independent variables: incubation time I(t), and percentage of wheat bran in relation to sawdust of Eucalypitus saligna (represented by the carbon/nitrogen ratio (RC/N)), and having the biological efficiency (BE) and the unit weight of the mushrooms as target results. The best results for BE for all the strains were obtained in cultures with RC/N 57.62/1, with primordia induced at 130 days of I(t). The substrates used had their physico-chemical composition determined and the rates of substrate supplementation have been optimized, not only for the cultivation yields, but also for vegetative growth of the mycelium. The mushrooms harvested in this condition of production had their centesimal composition determined. Amilolytic, cellulolytic, β-glucosidase and specific proteases activities were performed in tests of colonization of the substrate. Three strains were selected for the isolation of spores and intraspecific hybridization was carried out. Hybrid strains were compared with the parental strains in terms of yields and synthesis of extracellular enzymes. The results of this study showed that strain has a considerable effect on both the yield and the unit weight of mushrooms.

A utilização de inóculos líquidos na produção de Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) é uma tecnologia promissora para a industrialização do cultivo em sistema axênico, uma vez que permite a inoculação do micélio de forma rápida e bem distribuída, reduzindo riscos de contaminação e o período de incubação dos substratos. Neste trabalho, o cultivo submerso para a produção de micélio de Shiitake foi avaliado em um biorreator airlift de circulação externa, idealizado e projetado no grupo, utilizando o meio de cultura Mushroom Complete Medium adicionado de micronutrientes, nas condições de operação: taxas de aeração: 0.16, 0.20, e 0.24 vvm e tamanhos de inóculo (i.s.): 1.0 g.L-1 e 2.0 g.L-1. Na melhor condição de operação (0.16 vvm e 1.0 g.L-1 i.s.), um modelo matemático foi desenvolvido usando o software EMSO para descrever a cinética da cultura em ajuste aos dados experimentais. Foram atingidos 15,47 g.L-1 de biomassa total, após 10 dias de cultivo, 0,516 d-1 de taxa máxima de crescimento específico, fatores de rendimento Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 e produtividade PX 0,061 (g.L-1).h-1. A predição do modelo demonstrou ser um parâmetro confiável para estudos de aumento de escala já que descreveu bons resultados preditivos para biomassa em relação aos produtos do metabolismo (CO2 e síntese de H+ pela acidificação do meio) e ao consumo de nutrientes (O2 e glicose). A seleção e a avaliação de linhagens no cultivo também são fatores a serem considerados para obtenção de boas produtividades e, deste modo, o desempenho produtivo de cinco linhagens de Shiitake foi avaliado em cultivo axênico, utilizando um planejamento composto central (CCD) para avaliar as variáveis independentes: tempo de incubação I(t), e percentual de farelo de trigo em relação a serragem Eucalypitus saligna (representada pela relação carbono/nitrogênio (RC/N)), tendo a eficiência biológica (BE) e o peso unitário dos cogumelos como resultados de destino . Os substratos utilizados tiveram sua composição físico-química determinada e as taxas de suplementação do substrato foram otimizadas, não só para o rendimento em cultivo, mas também para o crescimento vegetativo do micélio. Os melhores resultados de BE em todas as linhagens foram obtidos em cultivos com RC/N 57,62/1, com indução dos primórdios em 130 dias de I(t). Os cogumelos colhidos nesta condição de produção tiveram sua composição centesimal determinada. Atividades enzimáticas amilolíticas e celulolíticas, β-glicosidase e proteases específicas foram realizadas em ensaios de colonização do substrato. Três linhagens foram selecionadas para o isolamento de esporos e hibridização intraespecífica. As linhagens híbridas foram comparadas com as parentais em termos de rendimento e síntese das enzimas extracelulares. Os resultados deste trabalho demonstraram que a linhagem cultivada tem um efeito considerável sobre o rendimento, sobre o peso unitário e sobre a síntese de enzimas extracelulares produzidas pelo fungo, tanto pelas linhagens híbridas, como pelas parentais. / The use of liquid inoculant production of Shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) is a promising technology for the industrialization farming of this fungus in axenic system because it allows the mycelium inoculation in a quick and well distributed way, thus reducing the risks of contamination and the incubation time of cultures. In this work, the submerged cultivation for the production of Shiitake mycelium was evaluated in an airlift bioreactor of external circulation, conceived and designed in the group, using the culture medium Mushroom Complete Medium added of micronutrients, under the operating conditions: rates of aeration: 0.16, 0.20, and 0.24 vvm and inoculum sizes (i.s.): 1.0 g. L-1 and 2.0 g. L-1. Under the best operating condition (0.16 vvm and 1.0 g L-1 i.s.), a mathematical model was developed using the EMSO software to describe the kinetics of culture fittnes to experimental data. It was possible to obtain 15.47 g L-1 of total biomass, after 10 days of cultivation, a maximum specific growth rate of 0.516 d-1, yields of Yx/s 1,06 g.g-1, YP/X 0,485 (g.L-1).g-1, YP/S 0,140 (g.L-1).g-1 and PX (productivity) 0.061 (g.L-1).h-1. The prediction of the model has proven to be a reliable parameter for studies for scaling up because it was predictive for biomass considering the products of metabolism (CO2 and H+ synthesis by acidification of the medium) and nutrient consumption (O2 and glucose). The selection and evaluation of strains in cultivation are also factors to be considered to obtain good productivity and, therefore, the productive performance of five strains of Shiitake cultivated under axenic system, was carried out using a central composition design (CCD) to evaluate the independent variables: incubation time I(t), and percentage of wheat bran in relation to sawdust of Eucalypitus saligna (represented by the carbon/nitrogen ratio (RC/N)), and having the biological efficiency (BE) and the unit weight of the mushrooms as target results. The best results for BE for all the strains were obtained in cultures with RC/N 57.62/1, with primordia induced at 130 days of I(t). The substrates used had their physico-chemical composition determined and the rates of substrate supplementation have been optimized, not only for the cultivation yields, but also for vegetative growth of the mycelium. The mushrooms harvested in this condition of production had their centesimal composition determined. Amilolytic, cellulolytic, β-glucosidase and specific proteases activities were performed in tests of colonization of the substrate. Three strains were selected for the isolation of spores and intraspecific hybridization was carried out. Hybrid strains were compared with the parental strains in terms of yields and synthesis of extracellular enzymes. The results of this study showed that strain has a considerable effect on both the yield and the unit weight of mushrooms.

Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第22854号 / 農博第2437号 / 新制||農||1082(附属図書館) / 学位論文||R2||N5314(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 本田 与一, 教授 田中 千尋, 准教授 坂本 正弘 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM