Interaktion der FO Statoruntereinheiten a und b der ATP-Synthase aus Escherichia coli Die ATP-Synthase nimmt im Energiestoffwechsel vieler Organismen eine zentrale Stellung ein und ist ubiquitär in strukturell und funktionell homologer Form bei eukaryotischen Zellen in der inneren Mitochondrienmembran, der Thylakoidmembran von Chloroplasten und in der Cytoplasmamembran von Prokaryoten zu finden. Besonders zwischen F-, V- und A-Typ ATPasen bestehen strukturelle Ähnlichkeiten im Aufbaus des Gesamtenzyms aus zwei großen Subkomplexen. Darüber hinaus weisen die F-Typ ATPasen aller Organismen hohe Sequenzhomologien auf, welche sich auch in strukturellen Gemeinsamkeiten widerspiegeln. Als "Modellenzym" dient die FOF1 ATPase aus dem Enterobakterium Escherichia coli. Es setzt sich aus acht funktionell verschiedenen Untereinheiten zusammen, die unter Hydrolysebedingungen relativ zueinander rotieren. Die Unterteilung der Enzymstruktur in Rotor (g e -c-Oligomer) und Stator (a 3b 3d ab2) erfordert das Vorhandensein einer stabilisierenden Struktur, dem sog. "second stalk". Im Hinblick auf den Mechanismus der rotierenden ATP-Synthase und dem Modell der elastischen Kopplung erscheint die Untereinheit b geeignet, um die durch das g e -c-Oligomer aufgebaute Rotationsspannung zu speichern. Wie die beiden b Untereinheiten mit den anderen FO Untereinheiten a bzw. c interagieren ist weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Untereinheiten a und b auf mögliche Interaktionsstellen mit anderen Enzymuntereinheiten mittels genetisch eingefügte Cysteine und anschließender chemischer Quervernetzung untersucht. In der hier vorgestellten Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit dem Nulllängen Cross-linker Cu(1,10-Phenanthrolin)2SO4 [CuP] in der Region bP28C-bE39C möglich ist, Quervernetzungen zur Untereinheit a zu erzeugen. Mit den heterobifunktionellen Cross-linkern Benzophenon-4-maleimid [BPM] und N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3´-(2´-pyridydithio)propionamid [APDP] vergrößert sich diese Region. Dabei sind die a-b Interaktionen in einer gewissen Periodizität (bP28C, bL29C, bM30C, bA31C, bK38C und bE39C) zu beobachten, was für eine Beteiligung beider b Untereinheiten spricht. Neben dem immunologischen Nachweis durch Antikörper, konnte auch über ein N-terminales Polyhistidinmotiv (His12) gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den Untereinheiten a und b ausbildet wird. Der aN-His12-b Cross-link kann mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. b-Dimerisierungen konnten für die Reste bS60C, bL65C und die Region bY24C-bA45C nachgewiesen werden. Der relative Abstand der b Untereinheiten zueinander nimmt dabei in ihrem Verlauf vom Cytoplasma in Richtung Membran zu, wie mit den Cross-link Reagenzien CuP, BPM und APDP gezeigt werden konnte. Ausgehend von der Untereinheit a konnten für die Reste aS27C, aN33C, aA130C, aG173C, aP182C, aN184C, aS202C und aG227C ebenfalls CuP vermittelte Quervernetzungen mit der Untereinheit b nachgewiesen werden. Die Reaktion an der Position aS27C weist auf eine cytoplasmatische Lokalisation des N-Terminus hin, die in einem 6 Transmembran-Sekundärstrukturmodell vorgeschlagen wird. Mit BPM konnte die Nähe der Aminosäuren aN33C und aP182C zum c-Oligomer gezeigt werden.

The aim of the present study was the development of analytical methods which can be used for gaining a deeper insight into the mechanisms of hair treatment with cosmetic formulations like shampoos. The efficacy of such a formulation is affected by the amount of different active agents remaining on the hair after treatment. Due to the complex composition of most of the formulations various dependencies and interactions of the ingredients are possible. Beneath that a variety of parameters of the treatment process influence the substantivity. Finally the degree of hair damage present at the treatment process is significant. So the process of hair treatment with cosmetic formulations is very complex. The understanding of this process enables a systematic development of products with better or novel effectivity. The developed analytical methods provide the possibility of a parallel determination of different active agents and their interaction of the adsorption behaviour. Furthermore the determination of influencing variables like treatment conditions or hair damage can be performed. So it is possible to generate the knowledge necessary for excellent scientific product development. The general methodology for the method development consists of an extraction from hair followed by a selective and sensitive quantitation of the active agents located in the extract using LC/MS and LC/MS/MS. Analytical methods for the determination of the complex composed surface active agents Sodium Laureth Sulfate, Cocamidopropyl Betaine and Alkyl Polyglucoside were developed. During the evaluation process it could be figured out that significant swelling of the hair fibre does not occur during a hair wash lasting 2 min or less. Hence the active agents are mainly adsorbed at the hair surface. During method development it was found that the composition of these agents is changing during hair treatment resulting in a difference of the singles substance distribution on hair and in the shampoo. Additionally an analytical method for selective and sensitive quantitation of the cationic polysaccharides Polyquaternium-10 and Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride using LC/MS was developed. The parallel quantitation of Polyquaternium-10 and Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride enables to study their interaction of the adsorption behaviour. Beneath that the quantitation of substances with low active contentes, like Ubiquinone 50, Piroctone Olamine and Benzophenone?4, was carried out. The extraction behaviour of these substances showed that an extraction time of 7 min assisted by an ultrasonic treatment is optimal. Longer extraction leads to a significant increase of the active hair surface due to swelling. The result is a higher adsorption capacity of the hair fibre and thus a decreased analyte concentration in the extract. The reproducibility of the using treatment protocol was approved by parallel quantitation of several active agents. Due to variation of several treatment parameters their influence on substantivity was studied: the flow rate, temperature and hardness of the water for rinsing and the time for massaging in the formulation. Furthermore, it was shown that the degree of hair damage and further shampoo ingredients influence the substantivity of active agents. Finally it was demonstrated that the adsorption behaviour can be significantly influenced by the application strategy. / Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit der Entwicklung von analytischen Methoden eine Möglichkeit zu schaffen, um die Mechanismen bei der Haarbehandlung mit kosmetischen Formulierungen, wie Shampoos besser verstehen zu können. Die Pflegeleistung einer solchen Formulierung wird unter anderem davon bestimmt, wie viel der unterschiedlichen eingesetzten Wirkstoffe nach der Behandlung auf dem Haar verbleiben. Durch die Komplexität der kosmetischen Formulierungen kommt es zu vielfältigen Abhängigkeiten und Beeinflussungen der Substantivität der einzelnen Substanzen voneinander. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Parametern bei der Haarbehandlung, die die Substantivität beeinflussen. Schließlich spielt auch der Zustand des Haares eine entscheidende Rolle. Alles in allem handelt es sich bei der Behandlung des Haares mit kosmetischen Formulierungen um sehr komplexe Prozesse. Das Verständnis dieser Prozesse ermöglicht eine gezielte Entwicklung von Produkten mit besserem und zum Teil neuartigem Leistungsspektrum. Die entwickelten Analysenmethoden erlauben die parallele Bestimmung der auf dem Haar adsorbierten Menge verschiedener Wirkstoffe. Dadurch kann die gegenseitige Beeinflussung der Wirkstoffadsorption untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht das Methodenspektrum eine Bestimmung der Einflussgröße äußerer Parameter, wie der Waschbedingungen und innerer Parameter, wie der Haarschädigung. Damit ist es möglich, das notwendige Wissen für eine fortschrittliche, wissenschaftliche Produktentwicklung zu gewinnen. Der allgemeine Ansatz für die Entwicklung der Methoden beinhaltet eine Extraktion der Wirkstoffe vom Haar, gefolgt von einer selektiven und empfindlichen Quantifizierung im Extrakt mittels LC-MS und LC-MS/MS. Es wurden Analysenmethoden für die komplex zusammengesetzten oberflächenaktiven Wirkstoffe Sodium Laureth Sulfate, Cocamidopropyl Betaine und Alkyl Polyglucoside entwickelt. Dabei wurde durch Untersuchungen der Extraktion vom Haar bewiesen, dass die zweiminütige Haarwäsche nicht zu einem signifikanten Aufquellen des Haares führt, so dass die Wirkstoffe hauptsächlich an der Haaroberfläche adsorbiert werden. Außerdem wurde gezeigt, dass sich die Zusammensetzung dieser Wirkstoffe während der Haarwäsche ändert, so dass sich die Einzelsubstanzverteilung auf dem Haar von der im Shampoo unterscheidet. Des Weiteren wurde die selektive und empfindliche Quantifizierung der kationischen Polymere Polyquaternium-10 und Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride durchgeführt. Die parallele Quantifizierung beider Konditionierungsstoffe ermöglicht die Untersuchung, in welchem Umfang sich beide Polymere in ihrem Adsorptionsverhalten beeinflussen. Bei der Methodenentwicklung für die Quantifizierung der Wirkstoffe Ubiquinone, Piroctone Olamine und Benzophenone-4 zeigte sich, dass eine Extraktion über 7 min im Ultraschallbad die besten Ergebnisse brachte. Bei längerer Extraktionszeit vergrößert sich die Oberfläche des Haares durch Quellung, so dass sich der Anteil an adsorbierten Analyten wieder erhöht. Die Reproduzierbarkeit der Haarwäsche mit dem verwendeten Waschprotokoll wurde bestätigt, indem verschiedene Wirkstoffe parallel auf dem Haar quantifiziert wurden. Durch Veränderung der Waschparameter Einmassierzeit sowie Durchflussmenge, Temperatur und Härte des Spülwassers wurde der Einfluss dieser Parameter auf die Substantivität der Wirkstoffe untersucht. Darüber wurde gezeigt, dass sowohl der Schädigungsgrad des Haares als auch andere auf dem Haar befindliche Shampoo-Bestandteile einen Einfluss auf die Substantivität von Wirkstoffen haben. Schließlich wurde an einem Beispiel gezeigt, dass man die Substantivität von Wirkstoffen nicht nur durch die Zusammensetzung der kosmetischen Formulierung, sondern auch durch die Art der Anwendung entscheidend beeinflussen kann.

The aim of the present study was the development of analytical methods which can be used for gaining a deeper insight into the mechanisms of hair treatment with cosmetic formulations like shampoos. The efficacy of such a formulation is affected by the amount of different active agents remaining on the hair after treatment. Due to the complex composition of most of the formulations various dependencies and interactions of the ingredients are possible. Beneath that a variety of parameters of the treatment process influence the substantivity. Finally the degree of hair damage present at the treatment process is significant. So the process of hair treatment with cosmetic formulations is very complex. The understanding of this process enables a systematic development of products with better or novel effectivity. The developed analytical methods provide the possibility of a parallel determination of different active agents and their interaction of the adsorption behaviour. Furthermore the determination of influencing variables like treatment conditions or hair damage can be performed. So it is possible to generate the knowledge necessary for excellent scientific product development. The general methodology for the method development consists of an extraction from hair followed by a selective and sensitive quantitation of the active agents located in the extract using LC/MS and LC/MS/MS. Analytical methods for the determination of the complex composed surface active agents Sodium Laureth Sulfate, Cocamidopropyl Betaine and Alkyl Polyglucoside were developed. During the evaluation process it could be figured out that significant swelling of the hair fibre does not occur during a hair wash lasting 2 min or less. Hence the active agents are mainly adsorbed at the hair surface. During method development it was found that the composition of these agents is changing during hair treatment resulting in a difference of the singles substance distribution on hair and in the shampoo. Additionally an analytical method for selective and sensitive quantitation of the cationic polysaccharides Polyquaternium-10 and Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride using LC/MS was developed. The parallel quantitation of Polyquaternium-10 and Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride enables to study their interaction of the adsorption behaviour. Beneath that the quantitation of substances with low active contentes, like Ubiquinone 50, Piroctone Olamine and Benzophenone?4, was carried out. The extraction behaviour of these substances showed that an extraction time of 7 min assisted by an ultrasonic treatment is optimal. Longer extraction leads to a significant increase of the active hair surface due to swelling. The result is a higher adsorption capacity of the hair fibre and thus a decreased analyte concentration in the extract. The reproducibility of the using treatment protocol was approved by parallel quantitation of several active agents. Due to variation of several treatment parameters their influence on substantivity was studied: the flow rate, temperature and hardness of the water for rinsing and the time for massaging in the formulation. Furthermore, it was shown that the degree of hair damage and further shampoo ingredients influence the substantivity of active agents. Finally it was demonstrated that the adsorption behaviour can be significantly influenced by the application strategy. / Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit der Entwicklung von analytischen Methoden eine Möglichkeit zu schaffen, um die Mechanismen bei der Haarbehandlung mit kosmetischen Formulierungen, wie Shampoos besser verstehen zu können. Die Pflegeleistung einer solchen Formulierung wird unter anderem davon bestimmt, wie viel der unterschiedlichen eingesetzten Wirkstoffe nach der Behandlung auf dem Haar verbleiben. Durch die Komplexität der kosmetischen Formulierungen kommt es zu vielfältigen Abhängigkeiten und Beeinflussungen der Substantivität der einzelnen Substanzen voneinander. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Parametern bei der Haarbehandlung, die die Substantivität beeinflussen. Schließlich spielt auch der Zustand des Haares eine entscheidende Rolle. Alles in allem handelt es sich bei der Behandlung des Haares mit kosmetischen Formulierungen um sehr komplexe Prozesse. Das Verständnis dieser Prozesse ermöglicht eine gezielte Entwicklung von Produkten mit besserem und zum Teil neuartigem Leistungsspektrum. Die entwickelten Analysenmethoden erlauben die parallele Bestimmung der auf dem Haar adsorbierten Menge verschiedener Wirkstoffe. Dadurch kann die gegenseitige Beeinflussung der Wirkstoffadsorption untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht das Methodenspektrum eine Bestimmung der Einflussgröße äußerer Parameter, wie der Waschbedingungen und innerer Parameter, wie der Haarschädigung. Damit ist es möglich, das notwendige Wissen für eine fortschrittliche, wissenschaftliche Produktentwicklung zu gewinnen. Der allgemeine Ansatz für die Entwicklung der Methoden beinhaltet eine Extraktion der Wirkstoffe vom Haar, gefolgt von einer selektiven und empfindlichen Quantifizierung im Extrakt mittels LC-MS und LC-MS/MS. Es wurden Analysenmethoden für die komplex zusammengesetzten oberflächenaktiven Wirkstoffe Sodium Laureth Sulfate, Cocamidopropyl Betaine und Alkyl Polyglucoside entwickelt. Dabei wurde durch Untersuchungen der Extraktion vom Haar bewiesen, dass die zweiminütige Haarwäsche nicht zu einem signifikanten Aufquellen des Haares führt, so dass die Wirkstoffe hauptsächlich an der Haaroberfläche adsorbiert werden. Außerdem wurde gezeigt, dass sich die Zusammensetzung dieser Wirkstoffe während der Haarwäsche ändert, so dass sich die Einzelsubstanzverteilung auf dem Haar von der im Shampoo unterscheidet. Des Weiteren wurde die selektive und empfindliche Quantifizierung der kationischen Polymere Polyquaternium-10 und Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride durchgeführt. Die parallele Quantifizierung beider Konditionierungsstoffe ermöglicht die Untersuchung, in welchem Umfang sich beide Polymere in ihrem Adsorptionsverhalten beeinflussen. Bei der Methodenentwicklung für die Quantifizierung der Wirkstoffe Ubiquinone, Piroctone Olamine und Benzophenone-4 zeigte sich, dass eine Extraktion über 7 min im Ultraschallbad die besten Ergebnisse brachte. Bei längerer Extraktionszeit vergrößert sich die Oberfläche des Haares durch Quellung, so dass sich der Anteil an adsorbierten Analyten wieder erhöht. Die Reproduzierbarkeit der Haarwäsche mit dem verwendeten Waschprotokoll wurde bestätigt, indem verschiedene Wirkstoffe parallel auf dem Haar quantifiziert wurden. Durch Veränderung der Waschparameter Einmassierzeit sowie Durchflussmenge, Temperatur und Härte des Spülwassers wurde der Einfluss dieser Parameter auf die Substantivität der Wirkstoffe untersucht. Darüber wurde gezeigt, dass sowohl der Schädigungsgrad des Haares als auch andere auf dem Haar befindliche Shampoo-Bestandteile einen Einfluss auf die Substantivität von Wirkstoffen haben. Schließlich wurde an einem Beispiel gezeigt, dass man die Substantivität von Wirkstoffen nicht nur durch die Zusammensetzung der kosmetischen Formulierung, sondern auch durch die Art der Anwendung entscheidend beeinflussen kann.