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Le but de cette étude était d'élucider les mécanismes biochimiques qui régulent les canaux K$\sp+$ de type (GK$\rm\sb{Ca}),$ impliqués dans le contrôle du tonus des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR). Des mesures pharmacologiques ont permis de démontrer que le 3-morpholino-sydnonimine (SIN-1) relaxe des fragments de bronches de rat précontractées par 0.2 $\mu$M carbachol, de façon concentration-dépendante. Par contre, lorsque la contribution de la conductance potassique (GK) est éliminée, en présence de 135 mM KCl dans le milieu extracellulaire ou lorsque la guanylate cyclase soluble (GCs) est inhibée par 10 $\mu$M de bleu de méthylène (BM), l'effet relaxant du SIN-1 est moins efficace, ce qui suggère que le monoxyde d'azote (NO$\sp\cdot)\sp*$ pourrait activer plusieurs effecteurs pour induire son effet relaxant via deux voies: une voie dépendante du GMPc et une autre qui serait indépendante de ce messager. Un autre objectif envisagé était de démontrer que le NO avait un effet relaxant indépendant du GMPc, et qu'il pourrait être dû, en partie, à une activation directe des GK$\rm\sb{Ca}.$ Les tests pharmacologiques montrent que 100 nM de charybdotoxine (ChTX), un inhibiteur spécifique des GK$\rm\sb{Ca},$ changent la sensibilité des MLVR au SIN-1 lorsque la GCs est inhibée, ce qui indique que les GK$\rm\sb{Ca}$ pourraient être activées directement par le NO. Ces résultats ont été confirmés au niveau moléculaire, suite à la reconstitution des canaux dans les BLP. Le SIN-1 (NO), mais pas ses métabolites, active les GK$\rm\sb{Ca}$ avec une EC$\sb{50}$ évaluée à 30 $\mu$M SIN-1. Afin de vérifier le mode d'activation direct des GK$\rm\sb{Ca}$ par le NO, des expériences ont été réalisées en présence de 5 mM DTT, un agent réducteur qui empêche le NO d'activer les GK$\rm\sb{Ca},$ seulement lorsqu'il est ajouté du côté intracytoplasmique (trans) du canal. Ces résultats tendent à prouver que l'activation directe des GK$\rm\sb{Ca}$ des MLVR, résulterait d'une interaction du NO avec les groupements des chaînes latérales d'acides aminés, situés sur les boucles intracellulaires de la sous-unité $\alpha,$ selon un mécanisme de nitrosylation**. En revanche, le DTT n'est plus capable de renverser l'effet du NO, ce qui suggère l'implication de d'autres groupements autres que les SH avec lesquels interagit le NO. En conclusion, cette étude a permis de montrer, pour la première fois, que le NO pourrait augmenter la P$\rm\sb{o}$ des canaux K$\sp+$ de type GK$\rm\sb{Ca}$ des MLVR par un mécanisme indirect (phosphorylation) catalysée par la PKG en présence du GMPc et par une interaction directe (nitrosylation) avec la sous-unité $\alpha$ du canal, sans altérer la conductance ni la sensibilité du canal au Ca$\sp{2+}$ et au voltage, ce qui fait de ce type de canal un effecteur sensible et efficace dans le contrôle de la relaxation des MLVR Le NO dans un milieu biologique se trouve dans un état radicalaire NO actif. $\sp{**}$nitrosylation est un terme qui désigne l'interaction covalente entre le NO et les groupements SH des protéines. [Symboles non conformes]

Les parasporines sont des toxines Cry du bacille de Thuringe actives contre des cellules tumorales. Ce travail montre que la parasporine PS1Aa2 (Cry31Aa2) forme des pores dans des membranes artificielles, comme de nombreuses toxines Cry. Ceux-ci ont plusieurs niveaux de conductance dont les plus fréquents étaient de 11, 16 et 21 pS dans une solution de 150 mM KCl. Nos résultats de microspectrofluorométrie avec la sonde Fura-2 montrent que la présence de la PS1Aa2 peut produire des augmentations du calcium intracellulaire, la plupart du temps sous la forme d’oscillations calciques et parfois des augmentations soutenues. Ces réponses ont été observées en présence et en absence de calcium extracellulaire, dans les lignées tumorales HeLa et HepG2 et dans la lignée non tumorale HEK 293. Bien que quelques études aient montré que le calcium semble intervenir dans leur mode d’action, de telles oscillations calciques n’ont jamais été décrites auparavant pour des toxines Cry. Les expériences ont dû être faites à des concentrations beaucoup plus élevées de toxine que prévues sur la base des résultats publiés de cytotoxicité. Malgré la présence des fragments identifiés auparavant comme actifs, sa faible efficacité semble liée à la présence d’ADN dans les préparations qui entraîne la précipitation de la protéine. Les travaux futurs sur cette toxine seraient donc grandement facilités par une amélioration de sa méthode de préparation. / Parasporins are Cry toxins from Bacillus thuringiensis that are active against tumor cells. This work shows that parasporin PS1Aa2 (Cry31Aa2) forms pores in artificial membranes like many Cry toxins. These pores have several levels of conductance; the most frequently seen in 150 mM KCl solutions were of 11, 16 and 21 pS. Our microspectrofluorometric results with the Fura-2 probe showed that the presence of PS1Aa2 can induce changes in intracellular calcium levels, most often in the form of calcium oscillations and sometimes as sustained increases. Such responses were observed in the presence and absence of extracellular calcium, with the tumor cell lines HeLa and HepG2, and with the non-tumorous cell line HEK 293. Calcium oscillations have not been described previously for Cry toxins even though some studies have shown that calcium appears to be involved in their mode of action. Our experiments required the use of much higher concentrations of toxin than suggested from the published cytotoxicity results. Despite the presence of fragments previously identified as active, its low efficacy appears to be related to the presence of DNA in the preparations causing the protein to precipitate. Future work on this toxin would therefore be greatly facilitated by an improvement in its method of preparation.