O 2,3-butanodiol (2,3-BDO) é um composto com potencial de uso em diferentes segmentos industriais, podendo ser obtido por síntese química tradicional ou via processos fermentativos a partir de diferentes fontes de carbono. Entre suas aplicações potenciais, destaca-se a utilização como precursor na indústria de polímeros, matéria-prima na produção de solventes, agente anticongelante, combustível líquido ou aditivo de combustíveis. A síntese de 2,3-BDO pela fermentação do glicerol subproduto da indústria de biodiesel por bactérias anaeróbias facultativas é particularmente atrativa, considerando-se a grande disponibilidade desta matéria-prima e a possibilidade de integração de processos e produtos no conceito de biorrefinaria. Entretanto, o uso do glicerol subproduto para este fim, deve ser ainda cuidadosamente avaliado, considerando a significativa quantidade de impurezas nele contidas. Neste trabalho, avaliou-se a utilização do glicerol subproduto em meio mineral, para o crescimento celular e produção de estereoisômeros de 2,3-BDO e acetoína por Klebsiella oxytoca ATCC 8724 e Enterobacter aerogenes ATCC 13048. Os resultados foram comparados com os alcançados om o uso de glicerol puro e glicose, em ensaios em regime descontínuo alimentado com concentração inicial de substrato (S0) de 80 g/L, em meio mineral padrão (PC), frequência dos agitadores de 700 rpm e fluxo específico de ar de 0,50 volumes de ar por volume de meio por minuto (vvm). Na sequência, foram realizados ensaios fermentativos com E. aerogenes com glicerol subproduto e diferentes meios de cultivo relatados na literatura, com S0 = 40 g/L, variação da frequência dos agitadores (650 a 750 rpm) e do fluxo específico de ar (0,50 a 0,87 vvm). Para a otimização do meio de cultivo, realizou-se um planejamento experimental do tipo Box-Behnken Design-3k, com a avaliação de três variáveis independentes - (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 e MgSO4.7H2O -, em três níveis. A avaliação cinética do cultivo de E. aerogenes no meio definido foi realizada em regime descontínuo em comparação ao uso do meio mineral padrão (PC). As metodologias analíticas utilizadas no decorrer da pesquisa foram validadas. Como resultados, nos cultivos com E. aerogenes em regime descontínuo alimentado, empregando-se glicerol puro e subproduto como substratos, rendimentos (ρ) da ordem de 82 e 84%, respectivamente, foram atingidos, sendo superiores ao obtido com glicose (71%). Nos ensaios conduzidos com diferentes formulações de meios de cultivos, a produção de biomassa foi favorecida na primeira etapa da fermentação com o uso do meio MD4, sendo cerca de 38% superior em relação ao meio mineral padrão (PC). Nos ensaios de otimização, E. aerogenes foi capaz de adaptar-se frente às diferentes concentrações dos sais presentes no meio contendo glicerol subproduto. Visando maximizar os resultados em termos de produção específica em relação à biomassa (YP/X), fator de conversão de substrato em produtos (YP/S) e concentração final de produtos (Pf), a partir dos resultados da otimização, sugere-se a utilização de um meio de cultivo definido contendo (g/L): glicerol, 80; (NH4)2SO4, 7,71; (NH4)2HPO4, 3,15; MgSO4.7H2O, 0,6; KOH, 0,45. Considerando o conjunto de características dos métodos cromatográficos e espectrofotométricos utilizados, ambos são adequados para aplicação nesta pesquisa, fornecendo resultados confiáveis das fermentações. De forma geral, os resultados alcançados indicam a aplicabilidade do glicerol subproduto como substrato para a produção fermentativa de 2,3-BDO e acetoína pelas bactérias anaeróbias facultativas Klebsiella oxytoca ATCC 8724 e Enterobacter aerogenes ATCC 13048. Além disso, também foi demonstrado que a produção de 2,3-BDO pode ser conduzida com E. aerogenes a partir de glicerol subproduto, empregando-se meios simplificados em comparação ao padrão descrito na literatura, significando um ganho econômico para esta fermentação. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES / 2,3-butanediol (2,3-BDO) is a compound with potential to be used in different industrial segments, that can be obtained by traditional chemical synthesis or via fermentative processes from different carbon sources. Among its potential applications, it is included the use as chemical building blocks in polymer industries, raw material for the production of solvents, antifreeze agent, liquid fuel or fuel additive. The synthesis of 2,3-BDO by the fermentation of glycerol by-product of the biodiesel industry by facultative anaerobic bacteria is particularly attractive considering the high availability of this substrate and the possibility of integrating processes and products into the concept of biorefinery. However, the use of the by-product glycerol for this purpose is still to be carefully assessed considering the significant amount of impurities it contains. In this work, the use of by-product glycerol in mineral medium for the cell growth and the production of stereoisomers of 2,3-BDO and acetoin by Klebsiella oxytoca ATCC 8724 and Enterobacter aerogenes ATCC 13048 was evaluated. The results were compared with those obtained with the use of pure glycerol and glucose, in fed-batch cultivations with initial substrate concentration (S0) of 80 g.L-1, standard mineral medium (PC), impeller speed of 700 rpm, and air flow rate of 0.50 volumes of air per volume of medium per minute (vvm). In order, cultivations with E. aerogenes with by-product glycerol and different culture media reported in the literature, with S0 = 40 g.L-1, variation of the impeller speed (650 to 750 rpm) and the specific air flow rate (0.50 to 0.87 vvm), were carried out. For the optimization of the culture medium, an experimental Box-Behnken Design -3k was performed, with the evaluation of three independent variables – (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 and MgSO4.7H2O –, at three levels. The kinetic evaluation of the cultivation of E. aerogenes in the defined medium was performed in batch fermentations in comparison to the use of the standard mineral medium (PC). The analytical methodologies used during the research were validated. As results, in fed-batch cultivations with E. aerogenes, using pure glycerol and by-product as substrates, yields (ρ) of the order of 82 and 84%, respectively, were reached, higher than that obtained with glucose (71%). In the trials conducted with different formulations of culture media, biomass production was favored in the first fermentation stage using the MD4 medium, about 38% higher than the standard mineral medium (PC). In the optimization experiments, E. aerogenes was able to adapt to the different concentrations of the salts present in the medium containing by-product glycerol. In order to maximize the results in terms of specific production factorin relation to biomass (YP/X), product from substrate conversion factor (YP/S) and final product concentration (Pf), from the optimization results, it is suggested the use of a defined medium containing (g.L-1): glycerol, 80; (NH4)2SO4, 7.71; (NH4)2HPO4, 3.15; MgSO4.7H2O, 0.6, KOH, 0.45. Considering the set of characteristics of the chromatographic and spectrophotometric methods used, both are suitable for application in this research, providing reliable results of the fermentations. In general, the results indicate the applicability of by-product glycerol as a substrate for the fermentative production of 2,3-BDO and acetoin by the facultative anaerobic bacteria Klebsiella oxytoca ATCC 8724 and Enterobacter aerogenes ATCC 13048. In addition, it has also been demonstrated that the production of 2,3-BDO can be conducted by E. aerogenes from by-product glycerol, using simplified media in comparison to the standard one described in the literature, which would positively reflect in the costs for this fermentation.