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Antibodies and antibody fragments are essential tools in basic research, diagnostics and therapy. Conventional antibodies consist of two heavy and two light chains with both chains contributing to the antigen-binding site. In addition to these conventional antibodies, camelids (llamas, alpacas, dromedaries and camels) possess so-called heavy chain antibodies (hcAbs) that lack the light chains. The antigen binding site of these unusual antibodies is formed by one single domain only, the so called VHH domain. The VHH domain represents the smallest intact antigen binding fragment (~ 15 kDa) and is characterized by very high stability, solubility and specificity. These unique features render VHHs a promising alternative to conventional antibodies and antibody fragments with a multitude of possible applications. In the course of this thesis, we aimed to generate and characterize VHHs suitable for different applications ranging from biochemical studies to immunofluorescence assays and live cell imaging. In order to meet the diverse requirements of the intended downstream applications, a new selection method differing from traditional phage display, called native panning, was developed and established. In combination with the protein-protein interaction fluorescent two-hybrid (F2H) assay, a new process to identify antigen specific VHHs functional inside living cells was developed. We used the immune system of alpacas to generate VHH libraries against various antigens, ranging from small peptides to large proteins. The libraries were screened by phage display and antigen specific VHHs were identified by phage ELISA. We were able to identify antigen specific VHHs against different antigens which were characterized and their functionality was tested in various applications. Furthermore, we could demonstrate that the selection method influences which VHHs are identified and therefore needs to be chosen very carefully with regard to the intended biochemical and cell biological application. In summary, we developed and established an efficient and versatile process to screen and identify antigen specific VHHs suitable for different downstream applications.

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Die Diagnose einer Unterernährung bei Kindern und Erwachsenen ist in der Pädiatrie und Geriatrie ein wichtiges Thema. Aber auch in der Forensik spielt sie eine große Rolle, gerade im Falle von Vernachlässigung und Missbrauch schutzbefohlener Personen. Derzeit existieren kaum Methoden, um zuverlässig den Zeitrahmen einer Unterernährung rückwirkend zu bestimmen. Die Analyse der stabilen Stickstoff- und Kohlenstoffisotope (δ15N-, δ13C-Wert) im Haarkeratin ist in der Anthropologie ein etabliertes Verfahren zur Untersuchung der menschlichen Ernährung und des individuellen Ernährungszustandes. Bei einem mangelhaften Ernährungszustand müssen die körpereigenen Protein- und Energiereserven angegriffen und wiederverwertet werden. Dieser sogenannte Hungerstoffwechsel zeigt sich auch in der biochemischen Zusammensetzung des Haarkeratins. Mithilfe von seriellen Analysen an Haarproben wird nach spezifischen Signaturen der N- und C-Isotope gesucht, welche sich während einer Unterernährung ausbilden. So soll ein verlässlicher Indikator entwickelt werden, welcher es ermöglicht, den Beginn und die Dauer einer Unterernährung zu rekonstruieren. Bei dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Analyse von Haarproben aus der Rechtsmedizin. Jeder dieser 17 Fälle weist eine ausgeprägte Unterernährung auf. Daneben wurden in einer kleinen Vorstudie vier Haarprobe von Magersuchtpatienten untersucht. Trotz unbekannter Ernährungsgewohnheiten kann mit Hilfe der Isotopendaten in den meisten Fällen ein mangelhafter Ernährungszustand diagnostiziert werden. In einigen Fällen ist es sogar möglich, einzelne Unterernährungsphasen voneinander abzugrenzen. Zudem lassen sich mitunter auch Erholungsphasen erkennen, in denen sich der Ernährungszustand scheinbar kurzfristig gebessert hat. Jedoch ist es bisher noch nicht gelungen, allgemein gültige Erkennungsmerkmale aufzustellen, welche bei allen Fällen ausnahmslos zur Bestimmung einer Unterernährung angewendet werden können. Folglich muss weiterhin jeder einzelne Unterernährungsfall individuell analysiert und ausgewertet werden. Des Weiteren wurde an acht Haarproben aus der Rechtsmedizin die spezifische Aminosäurezusammensetzung des Haarkeratins während eines schlechten Ernährungszustandes analysiert. Dabei wurde versucht, der Unterernährungssignatur der δ-Werte weiter auf die Spur zu kommen. Die Daten zeigen, dass vor allem die Aminosäure Prolin während der Unterernährungsphasen vermehrt im Haarkeratin zu finden ist. Zwar lässt sich zwischen dem Verlauf der δ-Werte und der erhöhten Prolinmenge noch kein direkter Zusammenhang erkennen, jedoch wird deutlich, dass sich die Ergebnisse der Isotopendaten und der Aminosäureanalyse gegenseitig stützen und so zu einer besseren Aufklärung von Unterernährungsfällen beitragen können. Da die Entwicklung und der spezifische Verlauf der δ13C-Werte während einer Unterernährung noch nicht vollständig geklärt sind, wurde ein weiteres Probandenkollektiv in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurden Haarproben von sechs Probanden gesammelt, welche an einer medizinisch betreuten Fastentherapie teilnahmen. Durch Haaranalysen und weitere Untersuchungen sollte geklärt werden, ob 12C-Isotope aus den abgebauten, körpereigenen Fettreserven auch als Bausteine für das Haarkeratin Verwendung finden und so für das Absinken des δ13C-Wertes bei einigen Unterernährungsfällen verantwortlich sind. Es konnte mithilfe dieser Fastenstudie allerdings nicht bewiesen werden, dass leichte Kohlenstoffisotope aus den abgebauten Fettreserven ins Keratin eingebaut werden. Die Ergebnisse aus den drei Probandenkollektiven bestätigen jedoch eindeutig, dass mit Hilfe der seriellen Isotopenanalytik an Haaren sowohl eine Umstellung der Ernährung erkannt, als auch die Qualität des individuellen Ernährungszustandes beurteilt werden kann. Aufgrund dessen könnte gerade diese Methode bei der Aufklärung von Vernachlässigungsfällen, aber auch bei der Prävention gute Dienste leisten. Dennoch gilt es in zukünftigen Forschungsansätzen noch einige Problemstellungen zu überwinden, um dieses Ziel vollständig zu erreichen.

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T cells recognizing myelin auto-antigens penetrate into the CNS to induce inflammatory autoimmune disease following complex sequential interactions with individual components of the vascular blood-brain barrier (BBB), particularly endothelial cells, and perivascular phagocytes. To determine the functional consequences of these processes, two-photon intravital imaging was performed to compare the behavior of three myelin-specific GFP-expressing T cell lines with different potentials for transferring Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Imaging documented that, irrespective of their pathogenic potential, all T cell lines reached the CNS and interacted with vascular endothelial cells indistinguishably, crawling on the luminal surface, preferably against blood flow, before crossing the vessel wall. In striking contrast, after extravasation the T cell motility and their interactions with perivascular antigen presenting cells (APCs) varied dramatically. While highly encephalitogenic T cells showed a low motility, made stable contacts with local APCs and became activated, the corresponding contacts of weakly encephalitogenic T cells remained short, their motility high and their activation marginal. Supplying auto-antigen, via either local injection or by transfer of antigen-pulsed meningeal APCs, lowered their motility and prolonged the contact duration of weakly encephalitogenic T cells to values characteristic for highly pathogenic ones. Only after exogenous antigen supply, the weakly encephalitogenic T cells became activated, infiltrated the CNS parenchyma, and triggered clinical EAE, suggesting that the strength of the antigen-dependent signals received by immigrating effector T cells from leptomeningeal APCs is crucial for their pathogenic effect within the target tissue. To directly correlate the activation of encephalitogenic T cells with their dynamic behavior in the CNS, a truncated fluorescent derivative of nuclear factor of activated T cells (NFAT) was introduced as a real-time activation indicator. Two-photon imaging documented the activation of the auto-reactive T cells extravasated into the perivascular space, but not within the vascular lumen. Activation correlated with reduced T cell motility, and it was related to contacts with the local APCs. However, it did not necessarily lead to a long-lasting arrest, as individual, activated T cells SUMMARY 2 were able to sequentially contact other APCs. A spontaneous cytosol-nuclear translocation of the marker was noted only in T cells with a high pathogenic potential. The translocation implied the presentation of an auto-antigen, as the weakly pathogenic T cells, which remained silent in the untreated hosts, were activated upon the instillation of exogenous auto-antigen. It is proposed here that the presentation of local auto-antigen by BBB-associated APCs provides stimuli that guide autoimmune T cells to the CNS destination and enable them to attack the target tissue. In addition, a theoretical, physicist approach was used for modeling T cell activation in the leptomeningeal space. Assuming that T cells have evolved to gain their activation signal in a way that is energetically optimal for them, two possible scenarios for T cell activation were compared. The first one assumes that, after finding an APC presenting the epitope of interest, the T cell will stop and interact with the APC until it becomes fully activated. The second model considers the possibility that a T cell can accumulate activation signals from different APCs while scanning them without stopping, until a certain threshold is exceeded and the T cell becomes activated. Using this approach, it is proposed that the T cells in EAE are more likely to become activated following the first scenario. However, in a more natural environment such as a lymph node, the second scenario could give them some advantages