This dissertation addresses an issue of key importance to the field of systematics, namely how to foster taxonomic work and the dissemination of knowledge about species by taking full advantage of electronic data and bioinformatic tools. I tested and applied modern systematic tools to produce an electronic monograph of a family of flowering plants, Caricaceae. In addition to a taxonomic revision, a molecular phylogeny of the family that includes representatives of all biological species clarifies the evolutionary relationships. Based on the plastid and nuclear DNA data, I inferred historical processes that may have shaped the evolution of the Caricaceae and explain their current geographic distribution.

Serine proteases in cytoplasmic granules of neutrophils (NSPs), namely neutrophil elastase, cathepsin G (CG) and proteinase 3, have been under intense investigation for several decades. They are mainly known for their role in intracellular killing of pathogens and are also increasingly recognized as key regulators of innate immune responses. In 2009, I identified a fourth serine protease in neutrophils that has been completely overlooked and neglected so far. The aim of this thesis was an in-depth biochemical and functional characterization of this novel serine protease 4 (NSP4) of human neutrophils. Using monoclonal antibodies to NSP4, the distribution of NSP4 in normal human tissues was studied. NSP4 was observed only in neutrophils and neutrophil precursors of the bone marrow. The content of NSP4 in neutrophil lysates was about 20-fold lower compared to CG. Nevertheless, NSP4 was found to be released into the supernatant upon neutrophil activation. NSP4 could be further identified as a novel azurophil granule protein of neutrophils by Western blot analyses of subcellular fractions. For the functional analysis, the production and yield of recombinant NSP4 was clearly improved using different expression systems and DNA construct modifications. The proteolytic specificity was analyzed using E. coli peptide libraries, mass spectrometry and several synthetic peptide libraries. All these analyses clearly revealed an arginine specificity for NSP4. Consistent with this, NSP4 was strongly inhibited by heparin-accelerated antithrombin and C1 inhibitor and, with lower efficacy, by α1-proteinase inhibitor (α1PI). The data allowed me to generate an NSP4-specific α1PI variant that was shown to form covalent complexes with all NSP4 of neutrophil lysates and supernatants of activated neutrophils. This finding strongly indicated that NSP4 is fully processed and stored as an already activated enzyme in azurophil granules. In addition, dipeptidyl peptidase I (DPPI) was identified as the activator of NSP4 in vivo, as DPPI deficiency resulted in complete absence of NSP4 in a Papillon-Lefèvre patient. Analysis of cell-based calcium assays revealed that proteinase-activated receptor-2 may represent a potential natural substrate of NSP4. So far, NSP4-deficient mice did not show an abnormal phenotype under clean housing conditions. Activation of isolated neutrophils by phorbol esters or immune complexes was also not impaired. This study establishes NSP4 as the only arginine-specific pre-activated serine protease stored in azurophil granules of neutrophils that may fullfil a quite distinct, supportive role in neutrophil responses to tissue damage and bacterial infections. / Die Granula-assoziierten Serinproteasen der Neutrophilen, genannt Neutrophilen-Elastase, Cathepsin G (CG) und Proteinase 3, werden bereits seit über 30 Jahren intensiv erforscht. Sie sind hauptsächlich für ihre Funktion bei der intrazellulären Degradation von pathogenen Keimen bekannt. Außerdem werden sie zunehmend als wichtige Regulatoren der angeborenen Immunantwort angesehen. Im Jahr 2009 identifizierte ich eine vierte Serinprotease in Neutrophilen, die bis dahin komplett übersehen wurde. Das Ziel dieser Arbeit war eine ausführliche Untersuchung der Biochemie und Funktion dieser neuen Serinprotease 4 (NSP4) in humanen Neutrophilen. NSP4 konnte in immunhistochemischen Analysen normaler Gewebe nur in Neutrophilen und deren Vorläuferzellen im Knochenmark nachgewiesen werden. Die Menge von NSP4 im Gesamtzelllysat von Neutrophilen war 20-fach geringer als die von CG. Dennoch konnte ich nachweisen, dass NSP4 von aktivierten Neutrophilen sezerniert wird. In subzellulären Neutrophilen-Fraktionen war NSP4 in erster Linie mit azurophilen Granula assoziiert. Die Produktion und Ausbeute rekombinanter, aktiver NSP4 wurde mithilfe verschiedener DNA-Konstrukte und Expressionssysteme deutlich verbessert. Für die Bestimmung der proteolytischen Spezifität wurden E. coli Peptidbibliotheken, Massenspektrometrie und synthetische Peptidbibliotheken eingesetzt. Alle Ergebnisse ergaben eindeutig eine Arginin-Spezifität für NSP4. NSP4 wurde sehr gut von Heparin-Antithrombin, C1 Inhibitor und mit geringerer Effizienz von α1-Proteinase-Inhibitor (α1PI) blockiert. Die Ergebnisse ermöglichten die Herstellung einer NSP4-spezifischen α1PI Variante, die nachweislich mit der gesamten NSP4 aus Neutrophilen-Zelllysat und aus Überständen aktivierter Neutrophilen einen kovalenten Komplex bildete. Dies war ein klarer Hinweis für die Speicherung und Sekretion der NSP4 als aktive Endoprotease. Außerdem konnte ich zeigen, dass NSP4 in vivo von Dipeptidylpeptidase I (DPPI) aktiviert wird, da in einem Papillon-Lefèvre Patienten ohne funktionelle DPPI auch NSP4 nicht nachweisbar war. Intrazelluläre Kalziummessungen in HaCaT-Zellen ergaben, dass der Proteinase-aktivierte Rezeptor-2 ein mögliches natürliches Substrat für NSP4 sein könnte. In einer Pathogen-freien Reinraumumgebung zeigten NSP4-defiziente Mäuse bislang noch keinen Phänotyp. Auch die Aktivierung isolierter Neutrophilen durch Phorbolester oder Immunkomplexe war nicht beeinträchtigt. In dieser Arbeit gelang es mir, die erste aktive Arginin-spezifische Serinprotease (NSP4) in azurophilen Granula von Neutrophilen zu identifizieren. Wegen ihres Vorkommens in allen sequenzierten Genomen höherer Vertebraten könnte NSP4 eine wichtige Rolle bei der Steuerung und Verstärkung Neutrophilen-abhängiger Immunantworten zukommen.

Actin is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells and regulation of the microfilament system is crucial for a wide range of cellular functions including cell shape, cell motility, cell division and membrane dynamics. The aim of this thesis was (1) to gain a better understanding of the function of distinct actin binding domains in the regulation of the actin cytoskeleton and (2) to elucidate the role of actin variants. WH2 domains (WH2, Wiskott-Aldrich syndrome protein homology 2) are ubiquitous multifunctional regulators of actin dynamics. The protein Spire contains four central WH2 domains A-B-C-D with about 20 amino acids each and the cyclase-associated protein CAP2 contains only one WH2 domain. Under certain conditions, they can (1) nucleate actin polymerization, (2) disintegrate actin filaments and (3) sequester actin monomers. Here, the influence of selected Drosophila melanogaster Spire-WH2 and Mus musculus CAP2-WH2 domain constructs on actin dynamics was tested in vitro. To act as a filament nucleator, at least two WH2 domains are required, and nucleation of actin polymerization was only observed at substoichiometric concentrations of WH2 domains over actin. At higher concentrations, the sequestering activity of WH2 domains takes over. Preformed and purified SpireWH2-actin complexes act as extremely efficient nuclei for actin polymerization, even at superstoichiometric WH2 concentrations, under which free WH2 domains would sequester actin. All analyzed constructs, including these with only a single WH2 domain, sequester actin as well as they can disrupt filaments. This latter and most peculiar behavior of WH2 domains was observed in fluorometric, viscometric and TIRF assays. The WH2 domains seem to have such a high affinity for actin that they can forcefully sequester monomers even from filaments and filament bundles, thus breaking the whole structures. Taken together, the data clearly show that SpireWH2-actin complexes are the intermediates that account for the observed nucleating activity, whereas free WH2 domains can disrupt filaments and filament bundles within seconds, again underlining the intrinsic versatility of this regulator of actin dynamics. These data have been confirmed by crystallography in collaboration with the groups of Prof. Dr. Tad Holak and Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried, Germany). Besides the well-studied conventional actins many organisms harbor actin variants with unknown function. The model organism Dictyostelium discoideum comprises an actinome of a total of 41 actins, actin isoforms and actin-related proteins. Among them is filactin, a highly conserved actin with an elongated N-terminus. The 105 kDa protein has a distinct domain organization and homologs of this protein are present in other Dictyosteliidae and in some pathogenic Entamoebae. Here, the functions of filactin were studied in vivo and in vitro. Immunofluorescence studies in D. discoideum localize endogenous and GFP-filactin in the cytoplasm at vesicle-like structures and in cortical regions of the cell. A most peculiar behavior is the stress-induced appearance of full length filactin in nuclear actin rods. To perform in vitro analyses recombinant filactin was expressed in Sf9 cells. Fluorescence studies with the filactin actin domain suggest that it interferes with actin polymerization by sequestering G-actin or even capping filaments. Gel filtration assays propose a tetrameric structure of full length filactin. Protein interaction studies suggest that filactin is involved in the ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) pathway which is responsible for multivesicular body formation. The data on filactin suggest that only the conventional actins are the backbone for the microfilamentous system whereas less related actin isoforms have highly specific and perhaps cytoskeleton-independent subcellular functions. / Aktin ist als Bestandteil des Zytoskeletts eines der häufigsten Proteine in allen eukaryontischen Zellen. Eine genaue Regulation des Mikrofilamentsystems ist essentiell für Zellform, Zellmigration, Zellteilung und Membrandynamik. Ziel dieser Arbeit war (1) die Funktion von ausgewählten Aktin Bindedomänen in der Regulation des Aktin Zytoskeletts zu untersuchen und (2) die Funktion von Aktinvarianten zu verstehen. WH2 Domänen (WH2, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein Homologie 2) sind kurze, konservierte Sequenzmotive (ca. 20 Aminosäuren), welche bevorzugt monomere Aktinmoleküle binden. Von besonderem Interesse waren Drosophila melanogaster Spire-WH2 und Mus musculus CAP2-WH2 Konstrukte. Das Protein Spire enthält vier WH2 Domänen (A-B-C-D) wohingegen CAP2 (Cyclase-assoziiertes Protein 2) nur eine WH2 Domäne besitzt. Diese WH2 Domänen können unter bestimmten Bedingungen (1) die Aktinpolymerisation stimulieren, (2) Aktinfilamente zerstückeln und (3) Aktinmonomere sequestrieren. Für die Nukleation der Aktinpolymerisation müssen mindestens zwei hintereinander angeordnete WH2 Domänen vorhanden sein und unterstöchiometrische Mengen an WH2 Domänen im Vergleich zur Aktinkonzentration vorliegen. Bei höheren WH2 Konzentrationen überwiegt die Sequestrierungsaktivität. Polymerisationsexperimente mit vorgefertigten SpireWH2-Aktin Komplexen bestätigen, dass diese Komplexe für die beobachtete Nukleation der Aktinpolymerisation verantwortlich sind. Im Gegensatz zu ungebundenen WH2 Domänen sind diese WH2-Aktin Komplexe selbst bei überstöchiometrischen WH2 Konzentrationen äußerst effiziente Nukleatoren. Alle untersuchten WH2 Konstrukte zeigen die bereits bekannte Bindung an G-Aktin, können aber auch vorgeformte Aktinfilamente sogar auseinanderreißen. Diese letztere und besonders auffällige Eigenschaft von WH2 Domänen wurde in fluorometrischen, viskometrischen und TIRF Experimenten nachgewiesen. Anscheinend ist die Affinität der WH2 Domänen zu Aktinmonomeren so stark, dass sie diese aus den Filamenten entfernen können und damit ganze Filamente und Filamentbündel zerstückeln. Für die Multifunktionalität der analysierten konservierten WH2 Domänen spricht zusammenfassend, dass sie neben der Aktinfilament Nukleation auch Filamente und Filamentbündel innerhalb von Sekunden fragmentieren können. Diese Daten wurden in Kollaboration mit den Gruppen Prof. Dr. Tad Holak und Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried) durch kristallographische Versuchsansätze bestätigt. Neben den gut untersuchten konventionellen Aktinisoformen liegen oft auch Aktinvarianten vor, deren Funktion bisher unbekannt ist. Der Modellorganismus Dictyostelium discoideum besitzt mit seinen 41 Aktinen und Aktin-verwandten Proteinen ein umfangreiches „Aktinom”. Dazu gehört auch das Protein Filaktin (105 KDa), eine besonders außergewöhnliche Aktinvariante, die neben der konservierten Aktin-ähnlichen Domäne zusätzlich einen verlängerten N-Terminus mit einer definierten Domänenstruktur besitzt. Homologe von Filaktin wurden bisher in Dictyosteliden und einigen pathogenen Entamoeben identifiziert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Funktionen von Filaktin in vivo und in vitro analysiert. Immunfluoreszenz Experimente zeigen, dass Filaktin mit konventionellem Aktin kolokalisiert und zusätzlich im Zytoplasma an Vesikel-artigen Strukturen zu sehen ist. Ein besonderes Merkmal von Filaktin ist zudem, dass es Teil von Stress-induzierten, intranukleären, stäbchenförmigen Proteinaggregaten, sogenannten „nuclear rods” ist. Für umfassende in vitro Experimente wurden rekombinante Filaktin Konstrukte mithilfe von Sf9 Insektenzellen exprimiert. Die Ergebnisse von fluorometrischen und viskometrischen Experimenten deuten darauf hin, dass die Aktin Domäne von Filaktin Aktinmonomere sequestrieren oder sogar Aktinfilamente verkappen kann. Gelfiltrationsexperimente ergaben zusätzlich, dass Filaktin wohl als Tetramer vorliegt. Außerdem verbinden Protein-Interaktionsstudien Filaktin mit dem ESCRT Signalweg (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport), der unter anderem bei der Entstehung von multivesikulären Körpern wichtig ist. Zusammengefasst besteht das Mikrofilamentsystem vermutlich hauptsächlich aus konventionellen Aktinen, wohingegen spezielle Aktinvarianten andere zusätzliche und sogar Zytoskelett-unabhängige Funktionen übernehmen können.

In dieser Arbeit wurden Mikrovesikel, die von Tumor-Zelllinien in hohen Konzentrationen sekretiert wurden, zur Immunisierung von Ratten verwendet, um auf diese Weise monoklonale Anti-körper gegen membranständige Proteine zu generieren, die auf Tumorzellen vorhanden sind. Der Grund für diesen Ansatz ist, dass Mikrovesikel verschiedenste Membranproteine enthalten, die in Tumorzellen in hohem Maße exprimiert werden. Diese Mikrovesikel sind etwa hundertfach kleiner als die Zellen, denen sie entstammen und daher deutlich weniger komplex. Gleich-zeitig enthalten sie aber überproportional viele Membran-proteine. Viele, aber nicht alle dieser Proteine sind in der Onko-logie und Tumorimmunologie bereits als Tumor-assoziierte Antigene bekannt, weshalb diese Mikrovesikel hier als Onko-somen bezeichnet werden. Es hat sich herausgestellt, dass sich Onkosomen hervorragend zur Immunisierung verwenden lassen und durch ihre Immunogenität die Möglichkeit bieten, mono-klonale Antikörper gegen zunächst unbekannte, aber onko-logisch relevante Membranproteine zu generieren. Aus solchen Immunisierungen war in der Arbeitsgruppe der Antikörper 6A10 hervorgegangen, der mit hoher Spezifität und Effizienz die Tumor-assoziierte Carboanhydrase XII (CA XII) er-kennt und inhibiert. CA XII ist ein membranständiges Enzym, das auf einer Vielzahl hypoxischer Tumoren exprimiert ist und für die Homöostase des leicht alkalischen intrazellulären pH-Wertes vieler Tumorzellen entscheidend ist. Mit dem inhibitorischen Antikörper 6A10 konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass eine spezifische Hemmung der CA XII-Enzymaktivität zu einem ver-zögerten Wachstum dreidimensionaler Tumorzellverbände in vitro und in vivo führt. Bei den in-vivo-Versuchen konnte ich dabei das Wachstum von Luziferase-exprimierenden Tumoren in immundefekten NSG-Mäusen durch Biolumineszenz-basierte Bildgebung (BLI) über lange Zeiträume exakt verfolgen und quantifizieren. Mittels Fluoreszenz-basierter Bildgebung konnte ich zudem die spezifische Bindung eines 6A10-Infrarotfarbstoff-Konjugates an Tumorzellen in vivo visualisieren. Da es zuvor keinen spezifischen Inhibitor gegen die CA XII gab, waren dies die ersten Untersuchungen, die speziell die CA XII als Ziel-struktur behandelten und für die klinische Onkologie als relevantes Tumor-assoziiertes Antigen validieren konnten. In einem zweiten Teil meiner Arbeit ermittelte ich die Spezifität weiterer Tumor-reaktiver Antikörper, die aus Immunisierungen mit Onkosomen hervorgegangen sind. Diese Antikörper erkann-ten nativ gefaltete Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen und könnten zur Beantwortung verschiedener onkologischer Fragestellungen Verwendung finden. Neben dieser unspezi-fischen „reversen“ Immunisierungsmethode, verwendete ich Onkosomen erfolgreich auch zur gezielten Generierung von Antikörpern gegen ein definiertes membranständiges Protein, die humane Carboanhydrase IX. Die CA IX ist ein weiteres be-kanntes membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das oft mit der Carboanhydrase XII auf invasiven soliden Tumoren ko-exprimiert ist. Damit konnte ich belegen, dass sich Mikrovesikel nicht nur für die Generierung neuartiger Tumor-reaktiver Anti-körper, sondern auch für die Entwicklung von Antikörpern gegen ein Molekül der Wahl eignen. Die Immunisierung mit nativ ge-falteten Proteinen im Kontext immunogener Mikrovesikel könnte sich zukünftig als Möglichkeit zur Generierung von Antikörpern erweisen, die mit klassischen Immunisierungsmethode nicht oder nur schwer zu erhalten sind. / Tumours and established tumour cell lines constitutively secrete high amounts of microvesicles (MVs) less than 200 nm in dia-meter. These vesicles display various proteins in their mem-branes, which are frequently found to be strongly upregulated in the cells of origin. MVs used in this work are roughly a hundred times smaller than cells and less complex because they contain predominantly membrane-bound proteins, many of them being well known to oncologists and tumour immunologists as tumour-associated antigens. Therefore, these particles are hereinafter referred to as oncosomes. Previous work of our group has identified oncosomes derived from different tumour cell lines as excellent tools for immunizations aiming at the generation of monoclonal antibodies against initially unknown, but oncologically relevant proteins. A monoclonal antibody (6A10) that specifically inhibits CA XII activity was recently generated in my group with the help of such microvesicles. In this work, using the 6A10 antibody, I was able to demonstrate that blocking CA XII-enzyme activity interferes with the growth of three-dimensional tumour cell clusters both in vitro and in vivo. In severely immunocompromised NSG mice, the growth rates of luciferase-expressing tumor xenografts were monitored and precisely quantified by whole-body bioluminescence-based imaging (BLI) over the entire duration of the experiment. Additionally, specific binding of 6A10 con-jugated to an infrared dye to tumour cells in vivo was visualized by means of fluorescence-based imaging. Because no specific inhibitor oft CA XII was available so far, this work represents the first study on CA XII as a target for an immunotherapeutic intervention, proving the enzyme as a relevant tumour-associated antigen for clinical oncology. As a second project, I made use of the unique composition and high immunogenicity of oncosomes in that I utilized them as tools for the generation of new tumour-reactive monoclonal antibodies, which I subsequently characterized and determined the specificities of some of them using immunoprecipitations and mass spectrometry. Interestingly, the majority of antibodies obtained from immunizations recognized natively folded protein antigens, which were found to be strongly expressed on the surface of a variety of tumour cell lines and thus may find use in diagnostic or even therapeutic approaches. Besides their application in this rather random immunization strategy, I successfully used recombinant oncosomes for the targeted generation of antibodies against a particular protein (membrane-associated carbonic anhydrase IX). Here, CA IX was chosen as a membrane-tethered tumour-associated antigen, which is often co-expressed alongside with carbonic anhydrase XII on various invasive solid cancers types. CA IX is another membrane-bound enzyme expressed on a variety of hypoxic tumours and critical to the homeostasis of the slightly alkaline intracellular pH of many tumour cells. This approach proves that microvesicles not only are suitable for the identification of novel tumour-reactive antigens and generation of antibodies, but also for selective production of antibodies specific to a molecule of choice. Thus, microvesicles engineered to carry a specific protein as natively folded immunogen can be used to generate anti-bodies with particular features, i.e. recognition of proteins in their native tertiary struc-ture – a prerequisite for functional antibodies.

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Morbus Alzheimer ist die häufigste Form einer Demenzerkrankung und stellt aufgrund der steigenden Lebenserwartung eine sehr große ökonomische und emotionale Belastung für Patienten, deren Familien und die gesamte Gesellschaft dar. Eine Verringerung dieser Belastung erfordert dringend krankheitsmodifizierende Therapien, die bisher nicht zur Verfügung stehen. Als wahrscheinlichste Erklärung für die molekularen Ursachen der Krankheit wurde in der Amyloid-Kaskaden-Hypothese postuliert, dass die Akkumulation und Aggregation des Abeta-Peptids das zentrale Ereignis darstellt. Infolgedessen kommt es zu synaptischen Beeinträchtigungen durch Abeta-Oligomere, Entzündungsreaktionen durch unlösliche Abeta-Aggregate in Form von amyloiden Plaques, progressiven Schädigungen von Synapsen und Neuronen, oxidativem Stress, der Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau und einem Neuronenverlust. Das Abeta-Peptid wird durch sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die beta- und gamma-Sekretase konstitutiv im Gehirn produziert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der Überexpression eines humanen APP mit der schwedischen Mutation auf Synapsen und die Akkumulationskinetik des Abeta-Peptids zu amyloiden Plaques in einem Alzheimer-Mausmodell (Tg2576) untersucht. Die detaillierte Charakterisierung des Mausmodells wurde in einer Therapiestudie umgesetzt, in der eine passive Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere getestet wurde. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Überexpression des APP auf dendritische Spines untersucht, die das postsynaptische Kompartiment glutamaterger Synapsen entlang von Dendriten bilden. Als Reporter-Tiere wurden Mäuse verwendet, die das gelbfluoreszierende Protein YFP in einem Teil der pyramidalen Neuronen des Cortex exprimieren. Mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie wurden die denritischen Spines an den apikalen Dendriten der Schicht II/III und V Neurone im somatosensorischen Cortex analysiert. Die Überexpression des APP führte zu einem differentiellen Effekt, wobei in Schicht II/III Neuronen keine Änderung und in Schicht V Neuronen eine Erhöhung der Dichte dendritischer Spines gemessen wurde. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte eine Mehrzahl an stabilen Spines als ursächlich für die erhöhte Spinedichte, während keine zeitliche Änderung der Spinedichte über sechs Wochen detektiert wurde. Auch die Morphologie der dendritischen Spines war unverändert. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche physiologische Rolle von APP und/oder dessen proteolytische Fragmente an Synapsen. Ein wichtiges neuropathologisches Merkmal von Morbus Alzheimer sind amyloide Plaques, die durch Aggregation des Abeta-Peptids zu Amyloidfibrillen mit einer gekreuzten beta-Faltblattstruktur entstehen. Demzufolge wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie, unter der wiederholten Anwendung des spezifischen fluoreszenten Markers Methoxy-X04, die Entstehungs- und Aggregationskinetik amyloider Plaques untersucht. Eine quantitative Auswertung von Plaquegrößen, -wachstumsraten und -dichten in zwei Altersgruppen der frühen und späten amyloiden Pathologie führte zur bisher detailliertesten in vivo Charakterisierung in einem Alzheimer-Mausmodell. Für eine präzise Messung der Plaquedichten wurde ein sehr großes Gehirnvolumen von 3 Kubikmillimeter pro Gruppe untersucht. In einem Langzeitversuch über 15,5 Monate mit einer zeitlichen Auflösung von einer Woche wurde erstmals eine komplette Kinetik des Plaquewachstums in einem Mausmodell beschrieben, die den gleichen Verlauf einer Sigmoid-Funktion aufwies, wie er bereits in vitro und in Alzheimer-Patienten gezeigt wurde. Die Plaquedichte stieg asymptotisch mit dem Alter an und folgte einer exponentiellen, einphasigen Assoziationsfunktion. Neu entstandene Plaques wiesen mit Abstand die kleinste Plaquegröße auf, die mit zunehmendem Alter anstieg. Die lineare Plaquewachstumsrate, gemessen als Zuwachs des Plaqueradius pro Woche, sank mit ansteigendem Alter der Mäuse, was sich in einer negativen Korrelation der Plaquewachstumsrate mit der Plaquedichte widerspiegelte. Sehr große Plaques wurden früh in der Entstehungsphase gebildet und die Größe am Ende der Untersuchung korrelierte mit ihrer Wachstumsrate. In der frühen Phase der Plaqueentwicklung nahmen die Plaques mit einer maximalen Wachstumsrate zu, die nicht durch die Abeta-Konzentration limitiert war. Die Wachstumsraten individueller Plaques waren sehr breit verteilt, was auf einen Einfluss lokaler Faktoren schließen ließ. Dieser Befund wurde gestützt durch den Langzeitversuch, da kein Zusammenhang zwischen den Wachstumsraten benachbarter Plaques detektiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen ein physiologisches Wachstumsmodell, in dem Plaques sehr langsam über große Zeiträume wachsen bis zum Erreichen eines Äquilibriums. Durch die nachgewiesenen Parallelen zu den Befunden von in vitro Studien und in vivo Ergebnissen von Alzheimer-Patienten stellen die beschriebenen Zusammenhänge eine wertvolle Grundlage für die Translation von Ergebnissen zwischen präklinischer und klinischer Forschung zur Entwicklung von Abeta-senkenden Therapien dar. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Effekte einer passiven Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere untersucht. Nach einer zweimonatigen Antikörper-Behandlung wurden keine Unterschiede in der Plaqueentstehungs- und Plaquewachstumskinetik gemessen. Eine in der Literatur beschriebene Akkumulation von Abeta-Oligomeren konnte durch eine in vivo Visualisierung mit einem hochspezifischen Antikörper gegen diese Molekülspezies nicht bestätigt werden. Lösliche Abeta-Peptide oder Abeta-Aggregate akkumulierten erwartungsgemäß um den amyloiden Kern von Plaques. Am Ende der Immunisierungsstudie wurde die synaptische Pathologie mittels immunhistochemischer Färbung der Prä- und Postsynapsen mit den Markern Synapsin und PSD-95 untersucht. Innerhalb amyloider Plaques wurden sehr niedrige Synapsendichten gemessen, die mit zunehmender Entfernung zum Plaque asymptotisch zu einem Plateau anstiegen. Diese Analyse zeigte erstmals, dass der Einflussbereich der toxischen Wirkung amyloider Plaques für Präsynapsen wesentlich größer ist als für Postsynapsen, was auf eine höhere Sensibilität von Präsynapsen schließen lässt. Abseits von Plaques im Cortex waren die Synapsendichten niedriger im Vergleich zu Wildtyptieren, wie durch den Vergleich der Plateaus gemessen wurde. Beide therapeutischen Antikörper zeigten eine partielle Normalisierung der Synapsendichte. Daraus folgt, dass die Abeta-Oligomere ursächlich für die Synapsenpathologie waren, da eine spezifische Neutralisierung dieser Abeta-Aggregate für einen Therapieeffekt ausreichte. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo die toxische Wirkung von Abeta-Oligomeren auf Synapsen und beweisen eine mögliche Neutralisierung dieser löslichen Abeta-Aggregate durch eine passive Immunisierung. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia implying big economical and emotional burden for patients, their families and the whole economy due to a generally rising life expectancy. A reduction of costs and stress urgently requires disease-modifying therapies which are currently still lacking. Maybe the most accurate explanation for the molecular cause of the disease is reflected in the amyloid-cascade hypothesis, postulating the accumulation and aggregation of the Abeta peptide as central pathogenic event. Hence, synaptic pathology caused by Abeta oligomers, inflammatory reactions due to insoluble Abeta aggregates, namely amyloid plaques, progressive damage of synapses and neurons, oxidative stress, hyperphosphorylisation of the microtubule-associated protein tau, and finally neuron loss commonly occur as a result. Moreover, the Abeta peptide is constitutively produced in the brain by sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by beta- and gamma-secretase enzymes. In the present work, I studied the effects of human APP overexpression (with a Swedish mutation) on both synapses and the accumulation kinetics of amyloid plaque formation in a mouse model of Alzheimer’s disease (Tg2576). This detailed characterization of the mouse model was then further utilized in a therapeutic study testing the passive immunization against the Abeta-peptide or Abeta oligomers. In the first part of this work, I investigated the effects of APP overexpression on dendritic spines forming the postsynaptic compartment of glutamatergic synapses on dendrites. As reporter animals, mice expressing the yellow-fluorescent protein YFP in a subset of cortical pyramidal neurons were used. Two-photon microscopy enabled the elaborate in vivo analysis of dendritic spines on apical dendrites of layer II/III and V neurons in the somatosensory cortex. Overexpression of APP induced a locally differential effect on the spine density with no changes being observed in layer II/III yet increased spine numbers calculated in layer V neurons. A more detailed characterization revealed a majority of stable spines as responsible for the rise in spine densities; however, no further changes in the spine count were detected over a period of six weeks. Moreover, dendritic spine morphology was also unaltered. Summarized, these results hint to a possible physiological role of APP and/or its proteolytic fragments at the synapse. Amyloid plaques, one of the two characteristic neuropathological hallmarks of AD, are generated by aggregation of the Abeta peptide into amyloid fibrils with a crossed beta-sheet structure. Thus, in the second part of this work, the formation and aggregation kinetics of amyloid plaques were measured by means of in vivo two-photon microscopy and repeated use of the fluorescent marker methoxy-X04. Such extensive quantitative analysis of plaque sizes, plaque growth rates and plaque densities as performed for two different age groups, depicting models for early and late stage AD pathology, allowed the most detailed in vivo characterization so far. For a precise measurement of plaque densities, in each group I analysed large brain volumes of 3 cubic millimeters. Interestingly, the complete range of plaque growth kinetics as imaged in a weekly interval for over 15,5 month showed the same trend like that of a sigmoid function, a finding that accords with in vitro studies and AD patients. Moreover, the plaque densities increased asymptotically with higher age and followed an exponential, one-phase association function. Newly-formed plaques showed by far the smallest plaque size, which also continued to rise upon ageing. In contrast, the linear plaque growth rate, measured as weekly increase in the plaque radius, decreased with increasing age of the animal. This finding was also reflected in a negative correlation between plaque growth rate and plaque density. In addition, huge plaques were produced early in the developmental phase, and the final size they reached at the end of the experiment correlated with the plaque growth rate. In the early phase of plaque formation, the plaques expanded with a maximal growth rate that was not limited by the Abeta concentration. Furthermore, the growth rates of individual plaques were widely distributed assuming the influence of local factors. This finding was supported by the long-term study over 15,5 months showing no correlation between the growth rates of neighbouring plaques. Conclusively, the results of this investigation demonstrate a growth model, in which plaques grow very slowly over longer periods until they reach equilibrium. Thus, both the described relationships and verified parallels to in vitro studies and findings in AD patients shape an important basis for the translation of results between preclinical and clinical research and for the final development of Abeta-lowering therapies. In the third part of this thesis, I analysed the effects of a passive immunization against Abeta peptides or Abeta oligomers. A two-month long antibody treatment did neither affect the plaque formation nor its growth kinetics. Moreover, Abeta oligomer assemblies as described previously in literature were not detected using in vivo visualization with a highly specific antibody against these molecular species. Instead, soluble Abeta peptides or Abeta aggregates accumulated around the plaque core as expected. At the end of the immunization study, the synaptic pathology was analysed by immunohistochemical stainings of pre- and postsynapses using the markers synapsin and PSD-95. Here, very low synapse densities were measured inside amyloid plaques, which increased asymptotically until culmination of a plateau. This analysis showed for the first time that the influenced area of toxic effects of amyloid plaques is higher for presynapses than for postsynapses, suggesting a higher sensitivity of presynapses. Apart from plaques, the synapse densities were lower in AD mice compared to wild-type animals as identified by comparison of the estimated plateaus. Both therapeutic antibodies showed a partial normalization of the synapse density. Thus, Abeta oligomers were likely causative for the synapse pathology since the specific neutralization of Abeta aggregates sufficiently achieved a therapeutic effect. In summary, these findings verify the toxic effect of Abeta oligomers on synapses in vivo and support a possible neutralization of soluble Abeta aggregates by passive immunization.

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