Multiple hormones and growth factors regulate mammary epithelial and breast cancer cell growth and differentiation. While prolactin (PRL) is a differentiation hormone, epidermal growth factor (EGF) is an important mitogen. Here we examined the PRL and EGF crosstalk mechanism in mammary epithelial cells. Our results indicate that PRL and EGF exhibit antagonistic properties that impacts mammary epithelial cell proliferation and differentiation. While EGF blocked PRL-induced cellular differentiation, PRL suppressed EGF-induced cell growth. EGF was shown to block PRL-induced cellular differentiation without inhibiting PRL proximal signaling cascade such as Jak2 and Stat5a tyrosine phosphorylation. We identified Grb2 as a novel substrate of the PRLR/Jak2 complex. Moreover, the tyrosine phosphorylation of Grb2 was shown to be an essential mechanism utilized by PRL to inhibit EGF signals to MAPK activation and cell growth. Together these results define a novel signaling mechanism underlying PRL and EGF crosstalk in mammary epithelial and breast cancer cell growth and differentiation. / La PRoLactine (PRL) et Epidermal Growth Factor (EGF) sont des facteurs importants pour la croissance cellulaire, la différenciation et la carcinogenèse mammaire. Tandis qu'EGF est un mitogène puissant, PRL est critique pour l'induction de la différenciation de cellules épithéliales mammaires. Tandis qu'EGF bloque la différenciation cellulaire causée par PRL, PRL supresse la croissance cellulaire dûe à EGF. D'un côté, on a montré qu'EGF bloque la différenciation cellulaire sans inhiber la signalisation proximale de PRL. De l'autre, le traitement avec PRL inhibe l'activation de MAP Kinases par EGF et la prolifération cellulaire. De plus, le traitement avec PRL entraîne une augmentation significative de la phosphorylation en ou sur les tyrosines de Grb2. Pour confirmer ces résultats, nous avons utilisé Grb2YF, une forme de Grb2 sans sites de phosphorylations de tyrosines. En présence de PRL et Grb2YF, nous avons observé un rétablissement de l'activation de Ras et des MAP Kinases. Nos données suggèrent que la PRL réduit l'activation des MAP Kinases et la prolifération cellulaire induite par EGF grâce à la phosphorylation des sites tyrosines de Grb2 empêchant ainsi l'interaction avec Sos. Ensemble ces résultants définissent un nouveau mécanisme de signalisation qui met en évidence la communication entre PRL et EGF dans la croissance et différenciation des cellules épithéliales mammaires et cancérigènes.

ABSTRACT We followed the localization of GFP-tagged myosin I (Myo5), septin (Cdc12) and rhodamin-stained actin during bud and shmoo formation in opaque-phase cells of Candida albicans, and monitored the mating-associated processes of cell fusion, zygote budding, septum formation, daughter cell development and the dynamics of nuclear migration and division. The localization of Myo5p, Cdc12p and actin during budding in opaque and white cells is similar. In pheromone-stimulated cells, these proteins localize in shmoos in patterns consistent with hyphal formation in white-phase cells. MTLa cells generate shmoos 5-7 hours earlier than MTLα cells in mixed populations. In the daughter cell generated after mating, Cdc12p, Myo5p and actin localize as they do under vegetative budding conditions. Intriguingly, isogenicity for the mating type locus is involved in the positioning of the nuclear division; in MTLa cells the nucleus divides within the mother cell up to 70% of the time, rather than across the mother-bud neck. / RÉSUMÉ Nous avons déterminé la localisation de l'actine ainsi que de la myosine I (Myo5) et de la septine (Cdc12) modifiées avec la protéine fluorescente verte (GFP) chez Candida albicans en phase opaque (reproductive) et blanche (végétative). Plus particulièrement, nous avons porté notre attention sur les processus associé à la reproduction tel le bourgeonnement et l'expansion cellulaire (shmoo), la conjugaison et la fusion cellulaire, le bourgeonnement et le développement des zygotes (cellules -filles issues de la conjugaison). Nous avons aussi observé la configuration subcellulaire de Myo5p, Cdc12p et de l’actine lors de la migration et de la division nucléaire en phase blanche. Que ce soit en phase opaque ou en phase blanche, la localisation de Myo5p, Cdc12p et de l'actine reste similaire lors du bourgeonnement. Lors d’une stimulation à la phéromone, en phase opaque, ces trois protéines ont le même patron d’organisation cellulaire que lors de la formation d'hyphes en phase blanche. Les cellules de type MTLa produisent des shmoo entre 5 et 7 heures plus tôt que les cellules de type MTLα dans une population mixte. Dans les zygotes, Cdc12p, Myo5p et l'actine ont la même localisation que celle observée dans les cellule-filles issues du bourgeonnement en mode végétatif. Étonnamment, l'isogénicité du locus génétique déterminant le type sexuel de la cellule influence la position du noyau lors de la division; Ainsi, dans 70% des cas, le noyau des cellules de type MTLa se divise à l'intérieur de la cellule-mère plutôt qu'au travers du col entre la cellule-mère et le bourgeon.

Alendronate (ALN) is effective in the treatment of osteoporosis. However, ALN has been recently associated with an increased risk of serious atrial fibrillation. We investigated the effects of ALN on cytosolic free calcium concentration ([Ca2+]i) in cardiomyocytes. HL-1 atrial cardiomyocytes were loaded with fura-2 and examined using microspectrofluorimetry. ALN (10-8, 10-7, 10-6 M) induced transitory high frequency oscillations of [Ca2+]i with greater frequency for 10-8 M ALN (61 ± 10 mHz) compared to 10-6 ALN (42 ± 4 mHz). In cells treated with 10-6 M ALN responses to subsequent application of caffeine were delayed, and exhibited a decrease in the rate and amplitude of [Ca2+]i increase. Long term (48 h) exposure to 10-8 M Alendronate resulted in delay of caffeine-induced Ca2+ transients and decreased rate of [Ca2+]i increase, followed by oscillations in [Ca2+]i of 54 ± 8 mHz versus those observed at higher concentrations of Alendronate (35 ± 5 mHz). Changes in calcium dynamics were accompanied by significant changes in the expression of sarcoendoplasmic reticulum ATPase (SERCA2a), calsequestrin and calreticulin. / Alendronate est efficace dans le traitement de l’ostéoporose. Alendronate a récemment été associe avec une risque élevé de fibrillation auriculaire sérieux. On a examine les effets d’Alendronate sur la de calcium cytosolique ([Ca2+]i) dans les cellules musculaires cardiaques. Les cellules musculaires cardiaques HL-1 étaient chargés avec Fura-2 et examinés par microspectrofluorimetrie. Alendronate (10-8, 10-7, 10-6 M) ont provoqués des oscillations de [Ca2+]i fugaces et haute fréquences à 10-8 M Alendronate (61 ± 10 mHz) comparé aux concentrations plus hautes (42 ± 4 mHz). Dans les cellules traits avec 10-6 M ALN, la réponse à l’application de caféine était avec délai, et a manifesté un diminution dans la rythme et amplitude d’augmentation de [Ca2+]i. L’exposition a l’ALN à long terme (48 h) ont provoqué un délai des élévations de calcium transitoires, et un diminution du rythme d’augmentation de [Ca2+]i suites par les oscillations de [Ca2+]i, caractérisés par un augmentation de fréquences avec 10-8 M Alendronate (54 ± 8 mHz) compare aux concentrations plus hautes (35 ± 5 mHz). Le changement des dynamiques de calcium étaient accompagnés par les changements considérables dans l’expression d’ATPase (SERCA2a), calsequestrin et calreticulin du réticulum sarcoendoplasmique.

The eukaryotic cell is organized into several membranous subcellular compartments that contribute to the spatial segregation of the many cell physiological functions. One of these organelles, the endoplasmic reticulum (ER), is a continuous compartment, emanating from the nuclear envelope, through the rough ER, and ending with the reticulated smooth ER network. Each domain of the organelle is distinct for its morphology, as well as the many diverse functions that it performs. In this thesis, a survey of a proteomics resource for both the rough and smooth domains of the ER reveals that the organelle is further divided into spatial and functional subdomains. Furthermore, the assignment of novel proteins that were uncovered by proteomics to these various functional clusters can provide insight into their functions and guide future functional studies. Lastly, this thesis demonstrates the importance of the distinct morphology of the smooth ER network in maintaining basic physiological processes. Taken together, these data demonstrate that while the ER is a single, continuous, subcellular compartment, it is highly complex in its spatial, functional, and morphological organization. / La cellule eucaryote est constituée de plusieurs structures spécialisées dénommées organites qui contribuent à la démarcation des fonctions physiologiques de la cellule. L'un de ces organites, le réticulum endoplasmique (RE), est une structure continue qui provient de l'enveloppe nucléaire, devient le RE rugueux, et se termine avec le réseau réticulé RE lisse. Chaque division de l'organite est unique pour sa morphologie, ainsi que ses fonctions nombreuses et diverses. Dans cette thèse, une analyse d'une ressource protéomique révèle que les deux domaines du RE sont encore divisés en de nouvelles sections régionales et fonctionnelles. De plus, l'attribution de nouvelles protéines découvertes par la protéomique à ces divisions fonctionnelles peut donner un aperçu de leurs fonctions et guider de nouvelles études. Enfin, cette thèse démontre l'importance de la morphologie distincte du réseau RE lisse pour le maintient de certains processus physiologiques de base. Le tout démontre que même si le RE est en effet un compartiment continu, son organisation régionale, fonctionnelle et morphologique est très complexe.

Basal-like triple negative breast cancers (TNBCs) display poor prognostic features with larger tumor size, higher tumor grade, and an increased risk for lymph node and distant metastasis as well as tumor recurrence. Transforming growth factor beta (TGFβ) is a key regulator of the cellular processes by which breast cancer cells from the primary tumor metastasize to distant organs. However, the molecular mechanisms underlying TGFβ's pro-metastatic effects remain to be fully elucidated. Here, we investigated the role of TGFβ signaling pathway in regulating cell migration, invasion and cancer stem cell self-renewal capacity, which are the initial and critical steps in breast cancer metastasis. Our studies initially identified a novel function for the cell cycle regulator p21 and its binding partner acetyltransferase p/CAF as critical transcriptional regulators of TGFβ-induced TNBC cell migration and invasion in vitro as well as tumor invasiveness in vivo. As p21 can interact with different cyclin and CDK complexes, we investigated whether other cell cycle regulators are also involved in TGFβ-induced tumor progression. We found that TGFβ promotes physical interaction and nuclear co-localization between cyclin D1 and p21. The co-expression of cyclin D1 and p21 proteins promote tumor growth and locally invasive tumors. In addition, we found that TGFβ can activate cyclin D1/CDK4 complex to promote cancer stem cell activity and self-renewal capacity in TNBC. Together, we have defined p21, cyclin D1 and CDK4 as key downstream regulators of TGFβ tumor-promoting functions. / Le cancer du sein triple-négatif (CSTN) de type basal démontre des signes cliniques caractéristiques d'un mauvais pronostique, tels qu'une taille et un grade plus élevés des tumeurs, un risque augmenté de développer des métastases lymphatiques et distantes, ainsi qu'un plus grand risque de récurrence de la maladie. Le TGFβ est un régulateur clé des procédés cellulaires par lesquels les cellules cancéreuses du cancer du sein se détachent de la tumeur primaire pour former des métastases aux organes distants. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels le TGFβ accomplit son rôle pro-métastatique restent à être élucidés. Ici, nous investiguons le rôle du TGFβ dans la régulation de la migration cellulaire, l'invasion, et la capacité des cellules souches à se renouveler, qui sont les étapes initiales et critiques à la formation de métastases dans le cancer du sein. Notre étude a tout d'abord identifié une nouvelle fonction pour le régulateur de cycle cellulaire p21 et son partenaire associé, l'acetyltransférase pCAF, comme étant des régulateurs de transcription dont la présence est critique pour la migration et l'invasion cellulaire in vitro et l'invasion tumorale in vivo médiées par le TGFβ pour le CSNT. Le p21 pouvant interagir avec différents complexes de cycline et CDK, nous avons investigué si d'autres régulateurs du cycle cellulaire sont aussi impliqués dans la progression tumorale médiée par le TGFβ. Nous avons trouvé que le TGFβ promeut l'interaction physique et la co-localisation nucléaire entre la cycline D21 et p21. La co-expression de la cycline D1 et de p21 promeut la croissance tumorale et l'invasion locale des tumeurs. De plus, nous avons trouvé que le TGFβ peut activer le complexe cycline D1/CDK4 pour promouvoir l'activité des cellules souches cancéreuses, ainsi que leur capacité de renouvèlement dans le CSNT. Ces résultats nous ont permis de définir p21, la cycline D1, et CDK4, comme des régulateurs clés en aval du TGFβ dans ses fonctions pro-métastatiques

The formation and maintenance of boundaries between embryonic regions are crucial to preserve the organization of the embryo during development. One important parameter that needs to be regulated at the interface between cells of two different tissues is cell-cell adhesion. In the present study, we attempted to understand and characterize the dynamics of cadherin-mediated cell-cell adhesion at the ectoderm-mesoderm boundary of the Xenopus gastrula. At this boundary, it has been recently shown that cells undergo cycles of attachments and detachments as the result of ephrin/Eph signaling (Rohani, Canty, Luu, Fagotto, & Winklbauer, 2011). Using three-dimensional live confocal microscopy, we found that the total levels of cadherin at the membrane do not change reproducibly during local repulsive events between ectodermal and mesodermal cells. Cadherin clusters, however, appear during contact establishment and often begin to fade away prior to the start of cell detachments. While the role of acto-myosin contraction in this process is still not fully elucidated, we found that cortical actin was upregulated during cell detachments, and that phospho-myosin was enriched at the endogenous ectoderm-mesoderm boundary. Furthermore, our data suggest that there may be two pools of activated myosin, and that the one that is most prominent at the boundary is the one involved in global cortical tension. / La formation et le maintien de frontières entre les différentes régions embryonnaires jouent un role primordial pour préserver l'organisation de l'embryon au cours du développement. L'adhérence intercellulaire est l'un des paramètres qui doivent être régulés aux interfaces entre les cellules de différents tissus. Dans la présente étude, nous avons tenté de comprendre et de caractériser la dynamique des cadhérines à la frontière entre l'ectoderme et le mésoderme dans la gastrula de Xénope. A cette frontière, il a été démontré que les cellules effectuent des cycles d'attachements puis de détachements, dictés par la voie de signalisation éphrine/Eph (Rohani et al., 2011). Par le biais de microscopie confocale tridimensionnelle, nous avons constaté que la quantité de cadhérines à la membrane ne variait pas au cours des instances de répulsions locales entre les cellules de l'ectoderme et du mésoderme. Les "clusters" de cadhérines, en revanche, apparaissent dès l'initiation du contact intercellulaire et semblent diminuer d'intensité progressivement, avant que les cellules ne se détachent complètement. Bien que le rôle de la contraction d'actine-myosine ne soit pas encore totalement élucidé, nous montrons que l'actine corticale augmente pendant et après les détachements cellulaires, et que la phospho-myosine est régulée à la hausse à la frontière ectoderme-mésoderme endogène. De plus, nos données suggèrent qu'il pourrait y avoir deux "pools" de myosine, et que celle qui se démarque à la frontière est celle qui est responsable de la tension corticale globale des cellules.

Arterial restenosis, which occurs in up to 20% of angioplasty patients, is characterized by an excessive vascular smooth muscle cell proliferation resulting from the removal of the endothelial cell lining. Circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have the ability to re-colonize and repair the damaged vascular endothelium, reducing restenosis. Nitric oxide (NO) contributes to mobilization and functional activity of EPCs, and estrogen has been shown to increase circulating EPC levels and accelerate the reendothelialization process by EPCs in mice. Moreover NO is important for transducing estrogen-dependent signalling and reendothelialization. We hypothesized that overexpressing endothelial nitric oxide synthase (eNOS), alone or in combination with estrogen treatment, would potentiate the beneficial effects of EPCs in the context of restenosis.We found that native human early outgrowth EPCs (hEPCs) did not have any effect on human coronary artery smooth muscle cell (hCASMC) proliferation and migration In vitro, evaluated by BrdU incorporation and wound scratch assay respectively. In contrast, the NO donor SNAP significantly decreased the proliferation and migration of hCASMCs. Thereafter, hEPCs were either transfected with a human eNOS plasmid or stimulated with 17β-estradiol (E2) prior to being co-cultured with hCASMCs. Total eNOS protein and eNOS phosphorylation levels were increased by 3- to 3.5-fold in eNOS-transfected or E2-stimulated hEPCs, evaluated by western blot. This was associated with a 3-fold increase in NO production, performed by DAF-FM diacetate immunofluorescence (p<0.05). In eNOS-overexpressing hEPCs, enhanced Bcl-2/Bax ratio and reduced Annexin V/propidium iodide labeling indicated increased survival. Interestingly, we observed a significant (p<0.05) decrease in hCASMC migration when co-cultured with eNOS-overexpressing hEPCs, by 23%, or with E2-stimulated hEPCs, by 56%. However, hCASMC proliferation was not affected by either eNOS-overexpressing or E2-stimulated hEPCs. These results suggest that overexpressing eNOS in hEPCs increases their survival and enhances their capacity to modulate hCASMC migration through paracrine effects. / La resténose artérielle, qui se produit dans presque 20% des patients ayant subi une angioplastie, est caractérisée par une prolifération excessive des cellules musculaires lisses vasculaires résultant de la disparition du revêtement des cellules endothéliales. Les progéniteurs endothéliaux circulants (EPC) ont la capacité de recoloniser et réparer l'endothélium vasculaire endommagé, ce qui réduit la resténose. L'oxyde nitrique (NO) contribue à la mobilisation et l'activité fonctionnelle des EPCs, et l'oestrogène a été montré pour augmenter le taux circulant des EPCs et d'accélérer le processus de réendothélialisation par les EPCs chez la souris. En outre, le NO est important pour la transduction de la signalisation oestrogène-dépendante et la réendothélialisation. Nous avons proposé que la surexpression d'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS), seule ou en combinaison avec un traitement à l'oestrogène, potentialiserait les effets bénéfiques des EPCs dans le cadre de la resténose.Nous avons constaté que les EPC humains natifs (hEPCs) n'ont pas d'effet sur la prolifération et la migration in vitro des cellules musculaires lisses de l'artère coronaire humaine (hCASMC), évaluées par l'incorporation de BrdU et le l'essai « wound-scratch » respectivement. En revanche, le donneur de NO SNAP a diminué de façon significative la prolifération et la migration des hCASMCs. Par la suite, des hEPCs ont été soit transfectés avec un plasmide eNOS humain ou stimulés par du 17β-estradiol (E2) avant d'être co-cultivés avec des hCASMCs. Les niveaux d'eNOS totale et phosphorylée évalués par western blot ont été augmentés de 3 - à 3,5 fois dans les hEPCs transfectés avec eNOS ou stimulés avec E2. Cela a été associé à une augmentation de 3 fois de la production de NO, mesuré par immunofluorescence avec DAF-FM diacétate (p <0,05). Des hEPCs surexprimant eNOS ont montré une augmentation du rapport Bcl-2/Bax et le marquage d'annexine V/iodure de propidium a été réduit indiquant une augmentation de la survie. Fait intéressant, nous avons observé une diminution significative (p <0,05) de la migration des hCASMC de 23% pendant la co-culture avec des hEPCs surexprimant eNOS, et de 56% avec des hEPCs stimulés avec E2. Cependant, la prolifération des hCASMC n'a été affectée ni par des hEPCs surexprimant eNOS, ni par les hEPCs stimulés avec E2. Ces résultats suggèrent que la surexpression de eNOS dans des EPCs humains augmente leur survie et améliore leur capacité à moduler la migration des hCASMC via des effets paracrines.

The HIV-1 protein Nef plays an important role in HIV-1 pathogenesis, both in humans and mouse models. Indeed, transgenic (Tg) mice expressing Nef under the control of the human CD4 promoter develop many phenotypes that closely resemble those of AIDS patients. Using these Tg mice, we have studied the effects of Nef on lymph node stroma, namely on fibroblastic reticular cells (FRCs), and blood and lymphatic endothelial cells (BECs and LECs, respectively). In human patients, a severe and irreversible loss of LN structure and function is observed, and this is correlated with the depletion of FRCs. We show that, in our model, Nef does not significantly change the size of the FRC population, nor does it affect its functions in resting lymph nodes (LNs). We hypothesized that FRCs are supported by lymphoid tissue inducer cells, which prevent their depletion. No fibrosis or loss of structure could be observed in the LNs of Tg mice, contrary to what is seen in human AIDS patients. Nef did, however, cause a localized expansion of BECs and LECs in medullary blood vessels and the subcapsular sinus, respectively, sometimes to the point of completely obstructing these structures. The mechanism driving this expansion is still under investigation. We also studied an unexpected effect of Nef expression on skin keratinocytes. This expression led to the development of an atopic dermatitis-like disease. Atopic dermatitis is one of the most prevalent skin diseases associated with AIDS but, to our knowledge, no HIV-1 protein had previously been directly linked to it. We show here that Nef causes this atopic dermatitis-like disease by inhibiting the Notch1 signalling pathway in keratinocytes. Thus, our data adds to the list of known Nef effects, and provides potential new insights for therapy. / La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse de ce virus, chez les humains et chez des modèles murins. En effet, des souris transgéniques (Tg) exprimant Nef sous le contrôle du promoteur CD4 humain développent des phénotypes très similaires à ceux retrouvés chez les patients atteints du SIDA. Nous avons étudié, chez ce modèle murin, les effets de Nef sur le stroma des ganglions lymphatiques (GL), c'est-à-dire sur les cellules réticulaires fibroblastiques (CRFs) et les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques (respectivement CEVs et CELs). Chez les humains infectés par le VIH-1, une perte sévère et irréversible de la structure et de la fonction des GLs est observée et est corrélée avec la déplétion des CRFs. Nous montrons ici que, dans notre modèle, Nef ne change pas significativement la taille de la population de CRFs et n'affecte pas ses fonctions. Nous proposons que la population de CRFs est maintenue par les cellules inductrices de tissu lymphoïde. Aucune fibrose ou perte de structure n'a été observée dans les GLs des souris Tg, contrairement à ce qui se retrouve chez les patients humains. Par contre, Nef cause une expansion localisée des CEVs et des CELs dans les vaisseaux sanguins médullaires et dans le sinus subcapsulaire, respectivement, parfois au point de complètement obstruer ces structures. Le mécanisme de cette expansion est à l'étude. Nous avons également étudié des effets inattendus de l'expression de Nef dans les kératinocytes de la peau. Cette expression a provoqué le développement d'une maladie similaire à la dermatite atopique. La dermatite atopique est l'une des maladies de peau les plus fréquentes chez les patients atteints du SIDA. Cependant, à notre connaissance, aucune protéine du VIH-1 n'y avait été directement associée à ce jour. Nous montrons ici que Nef cause cette maladie en inhibant la voie de signalisation de Notch1 dans les kératinocytes. Ainsi, nos résultats identifient de nouveaux effets de Nef et fournissent de nouvelles perspectives potentielles pour des thérapies.

The signal transduction pathways that mediate metabolic and mitogenic effects in primary rat hepatocytes were investigated. Transcriptional inhibition by insulin of the metabolic gene insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) was P13-kinase-dependent and sensitive to rapamycin, an Inhibitor of p7Os6k activation at the level of mTOR. In hepatocytes, P13-kinase contributes to p70s6k activation. Our results described the first example of an insulin-specific gene, whose regulation is both P13-kinase- and p70s6k-dependent. MAP kinases were not Involved in regulating this nuclear event. / DNA synthesis by insulin was not effected by to MAP kinase signalling pathway, but was p13-kinase-dependent and sensitive to rapamycin. Thus, p13-kinase and p70s6k determine metabolic and mitogenic signalling by insulin in kw cob. DNA synthesis by EGF was also mediated by the P13-kinase/p70 s6k pathway. Unlike insulin however, EGF augmented cymc mRNA levels and this response was effected by activation of the MAP kinase pathway. Of particular Interest, EGF was without effect on hepatic IGFBP-1 mRNA despite its ability to activate P13-kinase and p70s6k to levels comparable to those observed after insulin treatment. / We demonstrated that the protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitor, bpV(phen), triggers early signaling events identical to insulin by promoting insulin receptor kinase (IRK) autophosphorylation and activation, suggesting that bpV(phen) inhibits an IRK-associated PTP(s). Consistent with these data, bpV(phen) mimicked insulin effects on DNA synthesis and IGFBP-1 mRNA expression. In contrast to insulin however, bpV(phen) decreased IGFBP-4, as well as IGFBP-1 mRNA levels through an additional signaling pathway, unrelated to P13-kinase/p70 s6k, and it activated MAP kinases independently of their upstream activator, MEK. Thus, bpV(phen) may inhibit a PTP(s) involved in MAP kinase inactivation, and MAP kinases may mediate the inhibitory effect of bpV(phen) on IGFBP-1 and/or -4 mRNA expression. Together, these data reveal the complexity of metabolic and genetic regulation: (1) the P13-kinase/p70s6k pathway cannot, in itself, explain metabolism, and (2) multiple signaling pathways may converge to regulate a common gene.

Ion channels constitute a class of proteins that is ultimately responsible for generating and coordinating electrical signals passing through the brain and heart. In order for ion channels to fulfill these roles a number of coordinated events must ensue at the protein level. Newly translated polypeptides entering the endoplasmic reticulum (ER) must be correctly processed and folded in order to exit. In the case of voltage-dependent ion channels, the channel alpha subunits, which form the channel pore, oligomerize with like (or unlike) alpha subunits and/or auxiliary (beta) subunits, depending on the channel type. Further posttranslational modifications take place within the Golgi apparatus before the channels embark for their final destination. Once there, or prior to their arrival, they interact with cytoskeletal elements that serve to anchor the channel in place and tether accessory elements involved in ion channel modulation and signaling. Here, I have investigated the role of N-linked glycosylation in the surface membrane expression of a K+ channel, human ether-a-go-go related gene (HERG), mutation of which can give rise to the cardiac disease long QT. Pharmacological and site-directed mutagenesis reveal that N-linked glycosylation is required for proper channel processing and cell surface expression of HERG as determined through immunoblot, immunocytochemical and electrophysiological analysis. Removal of glycosylation leads to an intracellular retention of HERG. Furthermore, I have examined the subcellular localization of the Na+/H+ exchanger (NHE1 isoform) in cardiomyocytes using immunocytochemical techniques and found that it exhibits a restricted subcellular localization at the intercalated disc. Along the same line, using the yeast two-hybrid screening technique, I have identified an actin-binding protein, filamin, that directly interacts with and plays a role in the subcellular localization of a prominent heart and brain K + channel, Kv4.2.