This thesis examines fruit yield variation and its causes in the lowbush blueberry (Vaccinium angustifolium). I found that yields exhibits significant variability in fruit within and between fields. An experiment involving controlled introductions of the three pollinator species commonly used in blueberry production—the honeybee (Apis mellifera), the bumblebee (Bombus spp.) and leafcutter bee (Megachile rotundata)—was also conducted. Increasing the abundance or diversity of the introduced pollinator community did not systematically increase fruit set across the experimental populations. There is weak evidence to suggest the combination of bumblebee and leafcutter bee may be more effective at increasing fruit yield than honeybee alone. The behaviour of introduced pollinator species differed between fields depending on the combination of pollinator species present, however, none of these changes was correlated with increased fruit set. As part of this work, self-pollinations and cross-pollinations were conducted in a large number of clones and variation in inbreeding depression of yield was detected among clones. To evaluate whether differences in accumulated deleterious mutations among clones were responsible for variation in inbreeding depression, a follow-up experiment manipulating access to self pollen was undertaken. In addition, differential genetic load was measured, using clone size as a proxy for somatic cell division. Neither clonal size nor self pollen access sufficiently explained the interclonal variation in self fruit set. Within the same fields, geitonogamously-pollinated fruit set was greater than autogamously-pollinated fruit set. These differences suggest the presence of somatic mutations, cell lineage selection, mitotic recombination, or epigenetic changes within lowbush blueberry clones, and they mirror results from studies of several perennial plant species that have revealed autogamy depression to be a significant factor in plant fertility. These results suggest that self-fertilization is an important element limiting fruit set that should be addressed in attempts to increase lowbush blueberry yield. / Ce thèse explore la variance du rendement de fruit et les causes des différences dans le rendement vue dans l'espèce de bleuet Vaccinium angustifolium. J'ai trouvé qu'il existe une variabilité dans le rendement de fruit entre les champs et entre les individus du champs. Une expérience visant l'introduction des trois espèces pollinisateur utilisé le plus fréquement (Apis mellifera, Bombus spp., Megachile rotundata) au Nouveau-Brunswick a aussi eu lieu. Lors de l'augmentation de la diversité ou l'abondance il n'y avait aucun gain conséquent dans le rendement de fruit. Il y a un faible temoignage qui suggère que le rendement de fruit est plus élevé dans les champs qui inclut la combinaison pollinisateur de Bombus et Megachile comparé au champs seulement avec Apis introduit. Les mesures de comportement des pollinisateur introduit ont aussi varié entre les champs dépendant des espèces présent dans les champs, mais ces changements en comportement n'ont pas été lié au différences dans le rendement de fruit. Comme partie de cette recherche, des auto- pollinisations et des pollinisations croisée ont eu lieu dans plusieurs clones, avec une variabilité dans la dépression de consanguinité vue entre individus. Pour evaluer si des différences dans l'accumulation des mutations somatiques entre individus sont responsable pour la variabilité dans la dépression de consanguinité, une expérience qui a but de modifié accès de auto pollen a suivie. Pour mésurer la différence en charge génétique, la taille des clones a été utilisé pour représenter la division cellulaire somatique. Ni la taille des clones ou l'accès à l'auto pollen fut capable d'expliquer la variation de rendement de fruit entre les clones. Ces mêmes champs on aussi produit un taux de rendement de fruit plus élevé dans les fleurs fécondé avec le pollen geitonogamous comparé au fleurs fécondé avec le pollen autogame. Ces différences suggèrent la présence des mutations somatiques, la sélection lignée cellulaire, la recombinaison mitotique, ou des changement épigénétique dans les clones de bleuets, et ces résulats reflète d'autres études des espèces de plantes vivaces qui indique que la dépression autogame est une force significative dans la fertilié des plantes. Nos résultats suggèrent que l'auto pollinisation joue un rôle important dans la limitation du rendement de fruit et dois être considéré lorsqu'on essai d'augmenter le rendement de fruit chez le bleuet V. angustifolium.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a herpesvirus found commonly in the world population, causing a severe and potentially fatal disease in neonates and immunocompromised patients. Clinical and experimental data indicate that a subset of innate lymphocytes, natural killer (NK) cells, plays a crucial role in resistance to infection. As infection with mouse CMV (MCMV) shares many pathophysiological aspects with the human disease, the mouse represents an excellent model to study CMV infection. The outcome of MCMV infection depends on the host genetic background and thus varies among the multiple inbred mouse strains. Importantly, mouse NK cells, through the expression of germ line encoded receptors, have the ability to recognize CMV infection, resulting in NK cell activation and the destruction of the infected cells. In each strain NK cells express amongst others, different sets of activating and inhibitory Ly49 receptors, in the presence of strain-specific MHC class I molecules, some of which are natural ligands to Ly49 receptors. Nevertheless, the exact mode of NK cell recognition of infected cell and the impact on the outcome of infection are complex and not fully understood. In order to characterize the molecular mechanisms underlying innate resistance to MCMV, we have initiated a systematic study to identify the possible ligands of Ly49 receptors and the nature of their interaction. We assessed the ability of distinct activating and inhibitory Ly49 receptors to recognize MCMV infection, in the context of diverse MHC class I haplotypes in vitro and in vivo. We show that the cognate interaction between several activating Ly49 receptors and MHC class I molecules depends on the presence of the viral regulator of antigen presentation, gp34/m04. Furthermore, we illustrate that, analogous to activating Ly49 receptors, inhibitory Ly49 receptors can be triggered by MCMV infection. This complex interaction, conditional on the type of MHC class I molecules, results in a spectrum of innate immune control of MCMV spread. Altogether, our results identify the fundamental mechanisms of NK cell receptor function in the recognition and eradication of viral infection. These will provide new grounds to understand and manipulate human NK cells in response to viral infections. / Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un herpèsvirus omniprésent dans la population mondiale, qui provoque des symptômes graves et potentiellement mortels chez les nouveau-nés et les patients immunodéprimés. Les données cliniques et expérimentales indiquent qu'un sous-ensemble de lymphocytes innés, dites tueuses naturelles (NK), joue un rôle crucial dans la résistance à l'infection. Comme l'infection par le CMV murin (MCMV) partage de nombreux aspects physiopathologiques de la maladie humaine, la souris constitue un excellent modèle pour étudier l'infection par le CMV. La susceptibilité au MCMV varie grandement selon les lignées de souris congéniques et ce, en fonction de leur patrimoine génétique. Plus précisément, chaque lignée de souris exprime une variété de récepteurs activateurs ou inhibiteurs spécifiques aux cellules NK, les récepteurs Ly49, parallèlement à des répertoires de CMH de classe I variés, dont certains sont des ligands naturels des récepteurs Ly49. En effet, les cellules NK, grâce à l'expression de ces récepteurs encodés dans la lignée germinale, ont la capacité de reconnaître une infection au CMV, ce qui entraîne leur activation et la destruction des cellules infectées. Néanmoins, le mode exact de reconnaissance des cellules infectées par les cellules NK et l'impact sur l'issue de l'infection sont complexes et encore mal compris. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la résistance innée au MCMV, nous avons entrepris une étude systématique des ligands possibles des récepteurs Ly49 et de la nature de leur interaction. Nous avons évalué la capacité de reconnaître l'infection MCMV de différents récepteurs Ly49 activateurs ou inhibiteurs, dans le contexte de divers haplotypes de CMH de classe I in vitro et in vivo. Nous démontrons que l'interaction spécifique entre plusieurs récepteurs Ly49 activateurs et des molécules du CMH de classe I dépend de la présence de gp34/m04, un régulateur viral de la présentation d'antigène. De plus, nous montrons que, comme les récepteurs Ly49 activateurs, les récepteurs Ly49 inhibiteurs peuvent aussi être stimulés par une infection au MCMV. Cette interaction complexe, qui dépend du type de molécules de CMH de classe I, se traduit par des niveaux variable de contrôle de la propagation du MCMV par le système immunitaire. Nos résultats mettent en évidence des mécanismes fondamentaux de la fonction des récepteurs des cellules NK dans la reconnaissance et l'éradication de l'infection virale, et fournissent de nouvelles avenues pour comprendre et manipuler la réponse des cellules NK humaines aux infections virales.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that results from the destruction of the insulin producing beta cells by the immune system. A disease of complex etiology, it involves both genetic and environmental factors. Over 40 genetic loci have been shown to increase T1D risk, where allelic variation at several polymorphisms underlies their genetic association. Two of the most important ones map to chromosome 2q24.3, containing functional polymorphisms at the IFIH1 gene, whose role is to bind double stranded (ds) viral RNA and to subsequently induce a type I interferon response, and to chromosome 16p13, encompassing the single CLEC16A gene whose function is unknown. To elucidate the mechanism of these associations, we undertook separate studies to functionally evaluate the role of a T1D-associated IFIH1 polymorphism and to characterize the possible role of CLEC16A in immunity. We began by investigating the role of the T1D-associated coding polymorphism in the IFIH1 gene, Thr946Ala, contained in a linkage disequilibrium (LD) block that encompasses three other genes. Due to the extent of the LD in the region and the possibility of genetic heterogeneity, the Thr946Ala IFIH1 polymorphism could be a marker for a regulatory variant that affects the expression of IFIH1 or the other genes in the IFIH1 block: GCA, KCNH7, and FAP. Upon testing this hypothesis, we observed no significant transcriptional effects at the IFIH1 locus in tissues most relevant to T1D. We also report that protein alleles of the Thr946Ala single nucleotide polymorphism (SNP) had no significant effect on secreted IFN-α levels induced by poly I:C, a dsRNA mimic. Taken together, both studies suggest that the mechanisms of the observed association of the Thr946Ala SNP remains to be determined but does not involve modulation of mRNA or a poly I:C-driven IFN-α response. For the latter, a greater sample size would be needed to confirm this, due to the large observed variability in the IFN response.Our last study focused on the characterization of the CLEC16A protein, whose preferential expression in two antigen presenting cell types points to its potential role in immunity. We thus hypothesized that CLEC16A could be involved in T-cell co-stimulation and activation and assessed this in an antigen-independent model. We found that CLEC16A does not participate in the T-cell co-stimulation pathway, as shown by the lack of effect of the CLEC16A knockdown on T-cell activation and proliferation. We also show subcellular localization of CLEC16A to the rough endoplasmic reticulum (ER). Our results highlight the difficulty in transitioning from T1D genetic associations to functional studies, which are essential in bridging genetic predisposition with biological mechanisms underlying the immune dysregulation associated with T1D. All hypotheses will need to be examined and ruled out one by one until the true mechanism is discovered. / Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune où les cellules bêta, productrices de l'insuline, sont détruites par le système immunitaire. Cette maladie dont l'étiologie est complexe, implique à la fois des facteurs génétiques et environnementaux. Plus de 40 loci génétiques, où il y a une association avec la variation allélique de plusieurs polymorphismes, ont été montré comme augmentant le risque de DT1. Deux de ces régions les plus importantes sont localisés dans la région chromosomique 2q24.3, qui contient des polymorphismes fonctionnels au niveau du gène IFIH1 dont le rôle est de lier l'ARN double brin (DS) viral pour à la suite induire une réponse interféron de type I (IFN), et dans la région chromosomique 16p13, englobant un seul gène nommé CLEC16A dont la fonction est inconnue. Pour élucider le mécanisme de ces associations, nous avons entrepris des études distinctes pour évaluer le rôle fonctionnel d'un polymorphisme de IFIH1 associé au DT1 et de caractériser le rôle possible de CLEC16A dans l'immunité. Nous avons commencé par étudier le rôle d'un polymorphisme codant, Thr946Ala, du gène IFIH1 associé au DT1 et situé dans un bloc de déséquilibre de liaison (DL) qui comprend trois autres gènes. En raison de l'ampleur du DL dans la région ainsi que la possibilité d'une hétérogénéité génétique, le polymorphisme Thr946Ala IFIH1 pourrait être un marqueur pour un variant qui affecte l'expression du gène IFIH1 ou des autres gènes dans le bloc : GCA, KCNH7 et FAP. Lorsque nous avons testé cette hypothèse, nous n'avons observé aucun effet significatif sur la transcription au niveau du locus IFIH1 dans les tissus les plus pertinents pour le DT1. Nous indiquons également que les allèles protéiniques du polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP) Thr946Ala n'ont pas d'effets significatifs sur les niveaux l'IFN-α sécrété suite à une stimulation par le poly I:C, un composé imitant l'ARN double brin. Pris ensemble, ces deux études suggèrent que les mécanismes de l'association observée pour le SNP Thr946Ala restent à déterminer, mais n'impliquent pas la modulation de l'ARNm ou la réponse d'IFN-α via le poly I:C. Pour ce dernier, un échantillonnage plus grand serait nécessaire afin de confirmer cette hypothèse en raison de la grande variabilité observée dans la réponse IFN. Notre dernière étude portait sur la caractérisation de la protéine CLEC16A dont l'expression préférentielle par deux types de cellules présentatrice d'antigènes, suggère un rôle potentiel dans l'immunité. Nous avons donc émis l'hypothèse que CLEC16A pourrait être impliqué dans la co-stimulation et l'activation des lymphocytes T et avons évalué celle-ci dans un modèle indépendant d'un antigène. Nous avons constaté que CLEC16A ne participe pas dans la voie de la co-stimulation, comme en témoigne par l'absence d'effets sur l'activation et la prolifération des lymphocytes T lors de la déplétion de CLEC16A. Nous montrons également que la localisation subcellulaire de CLEC16A est dans le réticulum endoplasmique rugueux (RE). Nos résultats mettent en évidence la difficulté qu'est de faire la transition à partir d'associations génétiques avec le DT1 vers des études fonctionnelles, qui sont essentielles pour pouvoir faire le pont entre la prédisposition génétique et les mécanismes biologiques qui sous-tendent le dysfonctionnement immunitaire associé au DT1. Toutes les hypothèses devront être examinées et écartées une par une jusqu'à ce que le mécanisme réel soit découvert.

Gliomas are the most common primary brain tumors in children and adults, consisting of astrocytomas, oligodendrogliomas, oligoastrocytomas and ependymomas. Glioblastoma (GBM, grade IV) is the most aggressive astrocytoma with poor clinical outcome. DNA copy number and gene expression signatures indicated differences between the molecular pathogenesis of pediatric and adult cases, and there is currently insufficient information about pediatric GBM to improve treatment. To understand the molecular pathogenesis and develop new therapeutic targets for pediatric and young adult GBM, we studied in this thesis work the molecular function of YB-1, previously identified to be overexpressed in pediatric GBM, in astrocytoma formation. We also performed a comprehensive mutational analysis using whole exome sequencing to further explore the genetic alterations important in pediatric GBM. Our results suggest that YB-1 modulates proliferation and migration, based on its sub-cellular localization, and argue for caution in targeting YB-1 for therapeutic intervention. We also discovered somatic mutations in the H3.3-ATRX-DAXX chromatin remodeling pathway in 44% of pediatric GBMs, and frequent ATRX alterations in adult diffuse astrocytic gliomas. These findings indicate a central role of epigenetic regulation perturbation in driving pediatric and young adult gliomas, and provide novel targets for therapeutic development. / Les gliomes sont les tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes les plus fréquentes. Parmi eux, on distingue les astrocytomes, les oligodendrogliomes, les oligoastrocytomes et les épendymomes. Le glioblastome (GBM, grade IV) est l'astrocytome plus agressif avec un sombre pronostic clinique. Les données de profil d'expression de gènes et de variation du nombre de copies de l'ADN ont montré que les tumeurs pédiatriques se distinguent des tumeurs adultes. Cependant, l'état des connaissances actuel est insuffisant pour permettre un traitment plus efficace. Pour comprendre la pathogenèse moléculaire et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour les GBM pédiatriques et du jeune adulte, nous avons étudié dans ce travail de thèse, la fonction moléculaire de YB-1, précédemment identifié pour être surexprimé dans les GBM pédiatriques, potentiellement impliqué dans la formation des astrocytomes. Nous avons également effectué un séquençage d'exome pour explorer les altérations génétiques majeures dans les GBM pédiatriques. Nos résultats suggèrent que YB-1 module la prolifération et la migration cellulaire, en fonction de sa localisation sub-cellulaire, et incitent à la prudence dans un éventuel ciblage thérapeutique de YB-1. Nous avons également découvert des mutations somatiques dans la voie H3.3-ATRX-DAXX impliquée dans le remodelage de la chromatine dans 44% des GBM pédiatriques, ainsi que de fréquentes modifications d'ATRX dans les gliomes diffus de l'adulte. Ces résultats montrent le rôle centrale la régulation épigénétique dans la formation des gliomes pédiatriques et du jeune adulte, permettant de fournir de nouvelles cibles pour le développement thérapeutique.

Glucocorticoids (GCs) are vital hormones involved in lung development and the regulation of the inflammatory/immune response. High inter-individual variability in GC responsiveness exists among patients using steroids as treatment for inflammatory diseases. Evidence suggests that vitamin D (VitD), another player in lung development, improves GC function. Even though progress has been made in the study of steroid insensitivity, the molecular mechanisms are not completely elucidated and the effects of limited GC response during lung development have not been explored. The first objective of the present thesis was to study mechanisms of steroid responsiveness in asthma using mouse models of the disease. The Balb/c strain demonstrated a steroid insensitive phenotype associated with increased amounts of active p38 MAPK and subsequent inactivation of the GC receptor (GR) following allergen challenge. Additionally, lymphoblast cell lines derived from asthmatic children were used to study mechanisms for variable GC responsiveness and to explore the modulatory role of VitD on GC function. Poor responsiveness to steroids in asthmatic children was associated with limited GR nuclear bioavailability as a consequence of decreased baseline GR expression and faster hormone-induced downregulation. Suggestive evidence for a beneficial effect of VitD in steroid sensitivity is presented. Finally, steroid responsiveness and VitD modulation of GC function was studied in epithelial cells of the developing lung of normoresponsive and atopic rat models. The developmental airway epithelium of the atopic rat appeared to be more sensitive to steroids, possibly making the lung more susceptible to the deleterious effects of GCs, and VitD attenuated the GC response. Overall this thesis highlights the complexity of steroid function and its regulation by multiple mechanisms ranging from altered expression, reduced activation, abnormal nuclear translocation and increased homologous downregulation of GR. / Les glucocorticoïdes (GC) sont des hormones vitales impliquées dans le développement des poumons et de la régulation de la réponse inflammatoire/immunitaire. Une grande variation interindividuelle de la réactivité des GC existe chez les patients utilisant des stéroïdes comme traitement pour les maladies inflammatoires. Les preuves suggèrent que la vitamine D (VitD), une autre molécule impliquée dans le développement des poumons, améliore la fonction des GC. Même si des progrès ont été réalisés dans l'étude de l'insensibilité aux stéroïdes, les mécanismes moléculaires ne sont pas complètement élucidés et les effets de la réponse compromise aux GC au cours du développement pulmonaire n'ont pas été explorés. Le premier objectif de cette thèse est d'étudier les mécanismes de réactivité des stéroïdes dans l'asthme en utilisant des modèles murins de la maladie. La souche Balb/c a démontré un phénotype d'insensibilité aux stéroïdes associé à des quantités accrues de p38 MAPK sous forme active et l'inactivation subséquente du récepteur des GC (GR) après provocation par un allergène. De plus, des lignées cellulaires lymphoblastiques provenant d'enfants asthmatiques ont été utilisées pour étudier les mécanismes de réactivité variable des GC et ont permis d'explorer le rôle modulateur de la VitD sur la fonction des GC. Chez les enfants asthmatiques, une faible réactivité aux stéroïdes a été associée à une biodisponibilité nucléaire limitée du GR à la suite de l'expression basale diminuée du GR et de la rapide régulation négative induite par l'hormone. Des évidences suggérant un effet bénéfique de la VitD sur la sensibilité aux stéroïdes sont présentées. Enfin, la réactivité des stéroïdes et la modulation de la fonction des GC par la VitD ont été étudiées dans les cellules épithéliales du poumon en développement des modèles de rats normaux et atopiques. L'épithélium des voies respiratoires du rat atopique semble être plus sensible aux stéroïdes, en rendant possiblement les poumons plus susceptibles aux effets néfastes des GC, et la réponse des GC est atténuée par la VitD. Cette thèse met en évidence la complexité de la fonction de stéroïdes et de sa régulation par des mécanismes multiples allant de l'expression altérée, l'activation réduite, la translocation nucléaire anormale et l'augmentation de la régulation négative homologue des GC.

The clk-1 mutants of the nematode Caenorhabditis elegans display a highly pleiotropic phenotype that includes an average slowing down, and deregulation of a number of physiological processes, including embryonic and post-embryonic development, aging, and several rhythmic behaviors. clk-1 encodes a conserved enzyme that is necessary for the biosynthesis of ubiquinone (coenzyme Q), a lipid-like molecule that functions as a transporter of electrons in the respiratory chain. One of the features affected in clk-1 mutants is the defecation cycle. Several defecation suppressors of clk-1 genes (dsc) were identified. DSC-4/MTP encodes the worm homolog of the Microsomal Triglyceride Transfer Protein (MTP), a protein whose activity in vertebrates has been found to be crucial for the formation and secretion of ApoB-containing lipoproteins, such as LDL. DSC-3/TAT-2 is a worm homologue of ATP8B1, a flippase that is required for normal bile acid secretion in mammals. By studying these mutants, we found that C. elegans synthesizes and secretes cholesterol-derived molecules with properties and functions resembling those of mammalian bile acids, and that the defecation phenotype of clk-1 mutants is due to altered levels of these bile acid like-molecules resulting from increased mitochondrial oxidative stress in these mutants. As mammalian bile acids function as steroid hormones that mediate lipid, energy and glucose metabolism, our finding that the biology of bile acid–like molecules is regulated by oxidative stress provides a new hypothesis for the significance of oxidative stress in metabolic diseases. / Chez le nématode Caenorhabditis elegans, les mutants du gène clk-1 montre un large éventail de défauts phénotypiques incluant un ralentissement de leur développent, un grand nombre de dérégulations physiologiques comme le développement embryonnaire et post embryonnaire, et le vieillissement, ainsi que certains comportements. Le mutant clk-1 code pour une enzyme, évolutionnairement conservée, nécessaire à la biosynthèse de l'ubiquinone (coenzyme Q), une molécule proche des lipides, qui intervient dans le transport des électrons dans la chaine respiratoire. Le mutant clk-1 montre un défaut du comportement de défécation. Nous avons identifié de nombreux gènes supprimant ce phénotype, que nous avons nommés dsc (defecation suppressors of clk-1). DSC-4/MTP est l'homologue de MTP (Microsomal Triglyceride Transfer Protein) chez les vertébrés, une protéine essentielle à la formation et à la sécrétion des lipoprotéines qui contiennent l'apolipoprotéine B, comme les LDL. DSC-3/TAT-2 est une homologue de l'ATP8B1, une flippase requise lors de la sécrétion des acides biliaire chez les mammifères. L'étude de ces deux mutants révèle que C. elegans synthétisent et sécrètent des molécules dérivées du cholestérol dont les fonctions et les propriétés ressemblent à celles des acides biliaires chez les mammifères. De plus, les défauts de la défécation chez les mutant clk-1 sont dus à une altération de ces molécules provenant de l'augmentation du stress oxydatif mitochondrial. Chez les mammifères, les acides biliaires fonctionnent comme des hormones stéroïdes qui régulent les lipides, le métabolisme du glucose, et l'énergie de la cellule. La régulation par le stress oxydatif de ces molécules nous permet donc d'établir de nouvelles hypothèses sur l'importance du stress oxydatif dans la maladie qui affectent le métabolisme.

The enzyme DNA methyltransferase 3-like (DNMT3L) is essential for de novo DNA methylation in germ cells, proper germ cell development, and has been reported as the first paternal effect gene in mammals. In mice, although Dnmt3L heterozygous or haploinsufficient (+/-) males are fertile, there are associated chromosomal compaction abnormalities and the males have been shown to sire an increased number of aneuploid offspring even if the offspring do not possess the mutant allele (the paternal effect). Despite this, there have been no reported DNA methylation abnormalities in Dnmt3L haploinsufficient mature male germ cells. This is unexpected as DNMT3L's only known function is its role in DNA methylation and some of the phenotypes seen in Dnmt3L+/- males were observed in sperm. Therefore we assessed DNA methylation defects in Dnmt3L haploinsufficient mature sperm using a genome-wide, bisulfite sequencing based method, reduced representation bisulfite sequencing (RRBS). Our experiments revealed a total of 367 hypomethylated sites and 88 hypermethylated sites found in the sperm of Dnmt3L+/- as compared to wildtype mice. These differentially methylated sites were determined by comparing 100bp genomic tiles that had DNA methylation levels that were at least 20% different between Dnmt3L+/+ (n=4) and +/- (n=5) sperm. The hypomethylated regions were mainly found in intergenic LINE1 sequences, while the hypermethylated regions were found more frequently in regulatory and exonic sequences. The findings confirm that a dosage change, without complete obliteration, of a key epigenetic regulator in the male germline can result in DNA methylation abnormalities. These gene dosage effects associated with Dnmt3L haploinsufficiency also prompted us to test the effects of Dnmt3L overexpression in the murine germline. Therefore we created a transgenic mouse model that overexpresses endogenous DNMT3L at a higher level than in wildtype germ cells. This model was successfully created and initial mating trials of the F0 revealed a trend toward female sub-fertility. Although preliminary, it appears as though the overexpression of Dnmt3L in the mouse using a germ cell specific promoter is of greater consequence to the female germline in comparison to that of the male. / L'enzyme ADN méthyltransférase 3-like (DNMT3L) est essentielle durant l'établissement initial de la méthylation de l'ADN dans les cellules germinales ainsi que dans le développement de ces dernières. Dnmt3L est le premier gène à effet paternel caractérisé chez le mammifère. Bien que les mâles Dnmt3L hétérozygotes (+/-) sont fertiles, ils démontrent des anomalies au niveau de la compaction chromosomique et de l'expression des gènes post-méiotiques. La descendance de ces mâles démontre des taux d'aneuploïdies supérieurs, et ce même si la progéniture ne possède pas d'allèle mutante (effet paternel). Malgré ces faits, aucune perturbation de la méthylation d'ADN n'a été exposée dans les cellules germinales matures de mâles Dnmt3L haploinsuffisants. Cette situation est énigmatique puisque les seules fonctions rattachées à DNMT3L sont un rôle dans la méthylation d'ADN et certains phénotypes observés dans les spermatozoïdes de mâles Dnmt3L+/-. Conséquemment, nous avons examiné les irrégularités de méthylation d'ADN, causé par une haploinsuffisance de Dnmt3L, dans les spermatozoïdes matures et ce à l'échelle du génome entier par technique de représentation réduite de séquençage bisulfite (RRBS). Nos travaux ont révélé qu'un total de 367 régions hypométhylées et 88 régions hyperméthylées dans les spermatozoïdes de Dnmt3l+/- en comparaison avec les souris de type sauvage. Ces loci différentiellement méthylés ont été déterminés en comparant des tuiles génomiques de 100 pb démontrant au moins 20% de différence entre les spermatozoïdes Dnmt3L+/+ (n=4) et Dnmt3+/- (n=5). Les régions hypométhylées sont principalement retrouvées dans les séquences intergéniques LINE1, tandis que les régions hyperméthylées sont plutôt localisées à l'intérieure de séquences régulatrices et exoniques. Nos résultats confirment qu'un simple changement de dosage, sans complètement annihiler l'expression, d'un régulateur épigénétique clé à l'intérieur des cellules germinales mâles engendre la déformation des patrons de méthylation de l'ADN. Les conséquences associées à l'effet-dose, due à l'haploinsuffisance de Dnmt3L, nous ammène à s'interroger sur la répercussion qu'aurait une surexpression Dnmt3L dans la lignée germinale murine. Par conséquent, nous avons créé un modèle de souris transgénique qui surexprime une forme endogène de DNMT3L à un niveau plus élevé que des cellules germinales de type sauvage. Ce modèle a été créé avec succès et les essais d'accouplement initiaux de la F0 révèlent une tendance de sous-fertilité des femelles. Bien que les résultats soient préliminaires, il semble que la surexpression de Dnmt3L chez la souris, en utilisant un promoteur spécifique aux cellules germinales, a des conséquences plus sévères au niveau de la lignée germinale femelle comparativement à celle du mâle.

The claudin (Cldn) family of integral membrane proteins has roles in determining tight junction paracellular transport properties, formation and maintenance of epithelial cell layers, and morphogenesis. In the adult mouse kidney, claudin family members are expressed along the nephron and determine the specific paracellular transport properties of each nephron segment. The function of claudin proteins during kidney morphogenesis remains unclear. During kidney development, the ureteric bud emerges from the nephric duct and undergoes branching morphogenesis: the ureteric bud elongates and divides in a series of repeated bifurcations at the ureteric bud tips which ultimately give rise to the collecting ducts of the adult kidney. Based on the documented roles of claudins in organ morphogenesis and in renal physiology, we hypothesized that claudins are critical for kidney development and that perturbing their expression will lead to kidney malformations. To determine which claudins are expressed in the developing mouse kidney, RT-PCR analysis of embryonic day (E) 11.5 mouse kidneys was performed, and this revealed that 17 of the 25 members of the family were expressed. Cldn7, 16, and 19 are important for renal paracellular transport in the adult kidney. Cldn7 knockout mice die from dehydration during the first few weeks of life and Cldn16 and Cldn19 mutations result in renal magnesium and calcium wasting. Expression analysis of these claudins was performed during critical time points of mouse kidney development. By RT-PCR analysis, Cldn7 and Cldn19 were detected starting at E11.5, whereas Cldn16 was expressed starting from E13.5. Whole mount in situ hybridization showed that Cldn7 was expressed in the nephric duct at E9.5 and ureteric bud tips and stalks at later stages of kidney development whereas Claudin16 and Claudin19 were expressed at later stages of kidney development in tubular structures of E16.5 mouse kidneys. To examine if Claudin7 and Claudin16 mouse models have a defect in ureteric bud branching morphogenesis, nephron numbers were counted. In both models, no difference in nephron number compared to controls was found. This data suggest that other claudins expressed during kidney development might compensate for the loss of Cldn7 and Cldn16 such that the loss of these claudins does not lead to any renal morphological defects.We then examined if multiple claudins were critical for branching morphogenesis of the ureteric bud and if altering their expression would perturb kidney development. The C-terminus of Clostridium perfringens enterotoxin (C-CPE) binds to the second extracellular loop of Cldns 3, 4, 6, 7, 8, and 14, leading to their removal from tight junctions. By RT-PCR analysis, Cldn3, 4, 7, and 8 were detected at E11.5 onwards, Cldn6 was expressed at E11.5 to P1, and Cldn14 was expressed starting from E16.5 onwards. Using in situ hybridization analysis, Cldn3, 4, 6, 7, and 8 were expressed in the nephric duct and in the ureteric bud at E9.5 and E10.5 and in the ureteric bud tips and trunks at E13.5 and E16.5. Cldn14 was expressed only at E16.5 in late tubular structures. Removal of multiple claudins was performed by growing mouse embryonic kidney explants in the presence of C-CPE. A dose response curve was established by monitoring the formation of ureteric bud tips in explanted E11.5 and E12.5 kidneys cultured in a range of concentrations of C-CPE: 20µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml, and 500µg/ml. Based on quantitative analysis of ureteric bud tips of C-CPE and control E11.5 and E12.5 kidneys, the 200µg/ml dose was chosen as the standard dose for subsequent experiments. Then we confirmed our results by treating E12.5 explants with 200µg/ml C-CPE. C-CPE-treated kidneys did not differ in size from control kidneys but had decreased ureteric bud tip number and branching. In conclusion, our data suggest that claudins have a role in ureteric bud branching during kidney development. / La famille de protéines transmembranaire des Claudines (Cldn) joue un rôle dans l'établissement des propriétés de transports paracellulaires des jonctions serrées, dans la formation et dans le maintien des couches cellulaires épithéliales et dans la morphogénèse. Chez la souris adulte, les membres de la famille des Cldns sont exprimés le long du néphron et déterminent les propriétés spécifiques du transport paracellulaire de chaque segment du néphron. La fonction des Cldns durant la morphogénèse rénale reste à préciser. Durant le développement rénal, le bourgeon urétéral émerge du canal de Wolff et initie le processus de morphogénèse de ramification : le bourgeon urétéral subit une élongation, puis des ramifications successives à l'extrémité des différentes branches qui ultimement formeront le système collectif du rein adulte. Basé sur le rôle documenté des Cldns dans la morphogénèse et la physiologie rénale, nous soumettons l'hypothèse que les Cldns ont un rôle critique dans le développement rénal et que perturber leur expression entraîne des malformations rénales. Pour déterminer quelles Cldns sont exprimées durant le développement rénal murin, une analyse par RT-PCR de reins embryonnaires (E) de 11.5 jour a été effectuée. Cette expérience révèle que 17 des 25 membres de la famille sont exprimés. Les souris knock-out Cldn7 meurent de déshydratation durant leurs premières semaines de vie et des mutations de Cldn16 et Cldn19 résultent dans la perte de calcium et magnésium rénal. L'analyse de l'expression a été effectuée à des moments critiques du développement rénal. L'utilisation de la RT-PCR a permis de déterminer que l'expression de Cldn7 et Cldn19 commence à E11.5 et que celle de Cldn16 commence à E13.5. L'hybridation in situ sur tissu montre que Cldn7 est exprimée dans le canal de Wolff à E9.5 et à un stade ultérieur du développement dans les ampoules urétérales et dans les branches. Cldn16 et Cldn19 sont quant à elles exprimées au stade E16.5 dans des structures tubulaires. Pour déterminer si les souris Cldn7 et Cldn16 ont un défaut de morphogénèse de ramification, le nombre de néphron a été calculé. Dans les deux modèles, aucune différence n'a été observée entre les contrôles et les knockouts. Ces résultats suggèrent que d'autres Cldns exprimées durant le développement rénal peuvent compenser pour la perte de Cldn7 et Cldn16 expliquant que l'absence de ces Cldns n'entraîne aucun défaut dans la morphologie rénale. Nous avons donc examiné si de multiples Cldns jouent un rôle critique dans la ramification du bourgeon urétéral et si l'altération de leurs expressions perturbe le développement rénal. L'extrémité C-terminale de l'entérotoxine Clostridium perfringens (C-CPE) se lie à la seconde boucle extracellulaire des Cldns3, 4, 6, 7, 8 et 14 les enlevant par le fait même de la jonction serrée. La RT-PCR a permis de déterminer que Cldn3, 4, 6, 7 et 8 sont exprimées à partir d'E11.5. Cldn6 est exprimée entre E11.5 et P1 et Cldn14 est exprimée à partir d'E16.5. L'hybridation in situ montre que Cldn3, 4, 6, 7 et 8 sont exprimées dans le canal de Wolff et dans le bourgeon urétéral à E9.5 et E10.5. Aux stades E13.5 et E16.5, elles sont exprimées dans les ampoules urétérales et dans les branchements. Cldn14 est exprimée uniquement à E16.5 dans les structures tubulaires matures. Des explants de reins E11.5 et E12.5 ont été cultivés en absence ou présence de C-CPE (20µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml et 500µg/ml). Basé sur une analyse quantitative du nombre d'ampoules urétérales, la dose de 200µg/ml a été choisie comme standard. Nous avons confirmé nos résultats en traitant les explants d'E12.5 avec 200µg/ml de C-CPE. La taille des reins traités avec le C-CPE ne diffèrent pas de celle des contrôles, mais le nombre d'ampoules urétérales et de ramification est inférieur. En conclusion, nos résultats suggèrent que les Cldns jouent un rôle dans la ramification du bourgeon urétéral durant le développement rénal.

Introduction: Numerous reports have shown that recombinant BMPs have positive effects in several conditions associated with poor bone formation.  We hypothesize that by inhibiting BMP antagonists Noggin and Chordin using RNA interference we may upregulate endogenous BMP expression and enhance osteogenesis. Methods: MC3T3-E1 cells were transduced with lentiviruses expressing various shRNAs targeting the mouse Noggin (5 shRNAs) and Chordin (3 shRNAs) genes and 1 negative control. At various time points after infection, levels of RNA expression for Noggin and Chordin were monitored through RT-PCR. Western blotting were performed on the cell extracts and culture media to verify the expression and secretion of Noggin and Chordin proteins. Cell extracts were also analyzed on day 2 and 4 after transduction for alkaline phosphastase activity which is a marker of osteogenic differentiation. DO was performed on the right tibia of 54 wild-type mice using a miniature Illizarov distraction device. Animals were randomized into two major groups according to the time of sacrifice: end of distraction (day 17) and mid-consolidation (day 34). Each major group was sub-divided in 3 subgroups representing the type of injection that was administered at the site of distraction on day 8. For each time point, 9 mice were injected with PBS, 9 with a lentivirus plasmid containing a Non-Target (NT) shRNA and 9 with lentivirus plasmids containing shRNAs targeting Noggin-Chordin. To evaluate the success of the infection a GFP marker was added to lentivirus plasmid targeting Noggin-Chordin. For each subgroup 6 collected samples were studied using Faxitron X-ray, μCT and immunohistochemistry and 3 were studied using Rt-PCR.  Results: On non-tranduced MC3T3-E1 cells, the levels of RNA expression of Noggin and Chordin was at its highest level on Day 7. At this timepoint, qRT-PCR analysis showed that the shRNAs were effective in knocking down Noggin and Chordin endogenous mRNA levels down to 10% and 17%, respectively, by the most potent of shRNAs tested compared to control. Western Blot analysis also corroborates that the respective shRNAs were effective in knocking down the Noggin and Chordin proteins. Specific activity of alkaline phosphatase was increased in MC3T3-E1 cells stably expressing Noggin and Chordin shRNA.Concerning our in vivo work, all the surgeries and distraction were successful except for the death of 2 animals secondary to post-operative complications. However, at the time of the injection the majority of the injection content was extravasating out of the injection site. Once the samples collected, the Faxitron X-ray and μCT studies did not show a significant difference of bone volume or in the ratio of bone volume/tissue volume at the distraction site in between the 3 injection subgroups at both time points. The Rt-PCR studies did not show a significant difference in inhibiting Noggin or Chordin mRNA levels in between the 3 subgroups at both time points. Finally, the immunohistochemistry studies were stopped after the GFP marker was found in all the three subgroups. Conclusion: In our in vitro study, western blot analysis, qRT-PCR and ALP assay were consistent with a successful knockdown of Noggin and Chordin. During our in vivo study, the main issues faced during this project were technical problems during the injection. Unfortunately, our study did not show any significant difference in bone formation after using injection of lentivirus plasmid with shRNA targetting BMPs antagonists Noggin and Chordin. / Introduction: Plusieurs études ont demontré que l'utilisation des BMPs ont des effets positifs sur plusieurs conditions associées avec une mauvaise formation osseuse. Notre hypothèse est qu'en inhibant les antagonites des BMPs Noggin et Chordin en utilisant une technique d'interférence de l'ARN nous pourrions augmenter l'expression endogène des BMP et par le fait même augmenter l'osteogénèse. Methodes: Les cellules MC3T3-E1 furent transfectées avec les lentivirus qui expriment différents shRNAs visant Noggin (5 shRNAs) et Chordin (3 shRNAS) chez la souris. Un contrôle négatif fut aussi sélectionné, NT (Non-Target shRNA). À différents temps après l'infection, les niveau d'expression d'ARN furent mesurés à l'aide d'un RT-PCR. Des études de Western blot furent performées sur les extraits cellulaires et sur les milieux de culture pour vérifier l'expression et la sécrétion des protéines Noggin et Chordin. Des extraits cellulaires furent aussi analysés au jour 2 et 4 après l'infection pour mesurer l'activité de l'alkaline phosphatase, qui est un marqueur de la différentiation osteogenique.Par la suite, une distraction osseuse a été réalisée sur le tibia droit de 54 souris de type sauvage à l'aide d'un miniature fixateur externe Ilizarov. Les animaux étaient randomisés en 2 groupes selon leur temps de sacrifice : fin de la distraction (Jour 17) et mi-consolidation (Jour 34). Chaque groupe était sous-divisé en 3 sous-groupes représentant le type d'injection qui était administrée au site de distraction au jour 8. Pour chaque temps de sacrifice, 9 souris étaient injectées avec du PBS, 9 souris avec un Non-Target shRNA (NT) et 9 souris avec des lentivirus contenant Noggin et Chordin. Pour évaluer le succès notre infection, le shRNA qui visait Noggin fut transféré dans un plasmide contenant un marqueur GFP. Aussi, pour chaque sous-groupe, 6 échantillons étaient collectés pour une étude au Faxitron X-ray, μCT and immunohistochimie et 3 échantillons furent étudiés à l'aide du RT-PCR.  Resultats: Sur les cultures de MC3T3-E1 non transfectées, les niveaux d'expression d'ARN pour Noggin et Chordin étaient à leur plus haut niveau au Jour 7. Au Jour 7, les études au RT-PCR ont aussi démontré que les lentivirus contenant les shRNAs les plus efficaces avaient créé une diminution des niveaux endogènes d'expression d'ARN de Noggin et Chordin à 10 et 17% respectivement comparés au contrôle. Les analyses de Western Blot ont aussi confirmé que ces mêmes shRNAs avaient réussi une diminution significative des protéines de Noggin et Chordin. Aussi, l'activité de l'alkaline phosphatase était augmentée par les cultures exprimant de façon stable les shRNAs visant Noggin et Chordin. Pour les études in vivo, toutes les chirurgies et les distraction furent réussies à l'exception de 2 morts suite à des complications chirurgicales. Toutefois, au moment de l'injection la majorité du contenu de l'injection However, at the time of the injection the majority of the injection ressortait du site d'injection. Une fois les échantillons collectés, les études Faxitron X-ray et μCT n'ont pas démontré de différence significative entre les 3 groupes dans le volume osseux ou le ration du volume osseux/volume tissulaire et ce, aux 2 temps de sacrifices. Finalement, les études en immunohistochimie furent arrêtées après qu'un marquage au GFP fut retrouvé dans les 3 groupes.Conclusion: Les analyses de Western blot analysis, qRT-PCR et les essais d' ALP assay sont en accord avec un knockdown réussi de Noggin et Chordin lors de notre étude in vitro. Lors de notre étude in vivo, les principaux problèmes rencontrés furent reliés à la technique de l'injection. Malheureuse, cette partie de notre étude n'a pas pu démontrer de différence significative dans la formation osseuse après l'utilisation d'injection de lentivirus contenant des shRNAs visant les antagonistes des BMPs Noggin et Chordin.

Ovarian cancer is a heterogeneous and deadly malignancy where both an understanding of the disease biology and effective therapies are lacking. Efforts to characterize the disease are challenged by the genetically and clinically distinct manifestations of the disease currently defined by histopathology. The serous histopathological subtype represents the majority of cases and fatalities due to the disease and is the focus of this thesis. Using a unique series of ovarian cancer cell lines (OV-90neo, RH-5, RH-6 and RH-10) representative of aspects of the high-grade serous subtype, we examined the genes differentially expressed at the mRNA level between the tumorigenic OV-90neo and the non-tumorigenic genetically modified 'hybrid' (RH-5, RH-6 and RH-10) cell lines, within a series of publicly available high-grade serous tumor samples and ovarian surface epithelium cytobrushings. Selecting for those genes that also differed in their expression levels between the high-grade serous tumors and the ovarian surface epithelium, we identified a small, focused, candidate gene list that captured aspects of high-grade serous biology and processes related to the tumorigenicity of the disease. Using established bioinformatics programs, we identified biological conditions, processes, pathways and functions associated with this candidate list. These results supported the relevance of the hybrid cell lines to high-grade serous ovarian cancer and identified gene candidates and molecular pathways for future research. Our research group had previously implicated the candidate gene ceruloplasmin (CP) in the disease, leading us to characterize its protein expression in a large series of clinically annotated high-grade serous tumor samples. The results identified a statistically significant relationship between protein expression of CP and patient progression-free survival, supporting further research into the role of this gene in ovarian cancer. We have demonstrated the utility of the hybrid cell lines in investigating ovarian cancer biology and suggest that they may serve as an effective model for the study of this disease. / Le cancer de l'ovaire est une maladie hétérogène et mortelle pour laquelle la compréhension des mécanismes biologiques ainsi que des thérapies efficaces manquent. Les efforts mis en œuvre pour caractériser la maladie sont entravés notamment par une disparité clinique et génétique des manifestations de la maladie, qui est elle-même définie par des critères histologiques. Le sous-type histologique séreux représente la majorité des cas et des décès dus à la maladie, et sera le sujet central de cette thèse. En se servant d'une série de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire (OV-90neo, RH-5, RH-6 and RH-10), représentatives du sous-type séreux de haut grade, nous avons examiné les gènes différentiellement exprimés au niveau de l'ARN messager entre la lignée cellulaire tumorigénique OV-90neo et les lignées « hybrides » génétiquement modifiées non-tumorigéniques (RH-5, RH-6 and RH-10) dans une série d'échantillons de tumeurs séreuses de haut grade et de cellules épithéliales de l'ovaire prélevées à la cytobrosse. provenant d'une etude independante et accessible au public. En sélectionnant les gènes montrant aussi une expression différentielle entre les tumeurs séreuses de haut grade et les cellules épithéliales de surface de l'ovaire, nous avons identifié une liste de gènes candidats, réduite et ciblée, qui capture les aspects biologiques du sous-type séreux de haut grade ainsi que les processus liés à la tumorigénicité de la maladie. En utilisant des programmes bio-informatiques, nous avons identifié les conditions, processus, voies de signalisation et fonctions biologiques associés à cette liste de candidats. Ces résultats ont permis de confirmer la validité des lignées cellulaires hybrides comme modèle pour l'étude du cancer de l'ovaire de type séreux de haut grade et d'identifier des gènes candidats et des voies de signalisation pour les recherches futures. Notre groupe de recherche avait précédemment impliqué le gène candidate ceruloplasmin (CP) dans la maladie, nous menant ainsi à caractériser l'expression de la protéine dans une large série d'échantillons de tumeurs ovariennes séreuses de haut grade annotées pour l'information cliniques. Les résultats identifièrent une corrélation statistiquement significative entre l'expression de la protéine CP et la survie des patientes sans progression de la maladie, encourageant des recherches plus approfondies sur le rôle de ce gène dans le cancer de l'ovaire. Nous avons démontré l'utilité des lignées cellulaires hybrides pour l'examen de la biologie du cancer de l'ovaire et proposons ces cellules comme modèle efficace pour étudier la maladie.