Control of mRNA translation is one of the major regulatory events in eukaryotic gene expression. Recent research has established the existence of a protein kinase family in mammalian cells, whose members phosphorylate the alpha (alpha) subunit of the eukaryotic initiation factor eIF2 (eIF2alpha) at serine 51 and regulate mRNA translation under various stress conditions. The interferon (IFN)-inducible double-stranded (ds) RNA-activated protein kinase PKR is the prototype of this family. Stress conditions activate PKR by autophosphorylation which leads to inhibition of global protein (including viral protein) synthesis and the apoptosis of infected cells. PKR has been well-characterized as a serine/threonine kinase. However, the tyrosine kinase property of PKR and its functional activity remains undetermined. This study demonstrates that human PKR possesses tyrosine kinase activity and undergoes autophosphorylation at tyrosine (Tyr) residues 101, 162 and 293 in vitro and in vivo. Phosphorylation at these tyrosine residues enhances dsRNA binding-efficiency as well as the dimerization of PKR, which in turn favours the full-scale kinase activation and its substrate phosphorylation. Biologically, tyrosine phosphorylated PKR mediates the anti-viral and cellular anti-proliferation activity of the enzyme through its ability to regulate protein synthesis. In addition, the IFNs modulate PKR at both the transcriptional and posttranslational level. Specifically, tyrosine phosphorylation of PKR is inducible in response to stimulations with IFNs. The Janus kinases (Jaks), a group of cytoplasmic tyrosine kinases, are the upstream enzymes which phosphorylate PKR at Tyr101 and Tyr293 in vitro and in vivo. Moreover, induction of PKR tyrosine phosphorylation by IFNs presents a critical missing link between IFN signaling and the translational machinery which contributes to the early effect of IFNs in inhibiting viral protein synthesis. Such a prompt reaction might allow cells to induce IFN responsive-genes and further fortify the antiviral state of the host.

Tight, yet dynamic, control of translation is critical in order for the cell to respond appropriately to intracellular and extracellular cues. This translational control is achieved by modulating the rate of translation in an mRNA-specific or global manner, often by targeting the protein factors that constitute the translational machinery itself. The function of one such translation initiation factor in mammals, eIF4E Homologous Protein (4EHP), has remained elusive. This is despite evidence from 4EHP's homolog in Drosophila (d4EHP) showing it to act as a translational repressor during embryonic development. In this thesis, in order to address the gap in knowledge regarding 4EHP function, we describe the generation and phenotyping of a new 4ehp-/- mouse model in which 4EHP expression is ablated. Further, we identify potential interacting partners which could constitute the missing links in a closed-loop translational repression model (as seen in Drosophila) during mammalian development. Finally, we investigate how 4EHP impacts the control of cell size and proliferation rate using mouse embryonic fibroblast (MEF) cell lines derived from 4ehp-/- embryos. / Le contrôle stricte, mais dynamique, de la synthèse protéique est une étape critique de la réponse cellulaire aux différents stimuli intra- et extracellulaires. Ce contrôle s'effectue habituellement en agissant sur l'activité des facteurs composant la machinerie traductionnelle pour moduler le rythme de la traduction d'ARNm, soit de façon globale, soit en ciblant des sous-groupes d'ARNm spécifiques. La fonction de l'un de ces facteurs, la protéine homologue de eIF4E (4EHP pour eIF4E Homologous Protein) demeure inconnue chez les mammifères. Le mystère persiste malgré des études démontrant que son homologue chez la drosophile (d4EHP) a un rôle dans la répression de la traduction pendant l'embryogenèse de cet insecte. Dans cette thèse, pour pallier au manque de connaissances sur le rôle de 4EHP, nous décrivons l'élaboration et la caractérisation d'un nouveau modèle de souris 4ehp -/- qui n'expriment pas 4EHP. De plus, nous identifions des partenaires d'interaction potentiels de 4EHP qui pourraient représenter le chaînon manquant d'un modèle de répression traductionnelle en circuit fermée (tel que vu chez la drosophile) lors du développement des mammifères. Finalement, nous étudions l'impact de 4EHP sur le contrôle de la prolifération et de la croissance cellulaire à l'aide de fibroblastes embryonnaires de souris dérivés d'embryons 4ehp -/-.

Vitamin D is produced in the skin or obtained from limited dietary sources. Two sequential hydroxylation reactions in the liver and kidney produce the active form of the hormone, 1,25-(OH)2D3, which binds to and activates VDR to regulate gene expression (genomic effects) or to VDRmem or MARRS to trigger certain signalling pathways (non-genomic effects). 1,25-(OH)2D3 is best known for its effects on calcium and phosphate metabolism, but it also possesses chemopreventive properties for many types of cancers, particularly those of the digestive tract.The anti-proliferative effects of 1,25-(OH)2D3 on SCC25, a head and neck squamous cell carcinoma cell line derived from the floor of the mouth, have previously been demonstrated in this lab. Here, I extend these finding by investigating mechanisms of gene regulation and by discovering novel genes implicated in proliferation and apoptosis regulated by 1,25-(OH)2D3.CCND2, CCNG2, MMP3 and BNIP3 are FoxO target genes, whose expression is controlled by 1,25-(OH)2D3. FoxO transcription factors are bona fide tumour suppressors regulating expression of genes implicated in cell cycle arrest, apoptosis and oxidative stress resistance. I show here that the four FoxO target genes are suppressed (CCND2) or stimulated (CCNG2, BNIP3 and MMP3) by 1,25-(OH)2D3 at the transcription level through activation of FoxO3a. This activation is achieved through deacetylation and dephosphorylation of the transcription factor mediated by SIRT1 and PP1, respectively. Additionally, the crucial role FoxO3a plays in 1,25-(OH)2D3-mediated regulation of these genes is demonstrated by the fact that ablation of FoxO3a attenuates or completely blocks gene regulation. To extend the list of VD-regulated genes implicated in cancer, a microarray analysis was performed. Ingenuity pathway analysis software was used to determine pathways and networks regulated by 1,25-(OH)2D3. Notably, one of the canonical pathways is VDR/RXR activation. Another canonical pathway displays down-regulation of genes responsible for chromosomal replication. In addition, a network of interacting genes constructed by IPA also shows that VD reduces DNA replication and progression through the cell cycle. Several VD-regulated genes (OLR1, MACC1, BIRC3, POLE2, PCNA, CCNB1, CCNA2, APPL1 and BIRC5) were selected and validated by qPCR. Interestingly, all of these genes are down-regulated by 1,25-(OH)2D3 and are over-expressed in various cancer types relative to normal tissues, as assessed using Oncomine. These results support potential mechanisms of VD actions in cancer. / RÉSUMÉLa vitamine D est synthétisée dans l'organisme à partir du rayonnement UV au niveau de la peau, ou bien produite à partir de certains produits spécifiques issus de l'alimentation. Deux réactions d'hydroxylation séquentielles, qui ont respectivement lieu dans le foie et les reins permettent la synthèse de la forme active de l'hormone, 1,25-(OH)2D3. Cette hormone régule l'expression de nombreux gènes via sa fixation au VDR (Récepteur à la Vitamine D) (effets génomiques) et cible également certaines voies de signalisation via sa fixation au VDRmem ou MARRS (effets non génomiques). 1,25-(OH)2D3 est plus connue pour ses effets sur le métabolisme du calcium et du phosphate, mais cette hormone possède également des propriétés chimio-préventives dans de nombreux types de cancers, particulièrement ceux concernant le système digestif. L'effet antiprolifératif de 1,25-(OH)2D3 dans la lignée cellulaire SCC25, (établie à partir de cellules dérivées d'une cavité buccale d'un carcinome de cellules squameuses du cou et de la tête), avait déjà été étudié dans le laboratoire. Durant ce projet, j'ai étendu ces résultats en m'intéressant aux mécanismes de régulation génique et en mettant en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la prolifération et/ou l'apoptose régulée par 1,25D-(OH)2D3.CCND2, CCNG2, MMP3 et BNIP3 sont des gènes cibles de la famille des protéines FoxO, dont l'expression est contrôlée par 1,25-(OH)2D3. Les facteurs de transcription FoxO sont des suppresseurs de tumeurs validés, qui régulent l'expression de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose et la résistance au stress oxydatif. J'ai mis en évidence ici, que les gènes cibles de FoxO sont régulés par 1,25-(OH)2D3 au niveau transcriptionnel, via l'activation de FoxO3a. En effet, l'expression transcriptomique de CCND2 est inhibée, tandis que celles de CCNG2, BNIP3 et MMP3 sont stimulées. L'activation a lieu grâce à la déacétylation et la déphosphorylation des facteurs de transcription FoxO, assurées respectivement par SIRT1 et PP1. De plus, le rôle central que joue FoxO3a dans la régulation génique assurée par 1,25-(OH)2D3 est mise en évidence, par le fait que cette régulation est atténuée ou complètement abolie par l'extinction de FoxO3a par siRNA. Afin d'élargir la liste de gènes régulés par la vitamine D impliqués dans le cancer, nous avons réalisé une analyse par microarrays. Le logiciel d'analyse « Ingenuity » a été utilisé pour déterminer quels sont les voies de signalisation et les réseaux régulés par 1,25-(OH)2D3, notamment la voie canonique de l'activation du VDR/RXR. Une autre voie signalisation impliquée dans la réplication chromosomique est inhibée dans nos conditions. Par ailleurs, un réseau de régulation de gènes réalisés par IPA, a mis en évidence que la vitamine D réduit la réplication de l'ADN et la progression du cycle cellulaire. De nombreux gènes régulés par la vitamine D (OLR1, MACC1, BIRC3, POLE2, PCNA, CCNB1, CCNA2, APPL1 et BIRC5) ont été identifiés et validés par qPCR. De façon intéressante, le logiciel Oncomine montre que l'ensemble de ces gènes est inhibé par 1,25-(OH)2D3 et est surexprimé dans de nombreux types de cancers comparativement à des tissus sains. L'ensemble de ces résultats coincident avec nos observations montrant que 1,25-(OH)2D3 induit l'arrêt du cycle cellulaire et inhibe la prolifération cellulaire.

Chromosome segregation is the crucial step for cell division in most living organisms. In order to segregate the chromosomes equally into mother and daughter cells, the cell needs to build a spindle, which comprises three major components: chromosomes, microtubules and microtubule organizing center (centrosome in animal cells or spindle pole body in fungal cells). The building and normal execution of spindle function are tightly linked to cell cycle control system. gamma-Tubulin is an evolutionally conserved protein with its canonical function as a microtubule nucleator. Here we report that gamma-tubulin is phosphorylated at residue S360, a Cdk1/Cdc28 site. Phosphorylation of S360 in vivo was identified in a global analysis of the phosphoproteome of the spindle pole body (J. Keck and M. Jones, et al.). We confirmed Cdc28-Clb2 can phosphorylate S360 by in vitro kinase assay and peptide identification by mass spectrometry, and in vivo assay using two dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). A phospho-mimetic mutation (tub4-S360D) causes mitotic delay but does not inhibit recruitment of the gamma-tubulin complex (reported by GRIP Spc97-EGFP) to spindle poles. Analysis of synthetic genetic interactions and live cell imaging revealed that cytoplasmic microtubule function is normal in tub4-S360D cells but spindle microtubule function is perturbed. High-resolution analysis of spindle dynamics revealed fluctuations in length in metaphase and anaphase spindles. The velocities of spindle elongation in anaphase are similar in S360D and WT spindles, but the initial phase of rapid elongation in anaphase is prolonged in the S360D mutant, and spindle breakdown is delayed. Interpolar microtubules play a central role in spindle assembly and are actively responsible for spindle elongation with sliding forces generated from microtubule cross-linking proteins such as kinesin-5 (Cin8 in budding yeast). Genetic analysis indicates that mutations in proteins that act redundantly to Cin8 enhance the growth defect in S360D, and S360A can partially suppress deletion of Cin8. High-resolution tomography analysis of S360D mutant and WT cells reveals that the interpolar microtubules organization in S360D is completely perturbed, as almost none overlapping of interpolar microtubules were observed.Therefore, we conclude that S360 phosphorylation of gamma-tubulin/Tub4 by Cdk1/Cdc28 plays an important role in the control of spindle microtubule organization during spindle assembly, through docking and/or monitoring critical microtubule associated proteins, for example Cin8, at microtubule minus end hence regulating their functions on the plus end. / La ségrégation des chromosomes est une étape cruciale pour la division des cellules de la plupart des être vivants. Pour que les chromosomes ségrégent également entre les cellules mère et fille, la cellule doit produire un fuseau comprenant trois composants : les chromosomes, les microtubules et un centre d'organisation des microtubules (le centrosomes chez les cellules animales ou le spindle pole body chez les cellules fongiques). La production et l'exécution normale de la fonction du fuseau sont étroitement couplées au système de contrôle du cycle cellulaire.La gamma-tubuline, une protéine très conservée dans l'évolution, a une fonction de nucléation des microtubules. Nous reportons ici que la gamma-tubuline est phosphorylée au résidu S360, un site pour Cdk1/Cdc28. Initialement identifiée in vivo lors d'une analyse globale du phosphoprotéome du spindle pole body (J. Keck and M. Jones, et al.), la phosphorylation de S360 par Cdc28-Clb2 est confirmée par nos travaux in vitro grâce à des essais kinase suivis d'identification de peptides par spectroscopie de masse et in vivo grâce à l'électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide (2D-PAGE). Une mutation phospho-mimétique (tub4-S360D) provoque un délai mitotique mais n'inhibe pas le recrutement du complexe de gamma-tubuline (détecté grâce à GRIP Spc97-EGFP) aux pôles du fuseau. Les études des interactions génétiques synthétiques et d'imagerie sur cellules vivantes révèlent que la fonction cytoplasmique des microtubules est normale chez le mutant tub4-S360D alors que la fonction des microtubules au niveau du fuseau est perturbée. Une analyse dynamique à haute résolution révèle des fluctuations de la longueur des fuseaux en métaphase et en anaphase. Bien que les vitesses d'élongation du fuseau durant l'anaphase soient similaires chez le mutant S360D et chez le sauvage, la phase initiale d'élongation rapide en anaphase est prolongée et la déconstruction du fuseau est retardée chez la mutant S360D.Les microtubules interpolaires jouent un rôle central dans l'assemblage du fuseau est sont activement responsables de l'élongation du fuseau grâce aux forces de glissement générées par les protéines liant les microtubules telle la kinesine-5 (Cin8 dans la levure de boulangerie). Une analyse génétique indique que des mutations de protéines redondantes avec Cin8 augmentent le défaut de croissance du mutant S360D alors que la mutation S360A supprime partiellement la délétion de Cin8. L'analyse tomographique à haute résolution de cellules du mutant S360D et de cellules sauvages révèle une perturbation extrême de l'organisation des microtubules interpolaires du mutant S360D avec très peu de microtubules interpolaires chevauchants observés.En conséquence, nous concluons que la phosphorylation du résidu S360 de la gamma-tubuline/Tub4 par Cdk1/Cdc28 joue un rôle important dans le contrôle de l'organisation des microtubules au cours de l'assemblage du fuseau, via l'arrimage et/ou le contrôle de protéines associées aux microtubules à l'extrémité (-) des microtubules, comme Cin8, et la régulation de leur fonction à l'extrémité (+) des microtubules.

Activins are members of the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily. Though originally identified as stimulators of pituitary follicle-stimulating hormone (FSH) synthesis and secretion, they also play diverse biological roles, ranging from control of cellular differentiation to regulation of immune responses. To exert their biological effects, activins and other TGFβ family members signal through a heterotetrameric complex composed of two type I (also called activin receptor-like kinases or ALKs) and two type II transmembrane serine/threonine kinase receptors. Within the superfamily, ligands greatly outnumber receptors, hence multiple ligands share receptors and individual ligands can bind various receptors. For instance, activins bind to type II receptors ACVR2 and ACVR2B, leading to recruitment, phosphorylation, and activation of type I receptors (predominantly ALK4 for activins), which in turn phosphorylate downstream effectors. In my research I am particularly interested in activin stimulation of FSH subunit gene (Fshb) expression, the rate-limiting step in production of mature FSH. Here, I used the immortalized murine gonadotrope-like cell line LβT2 to study regulation of activin signaling at the receptor level in the context of Fshb transcription. Activins induce a rapid increase in Fshb mRNA levels and FSH release from pituitary gonadotrope cells, whereas the structurally-related inhibins suppress Fshb transcription by competitively antagonizing activin binding to type II receptors. Interestingly, treating pituitary cells with the translational inhibitor cycloheximide (CHX) produces an inhibin-like effect on Fshb expression. This suggests that one of the components of the activin pathway is labile and requires continued synthesis to regulate Fshb transcription. I established that ACVR2, the main type II activin receptor in gonadotropes, is rapidly turned over in a ligand-independent fashion. My data also suggest that lysosomal and proteasomal pathways are likely not involved in the initial steps of receptor degradation, and that the ectodomain of ACVR2 might be shed at the plasma membrane.Bone morphogenetic proteins (BMP), a sub-family of TGFβ ligands that regulates Fshb transcription along with activins, can also signal through ACVR2 in addition to the BMP type II receptor (BMPR2). I investigated whether activin A could similarly signal via BMPR2. I showed that activin binds BMPR2 with low affinity. Moreover, modulation of BMPR2 expression levels in LβT2 cells, by overexpression or knockdown of the receptor, affected activin-stimulated Fshb transcription. These results indicate that BMPR2 is indeed a functional activin type II receptor in gonadotropes in vitro. Activin receptor promiscuity is not limited to type II receptors. In fact, different activin subtypes (e.g., activin B) can bind at least two other type I receptors (ALK2 and ALK7) with differing affinities. Receptor heterodimerization has been described as a mechanism to generate signaling diversity. However, no heterodimers of activin type I receptors have been described to date. I studied possible combinatorial associations among various TGFβ type I receptors, using a biophysical approach. I showed that ALK4 can form potential heterodimers with ALK2 and ALK5. Overall, my thesis work described novel mechanisms whereby activin signaling can be rapidly modulated in cellulo: variations in amount of available intact ACVR2 at the plasma membrane and signaling via BMPR2, a type II receptor not previously associated with the activin pathway. Dissection of the mechanisms that govern activin function will help us to understand how alterations in these signaling systems lead to pathological conditions such as inflammatory disease, infertility, cancer and cardiovascular disease. This knowledge may, in turn, provide insight for development of newer therapeutic strategies. / Les activines sont membres de la superfamille du facteur de croissance transformant β (TGFβ). Initialement identifés comme étant stimulateurs de la synthèse et sécrétion de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) dans l'hypophyse, elles jouent également divers rôles biologiques. Les activines, débutent la cascade de signalisation cellulaire par interaction avec un complexe hétérotétramérique composé de deux récepteurs de type I (également appelé activine receptor-like kinases ou ALK) et deux récepteurs de type II, les quatre étant des récepteurs transmembranaires à activité sérine/thréonine kinase. Au cœur de cette superfamille, les ligands sont beaucoup plus nombreux que les récepteurs, ce qui explique qu'une multitude de ligands partagent certains récepteurs et que des ligands spécifiques peuvent se lier à des récepteurs différents. Les activines se lient à des récepteurs de type II appelés ACVR2 et ACVR2B, conduisant au recrutement, à la phosphorylation et à l'activation de récepteurs de type I (principalement ALK4 pour les activines), ce qui à leur tour induisent la phosphorylation d'effecteurs en aval de cette cascade. Dans le cadre de mes projets de recherche, je suis particulièrement intéressée à la stimulation par les activines de la transcription de la sous-unité β du gène FSH (Fshb), l'étape limitante dans la production de la FSH bioactive. Pour ce faire, j'ai utilisé la lignée de cellules murines immortalisées modélisant les gonadotropes, appelée LβT2, pour étudier la régulation de la signalisation par les activines au niveau des récepteurs dans le contexte de la transcription du gène Fshb.Chez les cellules gonadotropes hypophysaires, les activines peuvent induire une augmentation rapide des niveaux d'ARN messager Fshb. Au contraire, les inhibines, suppriment la transcription de Fshb induite par les activines, et ce par antagonisme compétitif en se liant aux récepteurs de type II. Le traitement des cellules hypophysaires avec l'inhibiteur de translation cycloheximide (CHX) produit un effet similaire à l'inhibine sur l'expression du gène Fshb. Ces résultats suggèrent que l'une des composantes de la voie de signalisation des activines est labile et nécessite d'être continuellement synthétisée afin réguler la transcription de Fshb. J'ai établi que ACVR2, le principal récepteur de type II pour l'activine dans les cellules gonadotropes, est en constante et rapide regénération (turn over) d'une manière indépendante du ligand. Mes données suggèrent également que l'ectodomaine de ACVR2 pourrait être sectionné à la membrane plasmique.Les protéines morphogénétiques osseuses (bone morphogenetic proteins ou BMP), une sous-famille des ligands TGFβ qui sont capables de réguler la transcription de Fshb comme les activines, peuvent également signaler par le biais du récepteur ACVR2, en plus du récepteur BMP de type II (BMPR2). J'ai cherché à savoir si l'activine A peut aussi communiquer via le récepteur BMPR2. J'ai démontré que l'activine se lie à BMPR2 avec faible affinité. De plus, la modulation des niveaux d'expression de BMPR2 dans les cellules LβT2, par sa surexpression ou suppression, affecte l'activité stimulatrice de l'activine sur la transcription du gène Fshb. Ces résultats indiquent que BMPR2 est en effet un récepteur de type II fonctionnel pour les ligands activines dans les cellules gonadotropes in vitro.La promiscuité des activines pour ses récepteurs ne se limite pas au type II. Différents sous-types d'activines (par exemple l'activine B) peuvent se lier à pas moins de deux autres récepteurs de type I (ALK2 et ALK7). D'autre part, l'hétérodimérisation des récepteurs a souvent été décrite comme étant un mécanisme permettant de générer de la diversité dans la signalisation cellulaire. J'ai étudié les associations possibles entre différentes combinaisons de récepteurs TGFβ de type I. J'ai aussi démontré que ALK4 possède le potentiel de former des hétérodimères avec ALK2 et ALK5.

In eukaryotes, the initiation phase of protein synthesis or translation is a multi-step process that culminates in the positioning of the SOS ribosome at the initiation codon of a messenger RNA (mRNA). Recognition of the cap structure by eukaryotic initiation factor 4F (etF4F; composed of three subunits: the cap-binding protein e1F4E, the RNA-helicase eIF4A and the scaffolding protein eIF4G) facilitates this process. The ability of eIF4F to bind to the cap, as a result of the Cap:eIF4E interaction is of particular importance, as it is the major target of translational regulatory mechanism. / Early embryogenesis requires the activity of various maternal determinants called morphogens, whose spatial and temporal expressions are tightly regulated at the level of translation. Positional information encoded within these factors is thus important for the establishment of body polarity. For instance, in Drosophila, when maternal Caudal (Cad) and Hunchback (Hb) proteins are allowed to accumulate inappropriately in an embryo, anterior and abdominal segmentations are blocked. Hence, the precision of Cad and Hb expression domains is critical for normal development. / An eIF4E-related protein called eIF4E-Homologous protein (4EHP) was first described in 1998. However, the function, if any, of 4EHP in translation has been elusive, since it does not interact with any known initiation factors. In order to elucidate its biological function, the power of Drosophila genetics was used. In this thesis, I show that the Drosophila homolog of 4EHP (d4EHP) interacts with Bicoid (Bcd) and Brain tumor (Brat) proteins to inhibit the translation of maternal cad and hb mRNAs. Simultaneous interaction of d4EHP with the cap and Bcd or Brat results in mRNA circularization, which renders cad and hb mRNAs translationally inactive. This example of cap-dependent translational control that is not mediated by eIF4E defines a new paradigm for translational inhibition involving tethering of the mRNA 5' and 3' ends.

The epigenome, which is comprised of chromatin, associated proteins, and the pattern of covalent modification of DNA by methylation, sets up and maintains gene expression programs. A hallmark of mammalian genomes is the compartmentalization of the DNA into dense inactive chromatin, which is hypermethylated, and active open chromatin, which is hypomethylated. It was originally believed that DNA methylation was the dominant factor determining chromatin structure. However, emerging data suggest that chromatin structure can affect DNA methylation triggering either de novo DNA methylation or demethylation, implying the existence of a bidirectional relationship between chromatin structure and DNA methylation.This thesis studies the mechanisms that control crosstalk between chromatin activation and DNA demethylation. In Chapter 2, I show that the histone deacetylase inhibitor, valproate, induces demethylation of three unrelated, endogenous genes in HEK293 cells (a cancer-testis antigen, a tumor suppressor gene, and a matrix metalloproteinase); these demethylation events occurred in the same time frame where we mapped active DNA demethylation of a non-replicating pCMV-GFP probe. Thus, Chapter 2 shows that drugs that function transiently and reversibly on chromatin, could also alter DNA methylation and cause widespread gene demethylation. This issue raises concerns about the safety of valproate for treating disease in humans.The fact that histone deacetylase inhibitors cause DNA demethylation leads to a model where the access of DNA demethylases to methylated CpGs is determined by the state of acetylation of the histones. In Chapter 3, I analyze the validity of this model by characterizing the time course of events leading from histone acetylation to DNA demethylation using a non-replicating pCMV-GFP probe, which measures active DNA demethylation. I found that histone acetylation precedes DNA demethylation. H3 trimethyl lysine 4 methylation, a marker of actively transcrib / L'épigénome est constitué de la chromatine, de protéines associées et de groupement méthyles liés de façon covalente à l'ADN qui en somment, régulent et maintiennent l'expression génique. Une particularité du génome des mammifères est la compartimentalisation de l'ADN en deux formes ; l'une dont la chromatine est compacte et inactive, qui est hyperméthylée, et l'autre dont la chromatine est ouverte et active, qui est hypométhylée. On a cru à l'origine que la méthylation de l'ADN était le facteur dominant qui déterminait la structure de la chromatine. Cependant, des données récentes suggèrent que cette structure puisse affecter l'ADN en déclenchant la méthylation ou la déméthylation de novo de l'ADN, impliquant l'existence d'un rapport bilatéral entre la structure de la chromatine et la méthylation de l'ADN.La présente thèse, étudie les mécanismes qui commandent l'interface entre l'activation de la chromatine et la déméthylation de l'ADN. Au deuxième chapitre, j'apporte en effet la preuve que le valproate, inhibiteur de l'histone déacétylase, induit la déméthylation de trois endogènes indépendants chez les cellules HEK 293 (un antigène du cancer et des testicules, un gène suppresseur de tumeur, et une metalloprotéinase de matrice.) Ces événements de déméthylation se produisent au même moment où nous avons aperçu une déméthylation active de l'ADN de la sonde non-répliquable pCMV-GFP. Ainsi, le chapitre deux prouve que les médicaments, qui fonctionnent de façon transitoire et réversible sur la chromatine, pourraient également changer la méthylation de l'ADN et causer une déméthylation disséminée des gènes. Cette question soulève des inquiétudes concernant la sûreté de ce médicament, le valproate, pour traiter les maladies chez l'homme.Le fait que les inhibiteurs d'histone déacétylase causent la déméthylation de l'ADN mène à un modèle où l'accès des déméthylases d'ADN à certains CpGs$

Pseudo vitamin D deficiency rickets (PDDR) appears to be due to a deficit in the mitochondrial cytochrome P450 enzyme, vitamin D 1alpha-hydroxylase (1alpha-OHase). The disease locus has been mapped to chromosome 12, position q14. Using a probe from the 24-hydroxylase cDNA, a kidney cDNA library was screened to identify the 1alpha-OHase cDNA-P19 cells transiently expressing the 1alpha-OHase cDNA were incubated with 25(OH)D3 and assayed for 1alpha,25(OH)2D3. These cells produced a metabolite that co-eluted on HMC with the 1alpha,25(OH)2D 3 standard. The production of authentic 1alpha,25(OH)2D 3 was confirmed using radioreceptor assay and mass spectrometry. The expression of the gene was analyzed by RT-PCR. It was shown to be increased by treatment with PTH and inhibited by treatment with 1alpha,25(OH) 2D3 thus confirming the hormonal regulation of 1alpha-OHase expression previously described. The availability of a cloned sequence for 1alpha-OHase generates novel tools for the study of the molecular etiology of PDDR.

Receptor tyrosine kinases (RTKs) mediate transduction of extracellular signals to the interior of the cell. The oncogenic variant of the Met RTK (Tpr-Met) transforms fibroblast cells. Multiple proteins involved in activating signal transduction pathways bind the Tpr-Met protein at a single highly phosphorylated tyrosine, tyrosine 489. This tyrosine residue is essential for Tpr-Met mediated transformation, implicating one or more of these substrates in this event. The specificity of the interaction between RTKs and their substrates is determined by amino acids surrounding the phosphotyrosine residue. To determine the role of each Tpr-Met substrate in cellular transformation, I have designed Tpr-Met mutants predicted to have a unique substrate binding specificity, by altering the three amino acids immediately downstream of tyrosine 489. My results show that the in vitro optimal binding motifs predicted for various substrates may not apply in vivo to Tpr-Met.

Our laboratory has produced six lines of mice harbouring the polyomavirus Large T-antigen (PVLT) transgene. Mice of all lines express PVLT in testis and three lines develop testicular adenomas. However, mice of a single line, designated MTPVLT-8, express PVLT exclusively in testis and cardiac tissue. These mice develop cardiac hypertrophy and die prematurely. We hypothesize that expression of PVLT in cardiac cells is a consequence of transgene integration near a cardiac specific enhancer element. To support this hypothesis, DNA flanking the transgene was isolated and tested for inclusion or any possible regulatory elements. A restriction map of genomic DNA surrounding the transgene integration site was constructed as a starting point. A lambda clone containing 5-10 Kb of the 5$ sp prime$ flanking DNA was isolated and used for a sequence of experiments. This DNA sequence did not cross-hybridize with DNA isolated from other species and appears to be mouse specific. Northern analysis demonstrate a sequence homology to a single RNA transcript appearing to be expressed in a wide variety of mouse tissues. A gene-bank comparison on a sequenced part of the clone resulted in an 89% sequence homology match with human gualadyn gene sequence. Although a regulatory element was not evident in the preliminary work, we are now in a position to attemp cloning various parts of the clone into expression vectors containing easily assayable reporter genes. Due to lack of appropriate cell lines, in vivo experimentation must be performed.