Mitochondria generate the majority of cellular energy through oxidative phosphorlyation. The machinery of oxidative phosphroylation consists of five enzyme complexes that are located in the inner mitochondrial membrane. A small number of essential subunits in these complexes are encoded by mtDNA and synthesized on a dedicated mitochondrial translation apparatus. Defects in mitochondrial translation system cause many mitochondrial diseases, but the mechanisms that regulate mitochondrial translation remain largely unknown. We have identified an unnamed human protein C7orf30, as a possible mitochondrial translation factor. The orthologue of C7orf30 in maize is thought to be a chloroplast ribosome assembly factor. We identified human C7orf30 to be a mitochondrial protein through bioinformatics analysis and immunocytochemistry. We knocked down the expression of C7orf30 in human fibroblast using shRNA and observed a reduction in cytochrome c oxidase activity. Using a translation assay, we observed a global reduction in the synthesis of mitochondrially encoded proteins when C7orf30 was knocked down, while the transcript levels were not affected. The assembly of Complex I, III, IV and V also demonstrated defects. Sucrose density gradient analysis suggests C7orf30 interacts with 39S subunit of the mitoribosome. The assembly of the mitoribosome and the levels of 12S and 16S MT-rRNA were not affected by C7orf30 knockdown, suggesting C7orf30 is not necessary for mitochondrial ribosome assembly. We hypothesize that C7orf30 interacts with the mitoribosome and is a regulator of mitochondrial translation. / Les mitochondries génèrent la majorité de l'énergie cellulaire grâce à l'oxydation phosphorylative. La chaîne respiratoire responsable de ce phénomène est composée de cinq complexes enzymatiques localisés dans la membrane interne de la mitochondrie. Certaines des sous-unités essentielles de ces complexes sont codées par l'ADN mitochondrial. Leur synthèse est assurée par la mitochondrie qui possède son propre système de traduction des protéines. Les déficiences de la traduction mitochondriale sont à l'origine de nombreuses maladies et les mécanismes qui régulent le processus de traduction restent à ce jour peu élucidés. Dans cette étude, nous avons identifié chez l'homme, C7orf30, une protéine probablement impliquée dans la régulation de la traduction mitochondriale. Il existe un homologue de cette protéine chez le maïs. Une étude suggère son rôle en tant que facteur d'assemblage des ribosomes des chloroplastes. Des programmes informatiques prédisent la localisation de la protéine C7orf30 humaine dans la mitochondrie ce que nous avons confirmé par des expériences d'immunocytochimie. L'utilisation de shRNA dirigés contre C7orf30 dans des fibroblastes humains révéle d'abord une réduction de l'activité cytochrome c oxydase (complexe IV). Des expériences de traduction ex vivo montrent ensuite une réduction globale de la synthèse des protéines codées par la mitochondrie dans les cellules déficitaires en C7orf30, la transcription étant normale. L'assemblage des complexes I, III, IV et V de la chaîne respiratoire est également affecté. La séparation des protéines par gradient de sucrose suggère que C7orf30 interagit avec la sous unité 39S des ribosomes mitochondriaux. Cependant, l'assemblage et les niveaux d'expression des rRNA 12S et 16S ne sont pas affectés par la diminution de la protéine ce qui suggère qu'elle n'est pas indispensable à l'assemblage des ribosomes mitochondriaux en soit. Dans cette étude, nous émettons l'hypothèse que C7orf30 est un composant du ribosome et agit comme un régulateur de la traduction mitochondriale.

Metastatic melanoma is a devastating and poorly understood disease that is extremely resistant to current approved therapeutic regimens. The earliest and most common observed genetic alteration encodes constitutively active BRAF-V600E (BRAFV600E) which promotes sustained activation of the BRAF-MEK-ERK MAP kinase signaling pathway. BRAFV600E is detected in 85% of human nevi and ~65% of metastatic melanomas. Progression from nevi to melanoma is thought to require the subsequent functional loss of at least one tumor suppressor gene, commonly PTEN. We have previously demonstrated that the concomitant activation of BRAFV600E and PTEN silencing led to the appearance of highly pigmented melanocytic skin lesions with histological features of melanoma. However, human tumors do not develop mutations simultaneously. Thus, to study melanoma progression in vivo, we will initiate BRAFV600E expression and PTEN silencing independently with Flp and Cre respectively. We have previously generated mice carrying a Flp-activated BRAFV600E allele (BRAFFA), which expresses normal BRAF prior to Flp-mediated recombination, at which point BRAFV600E is expressed. Similarly, we have a conditional PTEN allele that becomes inactivated upon Cre-mediated recombination.To separate BRAFV600E activation and PTEN silencing in vivo, I attempted to generate a transgenic mouse expressing inducible forms of Cre and Flp recombinases in a melanocyte-specific manner (pTyr:CreER and pTyr:FlpPR). The two constructs were co-integrated into the genome of C57BL/6 zygotes, generating five Tyr:FC founder strains. In vitro analysis of the constructs demonstrated melanocyte specificity and appropriate inducibility and specificity for recombination sequences. However, zero of five Tyr:FC strains demonstrated recombinase expression or function in vivo. The reason behind this lack of expression remains unknown but is most likely attributed to the co-injection technique, too few founder strains for analysis, or faults in the pTyr constructs. / Le mélanome est une maladie dévastatrice et excessivement résistante aux thérapies actuelles sur laquelle nos connaissances sont très limitées. Un des événements génétiques initiateurs de la maladie, qui est également le plus fréquemment observé, est une mutation qui encode une forme constitutivement active de BRAF-V600E (BRAFV600E), ce qui mène à une activation soutenue de la voie MAP kinase BRAF-MEK-ERK. BRAFV600E est détecté dans 85% des naevus et environ 65% des mélanomes métastatiques. On considère que la perte d'au moins un gène suppresseur de tumeur, par exemple PTEN, est nécessaire pour la progression d'un naevus à un mélanome. Nous avons précédemment démontré que l'activation de BRAFV600E couplée avec une perte d'expression de PTEN menait à l'apparition de lésions mélanocytiques hautement pigmentées avec certaines caractéristiques histologiques du mélanome. Par contre, les tumeurs humaines ne subissent pas de telles mutations de façon simultanée. Ainsi, pour étudier la progression du mélanome in vivo, nous allons initier l'expression de BRAFV600E et l'ablation de l'expression de PTEN de façon indépendante avec les recombinases Flp et Cre respectivement. Nous avons précédemment généré une souris portant un allèle de BRAFV600E activé par Flp ("Flp-activated", BRAFFA) qui exprime une version normale de BRAF au préalable et BRAFV600E après la recombinaison par la Flp. Nous avons également un allèle de PTEN qui est inactivé suite à la recombinaison par la recombinase Cre. Pour séparer l'activation de BRAFV600E et l'ablation de PTEN in vivo¸ j'ai tenté de générer une souris transgénique exprimant des formes inductibles des recombinases Cre et Flp spécifique aux mélanocytes (pTyr:CreER et pTyr:FlpPR). Les deux constructions ont été co-intégrées dans le génome de zygotes C57BL/6, ce qui a généré cinq lignées fondatrices. L'analyse in vitro a démontré que l'expression des constructions était spécifique aux mélanocytes et que l'induction des recombinases ainsi que leur spécificité pour les sites de recombinaison étaient appropriées. Par contre, l'expression ou l'activité de l'une ou l'autre des recombinases n'a été détectée dans aucune des cinq lignées Tyr:FC. La cause derrière cette absence d'expression reste inconnue mais elle est probablement attribuable à la technique de co-injection, le nombre limité de lignées fondatrices ou des défauts dans les constructions pTyr.

During embryogenesis, a number of key events regulate the correct patterning of an organism, one of them being the correct positioning of internal organs. One of the factors important for this process is the homeodomain transcription factor Pitx2c,which is asymmetrically expressed in the left lateral plate mesoderm. Previous work has shown that the N-terminal domain of Pitx2c is important for left-right patterning, in that overexpression of the N-terminus randomizes the direction of heart tube looping. It is believed that the overexpressed N-terminus is antagonizing the activity of endogenous Pitx2c by competing for binding to one or more critical interaction partners. In order to better understand the role of the N-terminal domain, I have performed two different yeast two-hybrid library screens to identify proteins that interact with this domain. In the first, I used the chick Pitx2c N-terminal domain, cloned into the pGBKT7 vector in-frame with the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor as bait, against a mouse adult cDNA library cloned in-frame with the GAL4 activation domain in the pGADT7 vector. In the second, I used a mouse Pitx2c N-terminal domain against an embryonic E11 mouse cDNA library. The resulting interacting candidates were analyzed and four were chosen based on the number of times they appeared in the screens and their function. The four chosen were Npc2, Ubc, Ube2n and Ube2e1. GST pull-down experiments were performed to confirm their interaction with the mouse and chick Pitx2c N-terminal domains, and proteins for the interacting candidates were generated using a coupled transcription translation system. Only Ube2n and Ube2e1 were confirmed as interacting candidates, suggesting that Pitx2 may be ubiquitinated and this may be a regulatory mechanism. Future experiments will provide more insight on their role in interacting to the N-terminal domain of Pitx2c. / Durant l'embryogenèse, un certain nombre d'événements clés réglementent la structuration correcte d'un organisme, l'un d'eux étant le positionnement correct des organes internes. Un des facteurs importants impliqué dans ce processus est le facteur de transcription homéodomaine Pitx2c, qui est asymétriquement exprimé dans le mésoderme de la plaque latérale gauche. Des études antérieures ont démontrées que le domaine N-terminal de Pitx2c est important pour la structuration gauche-droite, puisque la surexpression de l'extrémité N-terminale randomise la direction de la courbure du coeur. Nous croyons que la surexpression de la portion N-terminale de Pitx2c antagonise son activité endogène en faisant concurrence pour la liaison à un ou plusieurs partenaires d'interaction critique. Afin de mieux comprendre le rôle du domaine N-terminal de Pitx2c, j'ai effectué deux différentes sélections en utilisant la méthode de double hybride dans le but d'identifier les protéines qui interagissent avec ce domaine. Lors de la première sélection, j'ai utilisé le domaine N-terminal Pitx2c du poulet, cloné dans le vecteur pGBKT7 avec le domaine liant l'ADN du facteur de transcription GAL4 comme appât, contre une librairie adulte d'ADNc de souris avec le domaine d'activation GAL4 dans le vecteur pGADT7 comme proie. Dans la seconde, j'ai utilisé le domaine N-terminal Pitx2c de la souris contre une librairie d'ADNc d'embryon de souris E11. Les candidats qui interagissent ont été analysés et quatre ont été choisis en fonction du nombre de fois qu'ils apparaissent dans les sélections et selon leur function: Npc2, Ubc, Ube2n et Ube2e1. Des immunoprécipitations utilisant le glutathion-S-transférase comme étiquette ont été réalisées afin de confirmer l'interaction entre les partenaires potentiels et les domaines N-terminaux de Pitx2c de la souris et du poulet. Des protéines pour les candidats potentiels d'interactions avec Pitx2c ont été générées en utilisant un système de transcription-traduction. Ube2n et Ube2e1 sont les seuls candidats qui ont été confirmés comme protéines d'interaction, mettant en avant l'ubiquitination comme étant un mécanisme putatif par lequel Pitx2c agit dans la structuration gauche-droite durant le développement embryonnaire.

Oligodendrocyte differentiation is controlled by a complex network of epigenetic regulators, transcription factors, RNA binding proteins, and cell cycle regulators. The involvement of QKI, an RNA binding protein that regulates mRNA stability, splicing and transport, is only well characterized in rodent myelin development. QKI regulates oligodendrocyte differentiation by controlling in part the expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 (p27Kip1), a cell cycle inhibitor, and myelin basic protein (MBP), a major myelin component. In this thesis, we first show that human glial progenitor cells readily expressed QKI-6 and QKI-7 but not QKI-5. These cells increased the expression of all three major QKI isoforms as they commit to the OPC lineage and become mature oligodendrocytes. The ectopic QKI-6 and QKI-7 expression promoted human oligodendrocyte differentiation, while QKI-5 played a negative role in this process. Second, we show that protein arginine methyl transferase 5 (PRMT5), an enzyme known to symmetrically dimethylate both QKI and MBP in vitro, was up-regulated during myelin development and indeed methylated MBP in vivo. PRMT5 deficient oligodendrocytes demonstrated impaired differentiation, which was reflected by both the morphology and the transcription factor expression profile. Our findings implicate that QKI-6, QKI-7 and PRMT5 are promoters of oligodendrocyte differentiation, while QKI-5 is an inhibitor of the maturation process. / La différenciation d'oligodendrocyte est contrôlée par un réseau complexe de régulateurs épigéniques, de facteurs de transcription, de protéines de liaison à l'ARN ainsi que de régulateurs du cycle cellulaire. L'implication de QKI, une protéine de liaison à l'ARN qui régule la stabilité, l'épissage et le transport de l'ARNm, n'est que bien caractérisée dans le développement de la myéline chez les rongeurs. En régulant l'expression de p27Kip1, un inhibiteur du cycle cellulaire, ainsi que MBP, un composant majeur de la myéline, QKI-6 et QKI-7 stimulent tandis que QKI-5 réprime la différenciation d'oligodendrocytes. Nous avons démontré que les effets d'une expression exogène de QKI chez des oligodendrocytes humains sont consistants avec ceux observés chez les cellules des rongeurs. On a d'ailleurs établi que PRMT5, une enzyme capable de méthyler QKI ainsi que MBP in vitro, est régulée positivement pendant le développement de la myéline du SNC. De plus, nous avons confirmé que MBP est méthylé par PRMT5 in vivo. L'ablation de PRMT5 dans les oligodendrocytes résulte en une différenciation anormale, ainsi caractérisée morphologiquement et en étudiant le profil des facteurs de transcription. Prise ensemble, ces résultats suggèrent que PRMT5 est un promoteur de la différenciation d'oligodendrocytes.

Covalent histone modifications play an important role in the regulation of transcription in all eukaryotic organisms. Methylation of the histone H3 on lysine 4 (H3K4) is an ancient histone mark that is associated with active transcription and serves as a binding site for a number of transcriptional activators. Enzymes that catalyze this modification have been linked to a variety of human pathologies including cancer and mental retardation. The mechanisms that regulate formation of H3K4 methylation during transcription remain poorly understood. H3K4 methylation is intimately connected with ubiquitination of histone H2B (uH2B), another conserved modification found at actively transcribed genes. In all organisms studied, uH2B is a critical activator of H3K4 methylation, and in yeast uH2B is an absolute requirement for processive methylation at this site. The basis for this trans-histone "crosstalk" pathway remains controversial, with some studies suggesting a direct stimulation of methyltransferase activity by uH2B, and others suggesting indirect effects of uH2B on the assembly and stability of methyltransferase complexes.Using unique recombinant chromatin substrates containing semi-synthetic ubiquitinated H2B, I successfully reproduced the trans-histone crosstalk in vitro and showed a direct stimulation of the modified histone H2B on the activity of the native Set1C H3K4 methyltransferase complex purified from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. In my in vitro system, uH2B was an absolute requirement for methyltransferase activity on nucleosomal histone H3, and could also modulate activity on H3 outside the nucleosome, consistent with direct contact between uH2B and the Set1C. Finally, I showed that Set1C purified from strains of S.pombe deficient in H2B ubiquitination had apparently wild-type activity and subunit composition, suggesting that uH2B does not act by altering Set1C stability in this organism. Altogether, my data suggests that H2B ubiquitination can directly stimulate the catalytic activity of the Set1C and that this might represent a fundamental and evolutionary conserved mechanism underlying uH2B/H3K4 methylation crosstalk. / Les modifications covalentes des histones jouent un rôle très important dans la régulation de la transcription chez tous les eucaryotes. La méthylation de l'histone 3 sur la lysine 4 (H3K4) est une marque d'origine primitive associée avec une transcription active des gènes qui sert de plateforme d'attachement pour un nombre important d'activateurs de transcription. Les enzymes qui catalysent cette modification sont associées à une grande variété de pathologies humaines telles que le cancer et des formes de retard intellectuel. Les mécanismes qui régularisent la méthylation de H3K4 pendant la transcription ne sont pas bien établis et en général mal compris. La méthylation de H3K4 est intimement reliée à l'ubiquitination de l'histone H2B, une autre modification au niveau des histones très conservée et aussi impliquée dans l'activation de la transcription. Dans tous les organismes étudiés, H2B ubiquitiné (H2Bu) fut désigné comme étant un facteur crucial pour l'activation de la méthylation de H3K4 et constitue chez les levures, une nécessité absolue pour obtenir une réaction de méthylation efficace sur ce site. La mécanistique entourant la diaphonie entre ces histones est controversée; alors que certaines études laissent croire à une stimulation directe de l'activité de méthyltransferase par H2Bu, d'autres sous-entendent un effet indirect employé par H2Bu pour contrôler l'assemblage et la stabilité du complexe de méthyltransferase. En utilisant des substrats uniques de chromatine qui contenaient des histones H2Bu semi-synthétiques, j'ai réussi à reproduire la diaphonie entre H2Bu et H3K4 méthylé in vitro et démontré un effet direct exercé par H2Bu sur la stimulation de l'activité d'un complexe de méthyltransferase natif, Set1C qui fut purifié à partir de la levure de fission Schizosaccharomyces pombe. Dans ce système in vitro, H2Bu était nécessaire pour permettre la méthylation de H3 lorsque ce-dernier était intégré dans un nucléosome. De plus, la présence de H2Bu stimulait l'activité catalytique du complexe Set1C sur des histones H3 hors d'un contexte nucleosomal, ce qui s'accorde avec l'hypothèse d'un contact direct prenant place entre uH2B et Set1C. Finalement, j'ai observé que des complexes Set1C purifiés à partir de variétés de S. pombe déficientes en H2Bu démontraient une activité et une composition comparable à celle de complexes purifiées de variétés sauvages signifiant que l'effet de H2Bu sur Set1C in vivo n'est probablement pas dû à un changement au niveau de la stabilité du complexe dans cet organisme. En conclusion, ces résultats démontrent que l'ubiquitination de H2B peut stimuler l'activité catalytique de Set1C par des moyens directs qui pourraient représenter, d'un point de vue évolutif, un mécanisme fondamental et conservé qui participe à la diaphonie entre H2Bu et H3K4 méthylé.

The human myometrium is endowed with a vast array of receptors that transmit messages encoded in the external stimuli to the interior of the cell. These include the oxytocin receptor (OTR) and the beta2-adrenergic receptor (beta2AR), mediating uterine contractions and relaxation, respectively. These two receptors belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) and are important pharmacological targets because OTR antagonists and beta2AR agonists are used to control pre-term uterine contractions. Although they have opposing effects on the myometrium, both receptors activate the MAP kinases ERK1/2, which have been implicated in uterine contractions and the onset of labour. However, the precise mechanisms by which the OTR and the beta2AR activate ERK1/2 in a human myometrial cells remains to be characterized. Further, crosstalk between the beta2AR and OTR signalling has been shown in the myometrium, but it is unclear what mechanisms underlie such crosstalk. In the present study, we describe a novel molecular mechanism for beta2AR-mediated ERK1/2 activation in the human myometrial hTERT-C3 cell line, which involves the activation of a pathway involving Galphai-PI3kinase-PKCzeta and Src. We further show that this signalling cascade is dependent on the presence of the OTR. We also demonstrate physical interactions between OTR and beta2AR using co-immunoprecipitation, bioluminescence resonance energy transfer (BRET) and protein-fragment complementation (PCA) assays in HEK 293 cells. In the context of a receptor heterodimer, these interactions allow for allosteric control of one receptor partner by the other, shown here on the example of ERK1/2 activation in the hTERT-C3 cell line. This study illustrates the notion that formation of GPCR heterodimers can generate receptors with unique properties distinct from individual receptors. Understanding how dimerization is arranged and controlled and more importantly the resulting signalling and pharmacology of such complexes will be crucial for future drug design. / Les cellules du myomètre humain expriment une vaste gamme de récepteurs transmettant un signal amorcé par des stimuli externes à l'intérieur des cellules. Parmi ces récepteurs, certains jouent un role important dans la contraction utérine, entre autre les récepteurs beta2-adrénergiques (beta2AR) et les récepteurs de l'oxytocine (OTR). Ces deux récepteurs qui appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG), représentent des cibles pharmacologiques potentielles. Ceci est essentiellement basé sur le fait que des antagonistes d'OTR et des agonistes du beta2AR sont couramment utilisés pour réduire les contractions utérines en cas de risque d'accouchement prématuré. Malgré leurs effets opposés sur le myomètre, ces deux récepteurs activent les MAP kinases ERK1 et ERK2 qui jouent un rôle dans les contractions utérines. Les mécanismes exacts par lesquels ces deux récepteurs activent les MAP kinases demeurent mal définis. De plus, malgré le fait que des interactions entre les signaux mediés par les beta2AR et ceux initiés par les OTR ont été démontrés dans les cellules du myomètre, les mécanismes de ces interactions demeurent méconnus. La présente étude décrit un nouveau mécanisme d'interaction et explore une nouvelle voie de signalisation par laquelle les beta2AR activent la voie des MAP kinases ERK1/2 dans les lignée cellulaire hTERT-C3 du myomètre et impliquent une voie de signalisation Galphai-PI3kinase-PKCzeta et Src. De plus, nous démontrons que cette voie de signalisation nécessite la présence du OTR. Nous démontrons également une interaction physique entre l'OTR et les beta2AR dans les cellules HEK 293 par co-immunoprecipitation, essai de complémentation protéine-fragment (PCA) et grace à la technique de transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET). L'interaction entre l'OTR et le beta2AR, dans un contexte de récepteur hétérodimère, permet le control allostérique de l'activation de ERK1/2 dans les lignée cellulaire hTERT-C3. Cette étude illustre l'idée que la formation d'hétérodimères de RCPG pourrait générer des récepteurs ayant des propriétés uniques et distinctes des récepteurs individuels. La compréhension des mécanismes de contrôle de la dimérisation, et du rôle que ceux-ci pourrait jouer dans la signalisation cellulaire, sera important pour le développement des médicaments futurs.

Esophageal cancer (EC) is one of the world's deadliest malignancies. Despite technological advancements in surgery and other therapies, the 5-year survival rate is less than 30%. Due to the lack of reliable diagnostic markers, EC remains an aggressive disease capable of forming secondary tumours in many locations including lymph nodes (LNs). In fact, over 80% of esophageal cancer patients have LN metastasis and the presence of LN metastasis at surgery is one of the greatest predictors of poor survival outcome. The goal of this study was to identify genes associated with the metastatic dissemination of cancer cells from a primary tumour to a regional LN. This could help us understand the mechanisms of LN metastasis and potentially provide therapeutic targets to manage this deadly disease. Laser Capture Microdissection (LCM) was used to obtain pure populations of cancer cells in matched primary tumour and LN metastases from chemo and radiotherapy naïve patients with adenocarcinoma (ADC) of the esophagus. Differences in whole genome expression patterns between primary tumour and LNs were analyzed using cDNA microarrays. Genes involving TNF, NFKβ, Wnt pathways and those associated with immune response have been identified as potential key players in promoting metastasis. Many of these genes are primarily involved in cellular processes such as cellular proliferation, cell migration and cell adhesion. These finding suggest that LN metastasis in esophageal ADC may arise from changes in a cancer cell's ability to interact with new microenvironments and effectively deal with the host's immune system. / Le cancer de l'oesophage (CaO) est une des malignités les plus mortelles connues. Malgré de nombreux avancements de la médecine moderne dans les domaines de la chirurgie et autres thérapies, le pourcentage des gens survivant cinq ans est de moins de 30 %. En raison du manque de marqueurs de diagnostique fiables, le CaO reste une maladie agressive capable de causer la formation de tumeurs secondaires à plusieurs emplacements, dont les ganglions lymphatiques (GL). En fait, plus de 80 % des patients atteints de CaO présentent des tumeurs métastatiques au GL lors de la chirurgie, constituant un indice des plus déterminant dans un pronostique pessimiste. Le but de cette étude était d'identifier les gènes associés à la dissémination métastatique des cellules cancéreuses à partir d'une tumeur primaire vers un GL local. Cette identification des gènes déterminants pourrait s'avérer être cruciale dans la compréhension du mécanisme de métastase au niveau des GL et potentiellement aider à la mise sur pied de soins actifs plus efficaces dans le traitement de cette maladie dévastatrice. La Microdissection au Laser (ML) est utilisée pour l'obtention de populations pures de cellules cancéreuses. La ML est utilisée pour effectuer des prélèvements dans la tumeur primaire ou au niveau des métastases des GL à partir de patients avec adénocarcinome (ADC) de l'oesophage n'ayant pas reçu de chimio et radiothérapie. Les différences dans l'expression du génome entier entre la tumeur primaire et les GL ont été analysées à l'aide d'une puce à ADN microarray. Les gènes incluant les voies métaboliques TNF, NFKβ,Wnt et celles associées avec une réaction immunitaire ont été identifiés en tant que joueurs clés provoquant la métastase. Plusieurs de ces gènes sont impliqués dans les procédés cellulaires tels la prolifération, migration et adhésion cellulaire. Ces constatations suggèrent que les métastases aux GL dans les ADC oesophagiens surviendraient suite à des changements au niveau de l'habileté d'une cellule cancéreuse à interagir avec de nouveaux microenvironnements et efficacement trafiquer le système immunitaire de l'hôte.

Posttranslational attachment of ubiquitin (Ub) or poly-Ub chains marks proteins for various cellular fates and functions, including proteasomal degradation, endocytosis, endosomal sorting, and DNA repair. In general, three enzymes catalyze the ubiquitination reaction: activating enzyme (E1), conjugating enzyme (E2), specificity-determining Ub-protein ligase (E3). This thesis examines three distinct aspects of the ubiquitination of proteins.The recognition of substrates by UBR1 and UBR2 proteins: UBR proteins are E3-ligases that recognize certain N-terminal residues (N-degrons) as signals for protein degradation. For this reason, they are called N-recognins. N-recognition follows a turnover rule known as the N-end rule. Using X-ray crystallography, we determined the structure of the substrate-recognition domain of the UBR1 and UBR2 proteins with a bound ligand. These structures showed that the domain adopts a novel fold stabilized through the binding of three zinc ions and forms a binding pocket for N-degrons. Additionally, biochemical affinity measurements established the molecular principles for the recognition of positively charged N-degrons. The elucidation of the ubr-box structure in complex with a type-1 N-degron pioneered the understanding of N-end rule substrate recognition.Substrate binding and ubiquitination by UBR5 protein: UBR5 is an E3 Ub ligase containing a catalytic HECT domain and a peptide-binding domain. The peptide-binding MLLE domain recruits different regulatory proteins through a 12-residue peptide motif, termed PAM2. Using pull-down and ubiquitination assays, we demonstrated that the HECT domain interacts with the adjacent MLLE domain in a PAM2 dependent manner. This interaction modulates binding and ubiquitination of TopBP1, a substrate of UBR5. These results provided a new view on how different domains in UBR5 proteins work together for efficient substrate recognition and ubiquitination. The recognition of Ub or poly-Ub chains by the UBA domain of Swa2 protein: Ub-associated (UBA) domains are ∼40 amino acid motifs occurring in proteins associated with ubiquitination. Most UBA domains bind to mono-Ub as well as poly-Ub. A structural model of the Swa2p UBA domain in complex with Ub showed that Ub recognition occurs predominantly through an atypical interaction through helix α1 of the UBA. Mutagenesis and surface plasmon resonance revealed a second low-affinity Ub-binding site and preference of Swa2p UBA for poly-Ub binding. These results revealed a potential role of Swa2p UBA domain in binding poly-ubiquitinated proteins in vivo, and the UBA domains as communication elements in the Ub system.This thesis provides a better understanding of the mechanisms that the Ub pathway employs to assure selectivity and processivity at three different levels: substrate recognition by the N-end rule, substrate binding and ubiquitination by an E3 ligase, and the recognition of Ub species by UBA domains. / Les modifications post-traductionnelles des protéines par une molécule d'ubiquitine (Ub) ou par des chaînes de poly-Ub déterminent leur destin pour diverses fonctions cellulaires notamment la dégradation à travers le protéosome, l'endocytose, le tri endosomique ainsi que la réparation de l'ADN. De façon générale, trois enzymes catalysent une réaction d'ubiquitination: une enzyme d'activation (Ub-activating enzyme E1), une enzyme de conjugaison (Ub-conjugating enzyme E2), et une enzyme qui détermine la spécificité pour le substrat (specificity-determining Ub-protein ligase E3). Cette thèse porte sur trois aspects distincts impliqués dans le processus d'ubiquitination des protéines:La reconnaissance de substrats par les protéines UBR1 et UBR2: les Ub-recognins (UBR) sont des ligases E3 qui reconnaissent des résidus N-terminaux (N-degrons) comme signaux pour la dégradation des protéines. Cette reconnaissance suit une règle de rotation du nombre d'entités ciblées nommée N-end rule (règle du N-terminus). A l'aide de données de cristallographie aux rayons X, nous avons déterminé la structure du domaine UBR-box impliqué dans la reconnaissance du substrat des protéines UBR1 et UBR2 en complexe avec un N-degron. Ces structures montrent que le domaine UBR-box adopte un nouveau repliement stabilisé par trois ions zinc et qu'il forme une poche pour accueillir les N-degrons. Aussi, des mesures biochimiques d'affinité ont permis d'établir des principes moléculaires pour la reconnaissance des N-degrons qui sont chargés positivement.La fixation du substrat et son ubiquitination par la protéine UBR5: UBR5 est une Ub ligase E3 contenant un domaine catalytique HECT et un domaine de liaison peptidique, MLLE. Le domaine MLLE recrute plusieurs protéines régulatrices grâce à leur motif PAM2 composé de douze résidus. En procédant à des expériences de pull-down et à des essais d'ubiquitination, nous avons démontré que le domaine HECT interagissait avec le domaine MLLE adjacent de manière dépendante du motif PAM2. Cette interaction conduit à des changements conformationnels qui modulent le repliement et l'ubiquitination de TopBP1, un substrat d'UBR5.La reconnaissance d'Ubiquitine et de chaînes poly-Ub par le domaine UBA de la protéine Swa2: les domaines UBA (Ub-associated) sont composés d'environ quarante acides aminés présents dans des protéines associées à l'ubiquitination. Les domaines UBA se lient à des mono-Ub in vitro, mais semblent avoir une affinité supérieure pour les chaînes de poly-Ub. Un modèle structurel du domaine UBA de la protéine Swa2p en complexe avec une Ub montre que la reconnaissance de l'Ub se produit principalement par une interaction atypique grâce à l'hélice α1 du domaine UBA. Des essais de résonance plasmonique de surface combinés à de la mutagenèse ont révélé une faible affinité secondaire pour le site de liaison à l'Ub et une préférence de l'UBA de Swa2p pour la liaison aux poly-Ub. Ces résultats ont révélé un rôle potentiel du domaine UBA de Swa2p pour lier les protéines poly-ubiquitinylées in vivo.À trois niveaux différents, la reconnaissance du substrat par le règle N-fin, fixation du substrat et l'ubiquitination par une ligase E3, et la reconnaissance des espèces de l'ubiquitine par domaines UBA, cette thèse a fournir une meilleure compréhension du mécanisme qui la voie Ub emploie pour assurer la sélectivité et la processivité de garder le bon environnement homéostatique dans la cellule.

Transforming growth factor-beta (TGF-beta) plays an important role in breast cancer progression as a pro-metastatic factor, notably through enhancement of cell migration. It is becoming clear that micro-RNAs (miRNAs), a new class of small regulatory molecules, act downstream of TGF-beta at several steps of cancer progression. We report here the down-regulation of miR-584 by TGF-beta in a panel of breast cancer cell lines. We found this regulation to be required for TGF-beta-mediated cell migration. Moreover, we determined that the protein phosphatase and actin regulator 1 (PHACTR1), an actin-binding protein, was positively regulated by TGF-beta and inhibited by miR-584. The presence of PHACTR1 was required for TGF-beta to promote the migration of invasive breast cancer cells. Finally, both the over-expression of miR-584 and the knock-down of PHACTR1 resulted in a major re-organization of the actin cytoskeleton. We thus propose a mechanism whereby TGF-beta silences the expression of miR-584 to enhance this of PHACTR1, resulting in a re-arrangement of actin that leads to promotion of breast cancer cell migration. / Le TGF-beta jour un rôle important dans la progression du cancer du sein en tant que facteur pro-métastatique, notamment en promouvant la migration des cellules cancéreuses. Il devient évident qu'une nouvelle classe de molécules, les micro-ARNs, agit en aval du TGF-beta dans plusieurs étapes de la progression cancéreuse. Dans ce manuscrit, nous rapportons la régulation négative du miR-584 exercée par le TGF-beta, et ceci, dans des cellules provenant de plusieurs lignées. De plus, nous avons déterminé que la protéine PHACTR1, qui contient plusieurs sites se liant à l'actine, était positivement régulée par le TGF-beta et que son expression était inhibée par le miR-584. Nous avons observé que la présence de PHACTR1 était requise pour que le TGF-beta puisse promouvoir la migration des cellules cancéreuses du sein. Finalement, nous avons observé une réorganisation majeure du cytosquelette d'actine en sur-exprimant le miR-584 avec un mimique, ainsi qu'en inhibant l'expression de PHACTR1 à l'aide d'un ARN antisens. Nous proposons donc un mécanisme de migration cellulaire où le TGF-beta inhibe l'expression du miR-584, ce qui a pour conséquence d'augmenter l'expression de PHACTR1, cela résultant à une réorganisation du cytosquelette d'actine dans le but de promouvoir la migration.

Second mitochondrial-derived activator of caspases (Smac), also known as direct IAP-binding protein with low pI (DIABLO) is known as a proapoptotic protein that inhibits the inhibitors of apoptosis family (IAPs). The members of the IAP family were characterized by their ability to inhibit proapoptotic caspases. More recently, the IAPs have also been shown to play major roles in regulating diverse signalling events within the cell. A physiological role for Smac remains elusive, but studies have focused primarily on its roles in regulating the IAPs in the context of apoptosis. In order to critically evaluate possible physiological roles for Smac, we sought to examine non-apoptotic signalling events regulated by the IAPs, including NF-κB induction, mitochondrial antiviral (MAVS) signalling, and necroptosis. While Smac knockdown revealed no obvious roles for Smac in context of MAVS signalling or NF-κB induction, we found that Smac contributes to necroptosis induction in L929 cells. While we hypothesized that Smac null mice would be protected from necroptosis induced by experimental colitis, we unexpectedly found that colitis was more severe in Smac null mice than in wild-type mice. Further investigation of how Smac is involved in the reaction to induced colitis might reveal a physiological role for Smac. / "Second mitochondrial-derived activator of caspases" (Smac), aussi connu sous le nom de DIABLO pour "direct IAP-binding protein with low pI", est une protéine proapoptotique qui effectue son rôle en interagissant avec et inhibant l'action des membres de la famille des inhibiteurs d'apoptose (IAP). Les membres de la famille des IAP ont été caractérisés par leur capacité d'inhiber l'action des caspases proapoptotiques prévenant ainsi l'apoptose cellulaire. Les IAP sont aussi engagés dans diverses autres voies de signalisation, hormis leur rôle dans la régulation de l'apoptose. L'effet de Smac sur les IAP a été étudié dans le contexte de l'apoptose cellulaire et aucun autre rôle physiologique ne lui a été attribué jusqu'à nos jours. Afin d'évaluer diverses possibilités de rôles physiologiques pour Smac, nous désirions examiner les voies de signalisation non-apoptotiques régulées par les IAP, incluant l'induction de NF-κB, la signalisation antivirale mitochondriale (MAVS) ainsi que la nécroptose.Nos résultats révèlent que la sous expression de Smac n'affecte pas l'induction de NF-κB et n'interfère pas avec la voie de signalisation engagée par les MAVS. Par contre Smac induit la mort des cellules L929 par nécroptose.Pour examiner l'effet de Smac in vivo nous avons étudié son rôle dans un modèle de colite expérimentale. Nos résultats révèlent que les souris mutantes rendues nulles pour le gène Smac présentent une colite plus sévère que les souris à phénotype sauvage. Il serait ainsi nécessaire d'examiner de plus près la régulation de Smac dans le modèle de colite expérimentale pour essayer de mieux comprendre son rôle physiologique.