Products excreted or secreted (ES) by parasitic nematodes may contribute to the processes of infection and tissue migration of the parasite, modulating the host immune response and host physiology. These ES products allow the parasite to persist and survive in conditions that would otherwise bar or destroy them. cDNAs encoding three known secreted proteins of Brugia malayi was cloned for expression in E. coli and subsequent protein purification. These proteins were chosen because they have been reported to be secreted and to play roles in immune evasion. These proteins include: macrophage inhibitory factor 1 (MIF-1), a tumor protein homologue (TPH-1) and a cysteine protease inhibitor (CPI-2). Antibodies were raised to all of these secreted proteins. The secreted protein CPI-2 was localized to a specific region of microfilariae of B. malayi and the basic anatomy of this parasitic stage was observed by means of confocal microscopy. The protein was found to be localized to the secretory pore, which appears to be regulated by musculature. Biotinylated Sandwich ELISAS were developed to detect these secreted proteins in cultures of two stages and both sexes of B. malayi. / Les produits sécrétés ou excrétés de nématodes parasitiques pourraient contribuer aux processus d`infection et de migration dans les tissues, tout en modulant le système immunitoire et la physiologie de l`hôte. Ces produits permettent au parasite de survivre dans des conditions infavorables. Trois protéines sécrétées du nématode parasitique Brugia malayi ont été clonées et produites dans du E.coli. Celles-ci ont ensuite été purifiées. Ces protéines se trouvent à être: la macrophage inhibitory factor 1 (MIF-1), la tumor protein homologue (TPH-1) et la cysteine protease inhibitor (CPI-2). CPI-2 a été localisée dans une région délimitée de la microfilaria du B.malayi et l`anatomie de ce stage parasitaire a été observé à l`aide de la microscopie confocale. La région délimitée où cette protéine est sécrétée se trouve à être le pore sécrétoire. Le pouvoir sécrétoire de ce pore semble être contrôlé par la musculature du nématode. Des ELISAs Sandwich Biotinylés ont été développés pour détecter la présence de MIF-1, TPH-1 et CPI-2 dans les différents stages de développement du B.malayi et dans les deux sexes de ce nématode.

Relatively little is known about the molecular mechanisms displayed by parasitic nematodes to infect a host; however, it has been generally recognized that successful parasitic nematode infections rely on their ability to release a variety of products commonly named Excretory-Secretory Products (ESP). To gain a deeper understanding of the mechanisms that lead to the establishment of filarial nematode infections, we collected and analyzed through 1D-SDS PAGE and LC-MS/MS the ESP of Brugia malayi adult females, adult males and microfilariae, one of the etiological agents of human lymphatic filariasis. 228 proteins were identified through this approach, including several proteins with potential immunoregulatory properties. Subsequent work using an immunohistochemical approach allowed for the definition of 3 anatomical expression patterns in B. malayi microfilariae for a representative group of 5 ESP. All of these patterns involved localization in the microfilarial Excretory-Secretory apparatus, a specialized anatomical feature involved in protein release that in this life stage was found to be associated to a muscle structure. Glutamate-gated chloride channels (GluCls), the main target of the antiparasitic drug ivermectin (IVM), were also located at this structure, suggesting that protein release from the Excretory-Secretory apparatus is enhanced by neuromuscular activity regulated by GluCls. Consistent with these observations, a marked reduction in protein release by microfilariae upon in vitro IVM exposure was shown. It is proposed that under in vivo conditions, the rapid microfilarial clearance induced by IVM treatment is the result of the suppression of the parasite's ability to secrete proteins that enable evasion of the host immune system. Finally, it is anticipated that elucidation of specific features associated with each of the different parasitic nematode lifestyles would require the comparison of ESP composition from several nematode species. To overcome the limitations associated with the lack of sequence information in most nematode species required for the database searching strategy in MS-based proteomic analysis, the use of transcriptomic next-generation sequencing (RNA-seq) de novo assemblies is explored to identify the ESP composition of the mouse gastrointestinal (GI) parasitic nematode Heligmosomoides polygyrus. 209 proteins were identified using this strategy. The list also includes proteins with potential involvement in immunoregulation, modulation of signalling pathways and nutrient transport and/or uptake. The results presented here are useful to understand the roles of proteins released by filarial and GI nematodes in immune evasion events and other aspects of the host-parasite relationship. / Les mécanismes moléculaires déployés par les parasites pour s'établir dans leur hôtes sont relativement méconnus; néanmoins, il est généralement accepté que le succès des infections par les nématodes parasitaires dépend de leur capacité à libérer une variété de produits dénommés produits d'excrétion-sécrétion (PES). Afin d'acquérir une meilleure connaissance des mécanismes qui conduisent à l'établissement d'infections de nématodes filaires, nous avons recueilli et analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (1D-SDS-PAGE) et par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de mases ( LC-MS/MS) les PES des adultes mâles et femelles et des microfilaires de Brugia malayi, l'un des agents étiologique de la filariose lymphatique humaine. Grâce à cette approche, 228 protéines ont été identifiées, incluant plusieurs protéines possédant potentiellement des propriétés immunorégulatrices. Des travaux ultérieurs utilisant une approche immunohistochimique ont permis de définir trois profils d'expression anatomique pour un groupe représentatif de 5 PES chez les microfilaires de B. malayi. Pour tous ces profils, les protéines ont été localisées au niveau de l'appareil d'excrétion-sécrétion des microfilaires. Cette structure anatomique spécialisée est impliquée dans la libération de protéines et, chez ce stade de développement du parasite, elle est associée à une structure musculaire. Nous avons aussi montré que les canaux chloriques glutamate-dépendants (GluCls), la cible principale du médicament antiparasitaire ivermectine (IVM), étaient également localisés dans cette structure, ce qui suggère que la libération de protéines par l'appareil d'excrétion-sécrétion est renforcée par l'activité neuromusculaire régulée par des GluCls. Ces résultats concordent avec l'observation in vitro d'une réduction marquée de la libération de protéines par les microfilaires exposés à l'IVM. Il est proposé que, dans des conditions in vivo, l'élimination rapide des microfilaires induite par traitement avec l'IVM est causée par la suppression de la capacité du parasite à sécréter des protéines lui permettant d'évader le système immunitaire de l'hôte. Finalement, il est prévu que l'élucidation des caractéristiques spécifiques associées à chacun des différents modes de vie des nématodes parasitaires requerrait la comparaison de la composition des PES de plusieurs espèces de nématodes. Ces comparaisons, qui requièrent l'emploi d'une stratégie de recherche des résultats des MS générés lors des analyses protéomiques sur des banques de données des protéines, sont fortement limitées par l'absence d'information sur les séquences pour la plupart des espèces de nématodes. Pour contourner ces limitations, nous avons essayé l'utilisation des assemblages de novo du séquençage transcriptomique de nouvelle génération (RNA-seq) afin d'identifier la composition des PES du nématode gastrointestinal (GI) chez la souris Heligmosomoides polygyrus. 209 protéines ont été identifiées en utilisant cette stratégie. La liste comprend aussi des protéines ayant une implication potentielle dans l'immunorégulation, la modulation des voies de signalisation et le transport et/ou l'absorption de nutriments. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de mieux comprendre le rôle des protéines libérées par des nématodes filaires et GI dans les événements d'évasion immunitaire et dans d'autres aspects de la relation hôte-parasite.

Soil-transmitted helminths are parasitic worms of humans, causing many disabilities in tropical parts of the developing world. Control programs such as "The Focussing Resources on Effective School Health” (FRESH) Partnership have been implemented to remove human soil transmitted nematodes through large-scale use of benzimidazole anthelmintic drugs for school-aged children in developing countries. The benzimidazole drugs, albendazole and mebendazole are used as a single annual dose in areas where the burden is high. Unfortunately, there is concern that increased use of anthelmintics in children could select for resistant populations of these human parasites. In filarial nematodes, a single amino acid substitution from phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), known to be associated with benzimidazole resistance in other nematodes, has been found in parasite ß-tubulin at position 200. We have developed pyrosequencer assays for the codon 200 in Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, and the hookworm Necator americanus to screen for this single nucleotide polymorphism (SNP). Assays for this resistance-associated SNP could be useful for monitoring for anthelmintic resistance in control programs. These assays have been tested on adult worms from a benzimidazle-naïve population in Kenya. Following this, these assays have been applied on individual worms, pooled eggs and pooled larvae from people in East Africa, the Caribbean and Central America where mass drug anthelmintic programs have been implemented. The 200Tyr SNP was detected in T. trichiura from non-treated people and in T. trichiura and N. americanus from benzimidazole-treated people. / Les géo-helminthes sont des vers parasitant l'Homme et causant de nombreux handicaps dans les régions tropicales des pays en voie de développement. Des programmes de contrôles tels que le partenariat FRESH : ''Focussing Resources on Effective School Health'' ont été mis en place afin d'éliminer les géo-helminthes en administrant massivement en milieu scolaire des pays en voie de développement des medicaments anthelmintiques. L'albendazole et le mébendazole appartiennent au groupe des benzimidazoles et sont distribués dans les régions grandement infestées. Cependant, cette attribution massive de médicaments, aux enfants, pourrait entraîner une sélection de parasites résistants aux anthelmintiques. La substitution de l'acide aminé phénylalanine (Phe) par la tyrosine (Tyr) connue pour être associée à la résistance aux benzimidazoles chez les nématodes a été identifiée chez les filaires à la position 200 du gène de la ß-tubuline. Nous avons développés des tests pour les parasites Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides et Necator americanus en utilisant la méthode du pyroséquençage afin de détecter le polymorphisme d'un unique nucleotide (SNP) au niveau du codon 200 du gène de la ß-tubuline. Ce test a été appliqué sur des vers adultes provenant d'individus du Kenya n'ayant jamais été traités par des anthelmintiques. Puis ce même test a été appliqué à des vers adultes individuels, à des pools d'œufs et de larves provenant d'individus d'Afrique de l'est, des Caraïbes et d'Amérique centrale, où les programmes de contrôles de masse sont implantés. Le SNP fût détecté chez T. trichiura provenant d'individus non-traités aux benzimidazoles ainsi que chez T. trichiura et N. ameri

The Leishmania peroxin 7 (LmPEX7 or LdPEX7) is the receptor that translocates PTS2 signal-containing proteins into the glycosome. This microbody is unique to and crucial for the survival of trypanosomatids which include Leishmania and Trypanosoma, the causative agents of leishmaniasis and African sleeping sickness, respectively. Proteins are imported into the glycosome via two pathways, PTS1 and PTS2, which involves the formation of a PTS-receptor complex in the cytosol, docking of the complex on a translocation apparatus on the glycosomal membrane, and subsequent release of the cargo protein into the lumen. However, the precise steps in glycosome protein trafficking are not well-defined and to understand the function of these organelles and prove their potential as chemotherapeutic targets, the mechanism of glycosome biogenesis needs to be fully elucidated. Not much is known about the mechanism of PTS2 import pathway in glycosomes as studies on PEX7 have been hampered by the difficulty in expressing a soluble recombinant form of this receptor. To dissect the PTS2 import pathway and to determine the role of PEX7 in Leishmania, this protein was cloned and characterized. LmPEX7 is a ~41 kDa protein containing six conserved WD40 motifs that displays limited sequence similarity to PEX7 homologues involved in the biogenesis of evolutionarily-related peroxisomes found in other eukaryotes. LmPEX7 interacts with PTS2 proteins, the PTS1 receptor LdPEX5, and the membrane-associated docking protein LdPEX14. These interactions, characterized through various biochemical techniques, were mediated by specific binding domains, formation of stable protein-protein complexes, and conform / La péroxine Leishmania 7 (LmPEX7 ou LdPEX7) est un récepteur qui transloque les protéines qui contiennent le signal PTS2 dans le glycosome. Ce glycosome est unique et critique aux trypanosomes, tels que Leishmania et Trypanosoma, les agents causant la leishmaniose et la maladie Africaine du sommeil. Les protéines sont importées vers le glycosome par deux voies, PTS1 et PTS2, qui nécessitent la formation d'un complexe PTS dans le cytosol, l'amarrage du complexe sur un appareil de translocation sur la membrane du glycosome, et permet la liberation de la charge protéique dans le lumen. Par contre, les étapes précises dans l'acheminement de protéines glycosomales ne sont pas bien définies et pour comprendre les fonctions de ces organelles et prouver qu'elles être des cibles chimiothérapiques, les mécanismes impliqués dans la biogenèse doivent être très bien élucidés. Pour disséquer le mécanisme d'importation et pour déterminer le rôle de PEX7 chez Leishmania, cette protéine a été clonée à partir de l'ADN génomique de L. major et a été caractérisée. LmPEX7 est une protéine d'environ 41 kDa qui démontre une homologie limitée aux PEX7 impliqués dans la biogenèse des peroxysomes chez autres eucaryotes. LmPEX7 interagit avec les protéines PTS2, le récepteur PTS1 LdPEX5, ainsi que la protéine LdPEX14 qui est associée à la membrane du glycosome. Ces intéractions, décrites en utilisant des techniques biochimiques variées, sont arbitrés par des domaines d'interactions situés sur LdPEX5 et LdPEX14, la formation de complexes protéiques stables, et associée à divers changements conformationnels. Des études de localisation subcellula

Parasites of the genus Leishmania are able to secure their survival and propagation within their host by altering key signalling pathways involved in the ability of macrophages (MØs) to directly kill pathogens or to activate cells of the adaptive immune system. One important step in this immune evasion process is the Leishmania-induced activation of host protein tyrosine phosphatase SHP-1. SHP-1 has been shown to directly inactivate JAK2 and Erk1/2, and to play a role in the negative regulation of several transcription factors involved in MØ activation such as: NF-B, STAT-1α, and AP-1. These signalling alterations contribute to the inactivation of critical MØ functions such as the production of IFN-γ-induced nitric oxide (NO), a free radical associated with parasite killing and clearance. In addition to interfering with IFN-γ receptor signalling, Leishmania is able to alter several LPS-mediated responses (e.g. IL-12, TNF-α, NO production) through mechanisms not yet fully understood. A main goal of this study was to better understand the mechanisms used by the parasite to block Toll-like receptor (TLR)-mediated functions. Experiments performed revealed a pivotal role for SHP-1 in the inhibition of TLR-induced MØ activation through binding to and inactivating IL-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK-1). We identified the binding site as an evolutionarily conserved ITIM-like motif, which we named kinase tyrosine-based inhibitory motif (KTIM). Further experiments and sequence analysis revealed that several cytosolic kinases other than IRAK-1 possess potential KTIMs, suggesting it could represent a regulatory mechanism widely used by kinases. The final experimental section aimed to explore the differential ability of the two different stages of Leishmania, promastigotes and amastigotes, to alter MØ signalling and function. In conclusion, this work uncovers a new mechanism whereby Leishmania is able / Les parasites du genre Leishmania assurent leur survie et leur propagation par l'altération de voies de signalisation impliquées dans la capacité des macrophages (MØs) à détruire directement les pathogènes ou à activer les cellules du système immunitaire acquis. Une étape critique de ce mécanisme d'inactivation est l'activation par Leishmania de la protéine phosphatase SHP-1 de la cellule hôte. Il a été démontré que la protéine SHP-1 peut inactiver directement JAK2 ainsi que Erk1/2 et joue un rôle dans la régulation négative de plusieurs facteurs de transcription, tels que NF-κB, STAT-1α et AP-1, impliqués dans l'activation des MØs. L'altération de ces voies de signalisation contribue à l'inactivation de fonctions critiques des MØs telle que la production d'oxyde nitrique (NO) induite par l'IFN-γ, un radical-libre impliqué dans l'anéantissement du parasite. En plus d'inhiber les fonctions engendrées par l'IFN-γ, Leishmania est capable d'inhiber de nombreuses fonctions induites par le LPS, incluant la production d'IL-12, de TNF-α et de NO, et cela par des mécanismes encore peu compris. Le but principal de cette étude était de mieux comprendre les stratégies employées par le parasite afin d'inhiber les fonctions induites par les Toll-like receptors (TLRs). Nos résultats révèlent le rôle critique de SHP-1 dans l'inhibition de l'activation des MØs induite par les TLRs, par l'interaction et l'inactivation de la kinase 1 associée au récepteur IL-1 (IRAK-1). Nous avons également identifié le site de liaison qui semble être un motif conservé lors de l'évolution ressemblant à un ITIM, que nous avons nommé motif de kinase à base de tyrosine inhibiteur (KTIM). Des expériences supplémentaires et l'analyse de séquences ont révélées que plusieurs autres kinases cytosoliques autres qu'IRAK-1 possèdent un motif potentiel KTIMs, suggérant que le KTIM pourrait$

The trypanosomatid parasite Leishmania infects 12 million people in tropical countries. This neglected tropical disease causes debilitating and often fatal consequences in the absence of chemotherapeutic intervention. Consequently, there is a need to identify new drug targets to combat the increasing incidence of resistance to current treatments. An attractive drug target in these parasites is the glycosome, a unique microbody organelle that compartmentalizes several essential enzymatic pathways behind an impermeable membrane. The Leishmania major Peroxin 7 (LPEX7) is a receptor protein that recognizes glycosomal matrix proteins containing an N-terminal peroxisomal targeting signal 2 (PTS2) and facilitates the trafficking of these proteins across the glycosomal membrane. Genetic studies in the related trypanosomatid parasite, Trypanosoma brucei, have demonstrated that PEX7 is essential for parasite viability. LPEX7 is predicted to have a hydrophobic outer surface which has made production of this recombinant protein in the E. coli heterologous system challenging. LPEX7 was successfully purified in the presence of non-ionic detergents, however, this limited the usefulness of this protein in regards to downstream in vitro studies with glycosomal membranes. To investigate the biophysical role of LPEX7 in the trafficking and import of proteins into the glycosome, we have developed a strategy to reliably express and purify recombinant Leishmania PEX7 in the absence of detergents. Subsequent biochemical studies confirmed that the recombinant LPEX7 was functionally active and, like the native protein or detergent purified protein, binds LdPEX5 and PTS2 cargo proteins with nanomolar affinities. Initial investigations of the quaternary structure demonstrated that LPEX7 is in equilibrium between a dimer and tetramer in solution. Preliminary protein-protein interaction domain mapping studies have demonstrated that the C-terminal half LPEX7 was sufficient to bind both LdPEX14 and LdPEX5. / Le parasite trypanosomatide Leishmania affecte plus de 12 millions d'individus dans les pays tropicaux. Cette maladie tropicale négligée a de graves conséquences, parfois fatales, en absence d'interventions thérapeutiques. Il y a, par conséquent, urgence d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre ce fléau et restreindre l'incidence de résistance envers les médicaments présentement employés. Une cible thérapeutique de choix s'est révélée récemment dans cette famille de parasite. Il s'agit du glycosome, un organelle qui compartimente plusieurs voies métaboliques derrière une membrane imperméable. La Péroxine 7 de Leishmania major (LPEX7) est un récepteur cytosolique qui reconnaît certaines protéines destinées pour le glycosome contenant un signal peptidique de type 2 (PTS-2) à leur terminal N et qui facilite le transport vers la membrane du glycosome. Récemment, des études génétiques sur le parasite trypanosomatide Trypanosoma brucei ont démontré que PEX7 est essentiel pour la survie du parasite. Des prédictions bio-informatiques révèlent que LPEX7 contient une surface extérieure hydrophobe, ce qui explique le défi que représente la production de cette protéine de façon recombinante dans le système E. coli. LPEX7 fut purifiée avec succès en présence de détergents ioniques, ce qui a toutefois limité les possibilités d'études d'interactions avec des membranes. Dans le but d'étudier le rôle biophysique de LPEX7 dans le transport et l'importation de protéines vers le glycosome, nous avons développé une stratégie pour exprimer et purifier LPEX7 de façon recombinante en l'absence de détergents. Ensuite, nos études biochimiques ont confirmé que LPEX7 recombinante est active et, tout comme LPEX7 précédemment purifiée avec l'aide de détergents, est capable de lier les protéines contenant un signal PTS-2 et LdPEX5 à des concentrations nano-molaires. Une investigation de la structure quaternaire de LPEX7 a révélé que le récepteur s'assemble en dimères et tétramères en solution. Finalement, des études préliminaires d'interaction protéine-protéine ont illustré que LPEX7 contient un site d'attachement pour LdPEX5 et LdPEX14 sur la demie portion terminale C.

Schistosomiasis is one of the most socioeconomically important parasitic diseases, affecting over 200 million people worldwide. Praziquantel is the only drug treatment available in most parts of the world and there is an urgent need to find a viable alternative to this drug. Acetylcholine-gated ion channels of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) family have been shown to be effective drug targets for treatment of various helminth infections. Here, we describe a first investigation of putative nAChR subunits of the model parasite, Schistosoma mansoni. Four predicted subunits, smp_031680, smp_180570, smp_139330, and smp_012000, were cloned from S. mansoni by a combination of RT-PCR and RACE (rapid amplification of cDNA ends) procedures. All four full-length proteins contain prerequisite features of cation-selective nAChRs. Subsequent functional studies by RNA interference (RNAi) in parasite larvae (schistosomulae) and adult worms showed that the four nAChR subunits play an important role in the control of motor activity. RNAi targeting smp_031680 and smp_180570 caused hypoactivity, whereas knockdown of smp_139330 and smp_012000 caused hyperactivity, suggesting these subunits form channels that either stimulate or inhibit movement. Further confocal immunofluorescence studies of smp_031680 and smp_139330 showed that nAChRs are expressed extensively in both central and peripheral nervous systems of the parasite, musculature (smp_139330 only) and female reproductive system. Importantly, we observed distinct expression patterns of smp_031680 and smp_139330, which suggests that they are not part of the same channel. Our repeated efforts to heterologously express the four putative subunits in Xenopus oocytes were unsuccessful. We were unable to obtain functional channels from subunits expressed individually or in combination, in the presence and absence of S. mansoni orthologues of Caenorhabditis elegans ancillary proteins ric-3 and unc-50, which are known to improve heterologous expression of nAChRs. As an alternative strategy, we modified the subunits by inserting a fluorescent tag, sub-cloned the modified sequences into a mammalian expression vector, and tested for protein expression in transfected HEK293 cells by fluorescence microscopy. The results show that nAChRs can be expressed in the mammalian cells but additional experiments are needed to test for channel activity. All in all, this is a small yet significant first step in elucidating the parasite's cholinergic nervous system and identifying some of the receptors involved in cholinergic motor control in S. mansoni. / La schistosomiase est une des maladies parasitaires les plus importantes sur le plan socioéconomique, affectant plus de 200 millions de personnes à travers le monde. Le praziquantel est le seul médicament disponible pour le traitement de la schistosomiase dans la plupart des régions du monde et il est urgent de trouver un traitement de rechange viable pour complémenter ce médicament. Il a été démontré que les canaux ioniques de type pentamériques sensibles à de l'acétylcholine appartenant à la famille des récepteurs nicotiniques (nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) sont la cibles de plusieurs médicaments vermifuges utilisés pour le traitement de diverses infections causées par des helminthes. Dans ce mémoire, nous décrivons pour la première fois l'existence de sous-unités nAChR putatives chez le parasite modèle Schistosoma mansoni. Les séquences codantes complètes de quatre sous-unités putatives, smp_031680, smp_180570, smp_139330, et smp_012000, ont été déterminées et clonées chez S. mansoni en utilisant une combinaison de RT-PCR (transcription inverse et réaction en chaîne par la polymérase) et de RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc). Les quatre séquences protéiques obtenues possèdent les caractéristiques typiques des nAChRs perméables aux cations. Nous démontrons également grâce à des études fonctionnelles d'interférence de l'ARN (RNAi) réalisées dans des larves de parasites (schistosomules) et des vers adultes que les quatre sous-unités nAChR jouent un rôle important dans le contrôle de l'activité motrice. En effet, nous avons observé que l'RNAi ciblant smp_031680 et smp_180570 causait l'hypoactivité motrice, tandis que la diminution de l'expression génique de smp_139330 et smp_012000 causait l'hyperactivité motrice, suggérant par conséquent que ces sous-unités forment des canaux ioniques capable de stimuler ou d'inhiber l'activité motrice. Par ailleurs, des études d'immunolocalisation et de microscopie confocale ont montré que les sous-unités nAChRs smp_031680 et smp_139330 sont abondamment exprimées dans les systèmes nerveux central et périphérique du parasite, ainsi qu'au niveau de la musculature (smp_139330 seulement) et du système reproducteur féminin. Il est important de noter nous avons observé des profils d'expression distincts entre smp_031680 et smp_139330, ce qui suggère que ces sous-unités ne font pas partie du même récepteurs. Nos tentatives répétées pour exprimer de manière hétérologue ces quatre sous-unités putatives dans des ovocytes de Xenopus ont été infructueuses. Nous n'avons pas pu obtenir de récepteurs fonctionnels à partir de sous-unités exprimées individuellement ou en combinaison, en présence et en l'absence de protéines auxiliaires de S. mansoni orthologues aux protéines ric-3 et unc-50 de Caenorhabditis elegans, lesquelles sont connus pour améliorer l'expression hétérologue des nAChRs. Alternativement, nous avons modifié les sous-unités en y insérant un marqueur fluorescent et avons sous-cloné ces séquences dans un vecteur d'expression de mammifère. Nous avons ensuite visualisé par immunofluorescence l'expression des protéines d'intérêts transfectées dans des cellules HEK293. Les résultats montrent que les nAChRs sont exprimés dans les cellules de mammifères, mais d'autres expériences sont nécessaires afin de tester l'activité de ces récepteurs. Somme toute, bien que limités, nos résultats constituent un premier pas important dans la compréhension du système nerveux cholinergique du parasite et ont permis d'identifier quelques-uns des récepteurs impliqués dans le contrôle cholinergique des fonctions motrices chez S. mansoni.

In parasitic platyhelminths, including Schistosoma mansoni the coordination of neuromuscular system is critical for continued propagation, development and successful completion of the lifecycle. Neuromuscular signaling in these parasites is mediated by a variety of neurotransmitters, both small molecules ("classical") transmitters and neuropeptides. Biogenic amines (BA) constitute the largest subset of classical neurotransmitters and play several key roles in the control of schistosome muscle function and movement. There are several putative BA receptors identified in the S. mansoni genome, the majority of which are Class A G protein coupled receptors (GPCRs). Here we report the functional role of these putative BA receptors in parasite development and motility by developmental expression analysis and RNAi screening. We performed an expression analysis of several putative BA receptors at the RNA level in different developmental stages of the parasite, using reverse-transcription coupled to quantitative PCR (RT-qPCR). One of these proteins is a previously described serotonin receptor of S. mansoni (named Sm5HTR) and the others are novel "orphan" BA-like receptors. The analysis showed that the BA receptors tested are expressed in all developmental stages, however the majority are preferentially expressed in cercaria and schistosomula, suggesting these receptors play particularly important roles in parasite larvae. Next we performed RNA interference (RNAi) targeting the same BA receptors by transfecting S.mansoni larvae with small interfering RNA (siRNA) and analyzed for effects on motor activity by comparing with the control groups. Given that BAs are known modulators of schistosome movement, we hypothesized that the RNAi would produce a motor phenotype in the larvae and this was confirmed by the data. The results identified strongly hypoactive phenotypes for three out of four receptors tested, including Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 and Smp_120620), all showing significant reduction in movement compared to control larvae transfected with irrelevant (scrambled) siRNAs. The RNAi phenotype correlated with a significant and specific knockdown in transcript levels as determined by RT-qPCR. To elucidate the mode of action of Sm5HTR we also performed confocal immunolocalization analysis using a specific peptide antibody. The expression pattern suggests Sm5HTR is highly abundant in the central and peripheral nervous system of the parasite, including the peripheral innervation of the body wall muscles responsible for movement. Together the results suggest that Sm5HTR and other BA receptors play an important role in the control of schistosome motility, particularly the larvae, and could be potential targets for new drug discovery. / En plathelminthes parasites, y compris Schistosoma mansoni la coordination de système neuromusculaire est essentiel pour continuer à se propager, le développement et la réussite du cycle de vie. Signalisation neuromusculaire chez ces parasites est médiée par une variété de neurotransmetteurs, les petites molécules (classique) des émetteurs et des neuropeptides. Les amines biogènes (BA) constituent le plus grand sous-ensemble de neurotransmetteurs classiques et jouent plusieurs rôles clés dans le contrôle de la fonction musculaire schistosome et le mouvement. Il RNA ya plusieurs récepteurs BA putatifs identifiés dans le génome de S. mansoni, dont la majorité sont des récepteurs couplés aux protéines de classe AG (GPCR). Nous rapportons ici le rôle fonctionnel de ces récepteurs putatifs de BA dans le développement du parasite et de la motilité par analyse de l'expression du développement et de dépistage RNAi. Nous avons effectué une analyse de l'expression de plusieurs récepteurs de BA putatifs au niveau de l' dans les différents stades de développement du parasite, en utilisant la transcription inverse couplée à une PCR quantitative (RT- qPCR). Une de ces protéines est un récepteur de la sérotonine décrit précédemment de S. mansoni (nommé Sm5HTR) et les autres sont de nouveaux récepteurs "orphelins" BA -like . L'analyse a montré que les récepteurs de la BA testés sont exprimés dans tous les stades de développement mais la majorité sont préférentiellement exprimé dans les cercaires et schistosomule, suggérant que ces récepteurs jouent un rôle particulièrement important dans les larves de parasite. Suivant nous avons effectué l'interférence RNA (RNAi) de cibler les mêmes récepteurs de BA par transfection larves S.mansoni avec petits RNA interférents (siRNA) et analysé les effets sur l'activité motrice par comparaison avec les groupes témoins. Étant donné que le BAs sont des modulateurs du mouvement schistosome connu, nous avons supposé que l' RNAi serait de produire un phénotype de moteur dans les larves et cela a été confirmé par les données. Les résultats identifiés phénotypes fortement hypoactif pour trois des quatre récepteurs testés, y compris Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 et Smp_120620), tous montrant une réduction significative de mouvement par rapport à lutter contre les larves transfectées avec non pertinentes (brouillés) siRNA. Le phénotype RNAi corrélée avec un effet de choc important et spécifique dans les niveaux de transcription tel que déterminé par RT- qPCR. Pour élucider le mode d'action de Sm5HTR nous avons également effectué une analyse de immunolocalisation confocale en utilisant un anticorps anti- peptide spécifique. Le profil d'expression suggère Sm5HTR est très abondant dans le système nerveux central et périphérique du parasite, y compris l'innervation périphérique des muscles de la paroi du corps chargés de mouvement. Ensemble, les résultats suggèrent que Sm5HTR et d'autres récepteurs de la BA jouent un rôle important dans le contrôle de la motilité schistosome, en particulier les larves, et pourraient être des cibles potentielles pour la découverte de nouveaux médicaments.

Flatworms of the genus Schistosoma are wide-spread and clinically significant parasites of humans in the tropics and sub-tropics. In evolutionary terms, they are representatives of the earliest metazoans to have evolved separate sexes, and to possess anatomically distinct central and peripheral nervous systems. Schistosome infections are currently controlled by a single drug, praziquantel (PZQ), but the emergence of schistosome strains resistant to PZQ is a growing concern.A deeper understanding of the basic biology of schistosomes is the first step towards target-based drug discovery. Neuronal receptors of schistosomes are attractive targets for drug development because all major physiological activities and behaviors in these parasites are coordinated by their nervous system. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors, including members of the pentameric ligand-gated ion channel (pLGIC) superfamily. The S. mansoni genome encodes 4 putative non-AChR-like inhibitory pLGIC subunits and 13 putative nAChR-like pLGIC subunits.The work presented in this thesis focuses on L-glutamate (L-glu) neuronal signaling in S. mansoni. L-glu is an important neurotransmitter in essentially all vertebrate and invertebrate phyla, but its functional roles in S. mansoni are poorly understood. Here, we further contribute to knowledge in this field by providing the first molecular evidence for the contribution of an inhibitory, glutamate-gated Cl channel (GluCl)-mediated component to glutamatergic neurotransmission in S. mansoni.First, we show that the 4 non-AChR-like inhibitory pLGIC subunit candidates encode GluCl subunits (SmGluCl-1-4) that are pharmacologically and evolutionarily distinct from insect, nematode and snail GluCls. Using an electrophysiology approach in Xenopus oocytes, we demonstrate that SmGluCl-1, -2 and -3 subunits exhibited low micromolar affinity for L-glu, are permeable to Cl , but are insensitive to ivermectin and meclonazepam. Phylogenetic analyses suggest that the SmGluCl subunits belong to a previously uncharacterized clade of flatworm GluCls that includes several GluCl candidates from related trematode and cestode species.Then, we provide evidence that the SmGluCl subunits are expressed in all human stages of the parasite. An analysis of SmGluCl stage-specific expression by RT-PCR amplification reveals that transcripts from all 4 SmGluCl subunits are expressed in S. mansoni cercaria, schistosomules, adults and eggs. Confocal immunolocalization reveals that all the SmGluCl subunits are widely expressed in the nervous system of male and female worms, and exhibit partially overlapping expression patterns in the central nervous system and in the peripheral nerve cords and plexuses supplying the body, attachment organs, reproductive tract and tubercles. The lack of apparent co-localization between SmGluCl subunits and phalloidin suggests that they are not expressed in the musculature. Together, these findings offer possible clues regarding the physiological functions they mediate, including interneuronal signaling, indirect regulation of motility, attachment and feeding, oogenesis and sensory signaling.Finally, we present initial data from prospective work aimed at developing a YFP assay for HTS of compound libraries against S. mansoni GluCls heterologously expressed in mammalian cells. We confirm by confocal immunofluorescence that heterologously expressed FLAG-tagged SmGluCl-2 is localized at the membrane surface of HEK-293. Further work is underway to demonstrate the feasibility of this assay for HTS against S. mansoni GluCls as a means of exploring the potential of new compounds as either therapeutic leads or pharmacological probes targeting S. mansoni GluCls to explore their physiological functions. / Les vers plats (platyhelminthes) du genre Schistosoma sont des parasites de l'homme répandus dans plusieurs régions tropicales et sous-tropicales. Le seul médicament disponible pour traiter la schistosomiase est le praziquantel (PZQ). L'émergence de souches de schistosomes résistantes au PZQ est une préoccupation croissante. Le système nerveux des schistosome exerce un contrôle exclusif sur toutes les activités physiologiques de ces parasites, déterminant leurs particularités comportementales au sein de leur hôte. La signalisation neuronale chez les schistosomes est modulée par une variété de neurotransmetteurs et des récepteurs qui leur sont associés, incluant les membres de la superfamille des récepteurs ionotropes sensible à un ligand de type pentamérique (pLGIC). Le génome de S. mansoni encode 4 sous-unités putatives de pLGIC insensibles à l'acétylcholine (non-AChR) et 13 sous-unités putatives de pLGIC de type nAChR.Le L-glu est un neurotransmetteur important, retrouvé chez presque tous les vertébrés et les invertébrés, mais les fonctions neurologiques qu'il module chez S. mansoni sont mal comprises. Cette thèse fournit la toute première preuve que le L-glu peut générer des potentiels postsynaptiques inhibiteurs médiés par l'activation de pLGICs sensibles au L-glu (GluCl). Les 4 gènes candidats encodant des sous-unités pLGIC de type non-AChR sont des sous-unités GluCl (SmGluCl-1-4). Ces récepteurs SmGluCl diffèrent des récepteurs GluCl retrouvés chez les insectes, les nématodes et les gastropodes. Des expériences d'électrophysiologie montrent que les sous-unités SmGluCl-1, -2 et -3 forment des récepteurs perméables aux ions Cl et sensibles à des concentrations de L-glu de l'ordre du micromolaire (7-27 µM), mais sont insensibles à l'ivermectine et au meclonazepam. Les analyses phylogénétiques suggèrent que les sous-unités SmGluCl appartiennent à un nouveau groupe de sous-unités GluCl retrouvées exclusivement chez les vers plats parasitaires.Ensuite, nous démontrons par RT-PCR que les ARN messagers encodantque les sous-unités SmGluCl sont produites par tous les stades de développement du parasite interagissant avec l'humain. Des expériences d'immunolocalisation révèlent que ces sous-unités SmGluCl sont abondamment exprimées dans les vers mâles et femelles, au niveau du système nerveux central, ainsi que dans certains des cordons et plexus nerveux du système nerveux périphérique innervant l'enveloppe corporelle, les organes d'attachement, l'appareil reproducteur et les tubercules. Les récepteurs SmGluCl ne sont pas exprimés dans la musculature des schistosomes. En somme, la distribution des sous-unités SmGluCl dans le système nerveux suggère que ces récepteurs pourraient être impliqués dans la signalisation interneuronale et sensorielle et pourrait réguler de manière indirecte la mobilité, l'attachement et l'alimentation et l'ovogenèse.Enfin, nous présentons des données préliminaires obtenues dans le cadre d'un projet visant à développer une méthode analytique permettant le criblage à haut débit (high-throughput screening, HTS) de banques de composés d'intérêt pharmaceutique, afin de tester leur effet sur l'activité des récepteurs GluCl des schistosomes. Cette méthode analytique sera effectuée dans des cellules de mammifères exprimant les récepteurs SmGluCl de manière hétérologue et permettra de mesurer l'activité de ces récepteurs en fonction de la fluorescence émise par la protéine YFP. Nous avons confirmé par immunolocalisation que SmGluCl-2 exprimée de manière hétérologue dans des cellules HEK-293 est localisée au niveau de la surface membranaire. D'autres travaux sont en cours pour démontrer la faisabilité de ce test pour l'identification par HTS de molécules modulant l'activité des récepteurs GluCl de S. mansoni. Les composés identifié pourront être utilisés comme sondes pharmacologiques afin d'approfondir l'étude des fonctions physiologiques modulées par les récepteurs GluCl de S. mansoni.

A unique subcellular structure found in Leishmania donovani is the glycosome. This organelle compartmentalizes the enzymatic machinery required for multiple metabolic pathways, including glycolysis. Correct targeting of glycosomal enzymes is essential for parasite viability. Proteins targeted to the glycosome have either a C-terminal PTS1 or N-terminal PTS2 topogenic signal sequence, which is recognized by cytosolic receptors LdPEX5 or LPEX7, respectively. These cargo-loaded receptors interact with the peroxin protein LdPEX14, located on the cytosolic face of the glycosomal membrane, an event required for import of the cargo proteins into the glycosomal lumen. However, the complete glycosomal protein import pathway has not been fully elucidated. This work has been undertaken to better understand the protein-protein interactions involved in the trafficking of cargo proteins across the glycosomal membrane.The cytosolic fraction from L. donovani parasites was used to determine protein-protein interactions of receptors LdPEX5 and LPEX7. Size exclusion chromatography, isoelectric focusing, and affinity pull-downs showed that in the cytosol these receptors form large heterologous PTS1-LdPEX5-LPEX7-PTS2 complexes. Purified glycosomes were used to evaluate the effects of receptor-cargo complexes on glycosomal LdPEX14 conformation. Limited trypsin proteolysis showed that interaction of receptor-cargo complexes with native LdPEX14 protected this protein from digestion, whereas native LdPEX14 alone was highly sensitive to proteolysis. Protection was not dependent on membrane integrity as disruption of the lipid bilayer did not alter the effect of trypsin on these proteins. Native gel electrophoresis showed that native LdPEX14 forms large ~800 kDa complexes; however, when associated with receptor-cargo complexes the molecular weight of LdPEX14 complexes increased to ~1200 kDa. Alkaline carbonate extractions showed that native LdPEX14 acts like a peripheral glycosomal membrane protein; however loading with receptor-cargo complexes caused LdPEX14 to behave like an integral membrane protein. Furthermore, membrane insertion of LdPEX14 drove insertion of LdPEX5 and LPEX7 into the glycosomal membrane. Receptor-cargo complex association causes LdPEX14 to undergo a conformational change resulting in deeper membrane insertion and increase in complex size.Purification of recombinant LPEX7 was hampered by its association with bacterial chaperone protein GroEL. A refolding technique was developed to purify LPEX7 from inclusion bodies free of bacterial proteins. Far Western and protein-protein affinity assays showed that refolded LPEX7 specifically bound PTS2 proteins as both a monomer and a dimer, the co-receptor LdPEX5, and LdPEX14. Mapping of the interaction domains on LPEX7 showed that LPEX7-PTS2 interaction required the entire receptor protein, while LdPEX5 and LdPEX14 interaction motifs were situated in the N-terminal region of LPEX7.There are metabolites in glycosomes that are not imported via the peroxin based glycosomal import pathway but by glycosomal membrane transporters. L-arginine is one such metabolite; it is the substrate for the PTS1 glycosomal enzyme arginase, which catalyses the first step in the polyamine biosynthetic pathway. L-arginine is scavenged from the extracellular milieu and by the L-arginine transporter, amino acid permease 3 (LdAAP3). Subcellular fractionation showed that LdAAP3 localized to both the plasma and glycosomal membranes. Furthermore, L. donovani promastigotes were capable of sensing the L-arginine levels in the media and upregulated LdAAP3 expression on the plasma and glycosome membrane in the absence of L-arginine. These studies provide evidence that metabolite specific transporters are present on the glycosomal membrane.Together these studies contribute to the elucidation of glycosomal function in Leishmania donovani, and a better understanding of some of the mechanisms required for glycosomal import. / Le glycosome est une structure subcellulaire unique qui se trouve dans le parasite Leishmania donovani. Cette organelle compartimente la machinerie enzymatique requise pour de multiples voies métaboliques, y compris la glycolyse. Le bon ciblage des enzymes du glycosome est essentiel pour la viabilité du parasite. Les protéines ciblées pour le glycosome ont une séquence signal topogénique, un PTS1 C-terminale ou un PTS2 N-terminale, qui est reconnue par les récepteurs cytosoliques, le LdPEX5 ou le LPEX7, respectivement. Ces complexes de récepteurs chargés s'interagissent avec la protéine LdPEX14, située du côté cytosolique de la membrane glycosomale, un événement requis pour le transport des protéines à travers la membrane du glycosome. Cependant, la voie complète d'importation de protéines glycosomales n'a pas été totalement élucidée. Ce travail a été entrepris pour mieux comprendre ces interactions protéine-protéine.La fraction cytosolique des parasites L.donovani a été utilisée pour déterminer les interactions protéine-protéine des récepteurs LdPEX5 et LPEX7. La chromatographie d'exclusion de taille, la focalisation isoélectrique, et les interactions d'affinité proteine-proteine ont montré que, dans les cytosols, ces récepteurs forment des grands complexes hétérologues. Les glycosomes purifiés ont été utilisés pour évaluer l'effet des complexes récepteur sur la conformation du LdPEX14. Une protéolyse limitée a montré que l'interaction du LdPEX14 chargé avec les complexes récepteur l'à protèger de la digestion à la surface de la membrane. L'électrophorèse sur gel natif a montré que le LdPEX14 forme des grands complexes de ~ 800 kDa et que lorsqu'il est associé à des complexes récepteur, le poids moléculaire des complexes LdPEX14 passe à ~ 1200 kDa. Les extractions avec le carbonate alcalin a déterminé que le LdPEX14 seul s'agit comme une protéine périphérique; mais son chargement avec des complexes récepteur l'entrainer à s'agir comme une protéine membranaire intégrale. L'insertion de LdPEX14 dans la membrane du glycosome conduit à l'insertion du LdPEX5 et LPEX7 dans la membrane aussi. L'association des complexes récepteur à causer LdPEX14 à subir un changement de conformation causant l'insertion profonde dans la membrane et l'augmentation de la taille des complexes.La purification du récepteur LPEX7 recombinante été entravée par son association avec la protéine chaperonne bactérienne GroEL. Une technique de repliement a été développé pour purifier LPEX7 en évitant l'association de protéines bactériennes. Les techniques de Far Western et d'affinité protéine-protéine ont montré que ce LPEX7 replier est spécifiquement associé à des protéines PTS2, le co-récepteur LdPEX5, et le LdPEX14. La cartographie des domaines d'interaction de LPEX7 a montré que l'interaction LPEX7-PTS2 nécessit le LPEX7 entière, alors que les motifs d'interaction avec LdPEX5 et LdPEX14 étaient situés dans sa région N-terminale.Il y a des métabolites glycosomal qui ne sont pas importés par la voie de l'importation glycosomale, mais par des transporteurs membranaires du glycosome. L-arginine est un de ces métabolites, substrat de l'enzyme glycosomale PTS1 arginase. L-arginine est récupéré dans le milieu extracellulaire par son transporteur, LdAAP3. Un fractionnement subcellulaire a été utilisés pour séparer les membranes plasmiques des glycosomes, et LdAAP3 a été localisé sur les deux membranes. De plus, des promastigotes de L. donovani sont capable de detecter le niveau de L-arginine dans le millieu, ce qui provoque une régulation positive de l'expression de LdAAP3 à la fois dans la membrane plasmique et dans la membrane du glycosome. Ces études fournissent des preuves que des transporteurs de métabolites spécifique sont présent dans la membrane du glycosome.Ensemble, ces études contribuent à l'élucidation de la fonction glycosomale de Leishmania donovani, et une meilleure compréhension de certains mécanismes nécessaires pour l'importation glycosomale.