The goal of this thesis was to identify genetic loci involved in radiation-induced lung disease in mice. Phenotypic analysis was completed for alveolitis, pulmonary fibrosis, survival time, mast cells/mm2 and cell counts in bronchoalveolar lavage (BAL) to assess lung damage. Genome scans and linkage analysis were completed for two backcross cohorts (75%C3H/HeJ-25%C57Bl/6J or 25%C3H/HeJ-75%C57BU6J) using each of the phenotypes measured. Putative susceptibility loci were identified for alveolitis on chromosomes 12 (LOD=3.35), 14 (LOD=2.22) and 19 (LOD=1.7) in the mostly C3H/HeJ backcross cohort and on chromosome 14 (LOD=2.7) in the mostly C57BI/6J backcross cohort. Linkage using the pulmonary fibrosis scores provided supportive evidence for a quantitative trait loci (QTL) on chromosome 17 (LOD=2) in the mostly C57BI/6J background, and two unique putative linkage regions were localized on chromosome 2 (LOD=2.2) in the mostly C3H/HeJ cohort and 14 (LOD=2) in the mostly C57BI/6J cohort. Supporting evidence for linkage on chromosomes 12 and 14 in the mostly C3H/HeJ background and chromosome 14 in the mostly C57BI/6J background was obtained using cellular markers. Additionally, survival time mapped to the linkage regions isolated for alveolitis and pulmonary fibrosis, suggesting that the development of radiation-induced lung disease influences the survival time of the mice. Within each cohort there were sex dependent linkage intervals, indicating that male and female mice may possess different factors involved in the development of alveolitis and/or pulmonary fibrosis. These results suggest that there are multiple genetic loci involved in the development of radiation-induced lung disease in mice.

Formation of gametes capable of supporting development is dependent on a number of genetic and epigenetic events. DNA methylation is an epigenetic modification catalyzed by enzymes named DNA methyltransferases (DNMTs). In the mouse, methylation of DNA is associated with the control of gene expression and proper embryo development. Methylation patterns are established in a sex- and sequence-specific manner during male and female germ cell development and further modified during early embryonic development. Even though new DNMTs have recently been identified, little information is known on the origin of the methylation marks during male germ cell development (spermatogenesis). The main goal of the work presented in this thesis was to gain a better understanding of the enzymes involved in creating the epigenetic program of the male genome. The first step in doing so involved comparing the temporal expression profiles of DNA methyltransferases in the developing testis and ovary. The expression profiles obtained indicated that in the male, DNMT3a and DNMT3L could be involved in de novo methylation while DNMT3b and DNMT1 could be responsible for maintaining methylation patterns following DNA replication. Next, characterization of Dnmt3a and Dnmt3b expression in isolated postnatal male germ cells revealed how tightly regulated the expression of these genes is during spermatogenesis: specific transcript variants and protein isoforms of each DNMT are differentially expressed during male germ cell development. Finally, assessing the effect of Dnmt3L inactivation on the male germ line exposed the presence of a mitotic defect in germ cells lacking this protein. DNA methylation analyses revealed that many loci throughout the genome are marked for methylation by DNMT3L, indicating a more global role for this enzyme than that previously reported in genomic methylation patterning in the male germ line. As methylation patterns instituted during spermatogenesis have to be properly established for accurate transmission of epigenetic information to the next generation, the studies presented here contribute to our knowledge of the events leading to the creation of the epigenetic program necessary for the formation of healthy gametes.

The planar cell polarity (PCP) pathway is evolutionally conserved from flies to vertebrate; it controls multiple cellular processes during embryonic development. One of such processes is neurulation, which gives rise to the brain and spinal cord. Mutations in the PCP genes in mice cause a very severe neural tube defect (NTD), called craniorachischisis, establishing that the PCP pathway is an important regulator of neural tube closure. NTDs are the second most common congenital malformation in humans. Since the etiology of NTDs in humans is complex and involves both genetic and environmental factors, the identifying of the causative genes/factors has been very difficult. Recently, however, mutations in the PCP genes, Vangl1 and Vangl2, were reported to contribute to the pathogenesis of a subset (~2%) of human NTDs, suggesting that other genes in the same pathway may account for some cases of NTDs in humans. Knockdown studies of another PCP gene, Fuzzy, in model animals revealed a wide spectrum of phenotypes including NTDs, defective convergent extension, abnormal Sonic hedgehog (Shh) signalling, and defects in ciliogenesis. In this project, we studied the role of Fuzzy in neural tube development in mammals as well as Fuzzy-dependent molecular mechanisms that contribute to the generation of primary cilium. We screened a human NTD cohort from Italy for mutations in Fuzzy and identified five non-synonymous disease-associated amino-acid variants. We have designed novel methods to ascertain an impact of mutations on ciliogenesis. We report here that Fuzzy mutations affect formation of primary cilium and ciliary length and impact directional cell movements. We therefore propose that mutations in Fuzzy may account for the subset of NTDs in humans. We established that Fuzzy delivers Rab8, an essential regulator of ciliogenesis, to the cilium and propose that loss of cilia seen in Fuzzy mutant is, at least partly, due to the loss of Rab8 at the cilium. In addition, we uncovered novel molecular mechanisms whereby Fuzzy affects canonical Wnt signalling. We report here that Fuzzy interacts with DVL2, a PCP protein. Fuzzy both recruits and delivers DVL2 to the primary cilium, consequently limiting the canonical PCP pathway. / La voie de la polarité cellulaire planaire (PCP), conservée de la mouche aux vertébrés, contrôle plusieurs processus cellulaires au cours du développement embryonnaire telle que la neurulation qui permet le développement du cerveau et de la moelle épinière. Des mutations des gènes de la PCP chez la souris causent une forme très sévère des anomalies du tube neuronal (ATN), le craniorachischisis, suggérant ainsi que la PCP est un régulateur important de la fermeture du tube neuronal. Les ATN sont la deuxième malformation congénitale la plus courante chez les humains. Vu que l'étiologie des ATN chez les humains est complexe et implique à la fois des facteurs génétiques et environnementaux, l'identification des gènes/facteurs responsables s'avère difficile. Toutefois, les études récentes ont mis en évidence que les mutations des gènes de la PCP, Vangl1 et Vangl2, chez les humains contribuent à la pathogenèse de certains cas d'ATN (~2%), ce qui suggère que d'autres gènes de la même voie peuvent aussi être tenus responsable de certains cas d'ATN chez les humains. Les études de knock-out, dans les modèles animaux, d'un autre gène de la PCP, Fuzzy, ont révélé un large éventail de phénotypes dont les ATN, l'extension convergente aberrante, la signalisation Sonic hedgehog (Shh) anormale et les défauts dans la ciliogenèse. Dans ce projet, nous avons étudié le rôle de Fuzzy dans le développement du tube neuronal chez les mammifères ainsi que des mécanismes moléculaires Fuzzy-dépendant impliqués dans la formation du cil primaire. Nous avons examiné des mutations dans le gène Fuzzy dans une cohorte humaine d'ATN provenant d'Italie et identifié cinq substitutions non synonymes d'acides aminés associées à des maladies. Nous avons conçu de nouvelles méthodes pour déterminer l'impact des mutations sur la ciliogenène. Nous reportons, dans cette étude, qu'au moins une mutation dans le gène Fuzzy affecte la formation du cil primaire ainsi que sa longueur et les mouvements directionnels des cellules. Par conséquent, nous proposons que les mutations du gène Fuzzy peuvent être tenus responsable de certains cas d'ATN chez les humains.Dans ce travail, nous avons établi que Fuzzy recrute et/ou séquestre Rab8, un régulateur essentiel de la ciliogenène, et nous suggérons que la perte des cils observée chez les mutants de Fuzzy est en partie causée par l'absence du Rab8 au niveau du cil. De plus, nous avons découvert un nouveau mécanisme moléculaire via lequel Fuzzy affecte la signalisation de Wnt. Cette étude montre que Fuzzy interagit avec DVL2, une protéine de la PCP. Ainsi, Fuzzy recrute et délivre DVL2 au niveau du cil primaire limitant ainsi la voie canonique de la PCP.

Many genes that are involved in nutrient and energy utilization and storage are conserved between humans and C. elegans. One of the genes involved in worm mitochondrial respiration is clk-1. This gene encodes an enzyme required for ubiquinone biosynthesis. One of the phenotypes of clk-1 mutants is altered defecation cycle: the slowing down of the defecation cycle and the inability to defecate faster at higher temperatures. these phenotypes are independent of one another. Several lines of evidence suggest that the slowed defecation of clk-1 mutants is due to alterations in lipoprotein/cholesterol metabolism because the mutant phenotype can be suppressed by the reduction of dietary cholesterol, administration of drugs affecting lipoprotein metabolism, and mutating genes involved in lipoprotein metabolism. These mutations can be separated into two classes: those which suppress the clk-1 slow defecation at 20 as well as after the shift to 25°C (class I) and those which only suppress it at 20°C (class II). Worm dsc-4 (lipoprotein assembly) and dsc-3 (metabolism of bile-like molecules) are class I suppressors. Both of these mutations restore the ability of clk-1 mutants to react to the temperature shifts. In this study we identified a novel class I suppressor pgp-2 and classified sod-4 as a class II suppressor. pgp-2 encodes a protein essential for the biosynthesis of the worm intestinal lysosome-related organelles. Mutations in both pgp-2 and sod-4 are unable to restore the ability of clk-1 worms to react to the temperature shifts. Combining different class I mutants as well as combining class I with class II mutant sod-4 revealed that the genetic interactions between class I mutants as well as genetic interactions between class I and class II mutants are hard to predict. / Plusieurs des gènes impliqués dans l'utilisation des nutriments et de l'énergie ainsi que pour leur stockage sont conservés de l'humain à C. elegans. Un des gènes impliqué dans la respiration mitochondriale du nématode est clk-1. Ce gène encode pour une enzyme requise à la synthèse d'ubiquinone. Un des phénotypes des mutants clk-1 est une altération du cycle de défécation. Chez ces mutants, le cycle de défécation est ralenti et celui-ci ne s'accélère pas à des températures plus élevées, comme observé chez le nématode sauvage. Ces phénotypes sont indépendants l'un de l'autre. Plusieurs résultats expérimentaux suggèrent que le ralentissement du cycle de défécation chez les mutants clk-1 est du à des altérations du métabolisme lipoprotéines/cholestérol car ce phénotype peut être supprimé par la réduction du cholestérol provenant de la diète, par l'administration de composés affectant le métabolisme des lipoprotéines et par mutation des gènes impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines. Ces mutations peuvent êtres divisées en 2 classes : celles qui suppriment le ralentissement du cycle de défécation à 20oC aussi bien qu'à 25oC (classe I) et celles qui suppriment ce phénotypes seulement à 20oC (classe II). La mutation dsc-4 chez le nématode (impliqué dans l'assemblage des lipoprotéines) ainsi que la mutation dsc-3 (impliqué dans le métabolisme des molécules de type bile) agissent comme suppresseurs de classe I. Chacune de ces deux mutations restaure la capacité des mutants clk-1 à réagir à des changements de température. Dans cette étude, nous avons identifié un nouveau suppresseur de classe I, pgp-2 et classifié sod-4 comme étant un suppresseur de classe II. pgp-2 encode une protéine essentielle à la biosynthèse des organelles intestinales de type lysosome. Les mutations pgp-2 et sod-4 combinées ne suffisent pas à restaurer la capacité de clk-1 à répondre aux changements de température. La combinaison de différentes mutations de classe I ainsi que des mutations de classe I et la mutation de classe II, sod-4, nous a démontré que les interactions génétiques entre les différents mutants sont difficiles à prévoir.

In mitochondria, ATP is generated by oxidative phosphorylation (OXPHOS), a process that requires five multimeric enzyme complexes. Electrons are passed along the first four enzyme complexes (complex I-IV) that make up the mitochondria respiratory chain, releasing energy that is stored in the form of a proton gradient across the mitochondrial inner membrane, and is subsequently used by the ATP synthase (complex V) to produce ATP. Complex IV or cytochrome c oxidase (COX) is the terminal enzyme in the mitochondrial respiratory chain, catalyzing the oxidation of cytochrome c by molecular oxygen. It contains 13 structural subunits in mammals, 3 of which are encoded by mitochondrial DNA. Cytochrome c oxidase deficiencies can be caused by mutations in either mitochondrial or nuclear DNA. COX deficiency can result from mutations in the structural subunits or factors necessary for the assembly of the enzyme complex. In this thesis, two novel genes mutated in two subjects with COX deficiency have been identified. First, we identified a specific defect in the synthesis of the mtDNA-encoded COX subunit 1 (COX I) in a pedigree segregating late-onset Leigh Syndrome and COX deficiency. We mapped the defect to chromosome 17q by microcell-mediated chromosome transfer and identified a homozygous single base pair insertion causing a premature stop in CCDC44, renamed TACO1 for translational activator of COX I. TACO1 is a member of a large family of hypothetical proteins containing a conserved DUF28 domain that localizes to the mitochondrial matrix. Expression of the wild-type cDNA restored TACO1 protein and rescued the translation defect. TACO1 is the first specific mitochondrial translational activator identified in mammals. Respiratory competence, mitochondrial translation and COX activity were normal in yeast strain deleted for the orthologue YGR021w, suggesting that TACO1 has evolved a novel function in mammalian mitochondrial translation. Secondly, we studied a family in which the subject presented with severe congenital lactic acidosis and dysmorphic features associated with a COX assembly defect and a specific decrease in the synthesis of COX I. Using a combination of microcell mediated chromosome transfer, homozygosity mapping, and transcript profiling we mapped the gene defect to chromosome 12, and identified a homozygous missense mutation causing an amino acid change from methionine to isoleucine in C12orf62, a gene apparently restricted to the vertebrate lineage. Expression of the wild-type cDNA restored C12orf62 protein levels, and rescued the COX I synthesis and COX assembly defect. C12orf62 is a very small (6 kDa), uncharacterized, single transmembrane protein that localizes to mitochondria. COX I, II and IV subunits co-immunoprecipitated with an epitope-tagged version of C12orf62, and 2D BN-PAGE analysis of newly synthesized mitochondrial COX subunits in subject fibroblasts showed that COX assembly was impaired, and the nascent enzyme complex unstable. We conclude that C12orf62 is required for coordinating the early steps of COX assembly with the synthesis of COX I. / Dans les mitochondries, l'ATP est généré par la phosphorylation oxydative (PHOSOX), un processus qui nécessite cinq complexes enzymatiques multimériques. Le transport des électrons le long des quatre premiers complexes enzymatiques (complexes I-IV) libère l'énergie qui est stockée sous la forme d'un gradient de protons à travers la membrane interne mitochondriale et est ensuite utilisée par l'ATP synthétase (complexe V) pour produire de l'ATP. Le complexe IV ou cytochrome C oxydase (COX) est l'enzyme terminale de la chaîne respiratoire mitochondriale, catalysant l'oxydation du cytochrome c par l'oxygène moléculaire. Il contient 13 sous-unités structurelles chez les mammifères, dont 3 sont codées par l'ADN mitochondriale. Les déficiences en cytochrome C oxydase peuvent être causées par des mutations dans l'ADN mitochondriale ou l'ADN nucléaire. Les carences en COX peuvent être liées à des mutations dans les sous-unités structurelles ou à des mutations dans des facteurs nécessaires à l'assemblage du complexe enzymatique. Dans cette thèse, deux nouveaux gènes mutés ont été identifiés et caractérisés dans deux patients présentant un déficit en COX. Premièrement, nous avons identifié un défaut spécifique dans la synthèse de la sous-unité COX 1 de l'ADN mitochondriale (COX I) dans un pedigree présentant une apparition tardive du syndrome de Leigh et une carence en COX. Nous avons cartographié le défaut génétique au chromosome 17q par la technique de transfert de chromosomes à médiation microcellulaire. Nous avons, par la suite, identifié une mutation homozygote, une insertion d'une base causant l'apparition prématurée d'un codon stop qui entraîne l'arrêt de la synthèse de la protéine CCDC44, renommé TACO1 pour activateur de la traduction de la COX I. TACO1 est membre d'une famille de protéines contenant un domaine conservé à fonction inconnue, nommé DUF28, qui se localise à la matrice mitochondriale. L'expression de l'ADN complémentaire de type sauvage de TACO1 compense le défaut de traduction de COX I. TACO1 est le premier activateur spécifique de la traduction mitochondriale à être identifié chez les mammifères. Il a été observé que l'absence (knock-down) du gène codant l'orthologue de TACO1 chez la levure, le YGR021w, ne perturbait pas la compétence des voies respiratoires, la traduction mitochondriale, ni l'activité de COX. Ceci suggère que TACO1 a évolué et a acquérit une nouvelle fonction dans la traduction mitochondriale chez les mammifères. Deuxièmement, nous avons étudié une famille dans laquelle le sujet présentait une acidose lactique congénitale et dysmorphie associée à un défaut d'assemblage et une diminution de l'activité enzymatique de la COX due à un défaut spécifique dans la traduction de COX I. En utilisant une combinaison de techniques dont le transfert de chromosomes à médiation microcellulaire, la cartographie d'homozygotie et le profilage de transcription, nous avons cartographié le gène défectueux sur le chromosome 12. Nous avons identifié une mutation faux sens à l'état homozygote provoquant un changement d'acide aminé de méthionine en isoleucine dans le gène C12orf62, un gène qui semble restreint à la lignée des vertébrés. L'expression de l'ADN complémentaire de type sauvage de C12orf62 a restauré la synthèse de COX I et le défaut d'assemblage de la COX. C12orf62 est une très petite protéine transmembranaire (6 kDa), non caractérisée, qui se localise aux mitochondries. Les sous-unités COX I, II et IV co-immunoprécipitent avec un épitope marqué de la protéine C12orf62. Les analyses de bleu d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) en deux dimensions pour les sous-unités nouvellement synthétisées de la COX mitochondriale ont démontré que la COX assemblée est altérée et que le complexe enzymatique naissant est instable dans les fibroblastes du patient atteint. Nous concluons que C12orf62 est nécessaire pour coordonner les étapes précoces de l'assemblage de la COX et de la synthèse de COX I.

Folates are essential vitamins involved in nucleotide synthesis and DNA methylation. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) synthesizes the folate derivative utilized in methylation reactions. Inadequate dietary folate intake and MTHFR deficiency may increase the risk of developing colorectal cancer. Previous studies in our laboratory showed that a low folate diet induces intestinal tumors in BALB/c but not in C57Bl/6 mice. In addition, mild MTHFR deficiency (Mthfr+/-) may increase tumor formation in BALB/c mice fed low folate. To identify genetic differences responsible for tumor susceptibility, we performed microarray analysis to compare gene expression in preneoplastic intestine between BALB/c and C57Bl/6 mice fed low folate. We also compared preneoplastic intestine expression of Mthfr+/- BALB/c mice fed low folate to Mthfr+/+ BALB/c mice fed control diet. With quantitative real-time-PCR, we confirmed significant changes in the retinoid/ PPARα pathway (Bcmo1, Aldh1a1, Ppara, Acot1, Cd36, Cyp4a10, Aqp3, Hmgcs2 and Me1) and variation in expression of genes involved in apoptosis, cell proliferation or immune response (Tgfbi, Arntl, Bmp5, Sprr2a, Atf3, Plscr2, Ppme1 and Trem4). Gene-specific methylation changes consistent with mRNA changes were observed for Bcmo1, Ppara and Bmp5. These results suggest that fatty acid metabolism, PPARa/RXR activation and decreased expression of tumor suppressor genes may be implicated in the transition from preneoplastic tissue to adenoma. DNA methylation status may play an important role in the expression of some of these genes. / L'acide folique est une vitamine essentielle pour la synthèse des nucléotides et les réactions de méthylation. La methylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR) permet de synthétiser les molécules requises pour la méthylation de l'ADN. Un déficit en folates ou en MTHFR peut augmenter le risque de développer un cancer colorectal. Des études précédentes dans notre laboratoire ont montré qu'un régime alimentaire pauvre en folates induit des tumeurs dans les souris BALB/c, mais pas dans la lignée C57BL/6. En plus, une légère déficience en MTHFR (Mthfr+/-) peut augmenter le risque de développer des tumeurs dans les souris BALB/c soumises à un régime alimentaire pauvre en folates. Pour identifier les différences génétiques responsables de la sensibilité tumorale, on a fait une comparaison de l'expression des gènes dans l'intestin des souris BALB/c et C57Bl/6 soumises à un régime alimentaire pauvre en folates, en utilisant des puces à ADN. On a aussi comparé l'expression des gènes dans les intestins prénéoplasiques entre des souris BALB/c Mthfr+/- déficient en folate et des souris BALB/c Mthfr+/+ qui ont un apport suffisant en folates. En utilisant la PCR quantitative en temps réel, nous avons confirmé des changements significatifs dans la voie des rétinoïdes/PPARA (Bcmo1, Aldh1a1, Ppara, Acot1, Cd36, Cyp4a10, Aqp3, Hmgcs2 et Me1) et des variations de l'expression des gènes participant à l'apoptose, la prolifération cellulaire et la réponse immunitaire (Tgfbi, Arntl, Bmp5, Sprr2a, Atf3, Plscr2, Ppme1 et Trem4). Nous avons observé des changements de méthylation cohérents avec les changements de l'ARNm pour Bcmo1, Ppara et Bmp5. Ces observations suggèrent que métabolisme des acides gras, l'activation de PPARA/RXR et la diminution de l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être impliqués dans la transition entre le tissu prénéoplasiques et les adénomes.

Numerical and structural aberrations of chromosome (chr) 3 have been frequently reported in epithelial ovarian cancer (EOC), with non-random losses of 3p consistently observed by karyotype and comparative genomic hybridization analyses. These losses are reported to involve several 3p loci, implying the presence of multiple tumour suppressor genes (TSGs) relevant to the progression of EOC. Both loss of heterozygosity (LOH) analyses of EOC samples and functional complementation assays of chr3 into EOC cell lines support this position. The hypothesis of this thesis states that there is at least one TSG located on 3p that plays a role in a set of high grade serous ovarian cancers (HGOSC), the most common histopathological subtype of EOC. To address this hypothesis, several genetic techniques were used to identify candidate TSGs that map to the 3p arm, including microarray gene expression, LOH, and SNP genotyping analyses. Microarray analyses of HGOSC samples relative to primary cultures of OSE were used to identify 53 genes that were underexpressed on the 3p arm, including two genes that were underexpressed in all HGOSC samples. Decreased expression of these genes did not correlate with LOH of the gene loci, suggesting that these genes were not targeted for biallelic inactivation. To account for the influence of the model system used on the identification of differentially expressed genes in the transcriptome analysis, these results were compared to a chr3 transcriptome map derived from a separate published dataset which utilized a different model system. This analysis identified candidate TSGs on 3p that were robustly underexpressed in both data sets, regardless of the methodology used. To characterize candidate TSGs located within a previously identified region of deletion at 3p26.3-p25.3, the region of deletion was first refined by LOH analyses of a large panel of malignant EOC tumours. Gene expression levels of the candidate TSGs located within the refined region of deletion were characterized and sequence analysis of the genes was performed. LOH analyses of the 3p arm were also performed in a panel of benign ovarian tumours to determine the frequency of 3p loss in the proposed earliest precursor of low grade serous ovarian tumours. As LOH analyses of benign serous tumours did not identify any instances of loss, high-density SNP genotyping analyses were performed on a panel of benign, low malignant potential, low grade and high grade tumours of the serous subtype to identify LOH, regions of homozygosity and homozygous deletions on 3p. This analysis identified few losses of 3p in serous benign and low malignant potential tumours; however, frequent runs of homozygosity on chr3 were observed in these samples. Chr3 aberrations were found to be present in most HGOSC samples. These aberrations did not appear to target specific 3p genes, but recurrent copy number loss and LOH of the 3p arm was observed. Together, these analyses indicate frequent loss of copy number or LOH of the 3p arm in HGOSC samples, in addition to the recurrent underexpression of specific 3p genes, but the rare targeted biallelic inactivation of chr3 genes. Instead, LOH of 3p regions may lower gene dosage levels, resulting in decreased expression of candidate TSGs. Several candidate TSGs may be located on the 3p arm, each of which may act as a tumour suppressor in a subset of HGOSC samples. / Des anomalies numériques et structurelles du chromosome 3 (chr) 3 ont fréquemment été observées dans le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), dont des pertes non aléatoires du bras 3p révélées par des analyses caryotypiques et d'hybridation génomique comparative. Ces pertes ont été rapportées sur plusieurs loci sur le chr3p, laissant supposer la présence de plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs (TSG) concordant avec la progression du CEO. Des analyses de perte d'hétérozygotie (LOH) sur des échantillons de CEO, ainsi que des expériences de complémentation fonctionnelle par transfert du chr3 dans des lignées cellulaires de CEO appuient cette position. L'hypothèse de cette thèse postule qu'il existe au moins un TSG localisé sur le chr3p qui jouerait un rôle dans les carcinomes ovariens séreux de haut grade (COSHG), qui constituent le type histologique le plus représenté du CEO. Les puces SNP de génotypage, les puces ADN pour le profilage d'expression génique et les analyses de LOH ont été utilisées afin d'identifier des TSG candidats présents sur le chr3p. Les analyses des profils d'expression génique des échantillons de COSHG ont permis d'identifier 53 gènes sur le chr3, dont l'expression transcriptionnelle est réprimée comparativement à des cultures primaires de cellules épithéliales de l'ovaire normal. Deux gènes ont montré une répression transcriptionnelle dans tous les échantillons de COSHG étudiés. La régulation négative de l'expression de ces gènes n'a pas été associée avec une LOH de ces loci correspondants, suggérant que ces gènes ne sont pas la cible d'une inactivation biallelique. Afin de prendre en compte l'influence du model utilisé sur l'identification des gènes, ces résultats ont été comparés à un profil d'expression génique du chr3 utilisant un model diffèrent. Cette analyse a identifié des candidats TSG qui ont montré une répression transcriptionnelle robuste et commune dans les deux modèles. Afin de caractériser des candidats TSG présents dans un intervalle de délétion précédemment identifiée dans la région 3p26.3-p25.3, une analyse LOH a été effectuée sur un panel de tumeurs malignes de CEO. Le niveau d'expression des gènes localisés dans cette région de délétion aux frontières redéfinies a été caractérisé et les séquences de ces gènes analysées. Des analyses de LOH sur le chr3p ont également été effectuées dans un panel de tumeurs ovariennes bénignes pour déterminer la fréquence des anomalies qui aboutissent à la perte du bras 3p dans des tumeurs séreuses ovariennes de bas grade, proposées pour en être les plus précoces précurseurs. Les analyses de LOH des tumeurs séreuses bénignes n'ayant pas montré d'exemple de perte chromosomique, la technologie de génotypage à haut-débit a été utilisée sur différentes séries de tumeurs comprenant des tumeurs bénignes, à faible potentiel de malignité, de bas grade et de haut grade de type séreux. Ces analyses ont révélé peu de pertes du chr3p dans les tumeurs bénignes séreuses ainsi que dans les tumeurs à faible potentiel de malignité; cependant, de larges régions homozygotes sur le chr3 ont pu être observées. Des anomalies sur le chr3 ont été trouvées dans la plupart des échantillons de COSHG. Ces anomalies ne semblent pas cibler des gènes spécifiques sur le chr3, mais des LOH et des pertes dans le nombre de copies sont présentes de manières récurrentes. Considérées toutes ensemble, ces analyses révèlent de fréquentes pertes du nombre de copies et des LOH sur le bras 3p dans les échantillons de COSHG, en plus de la répression transcriptionnelle récurrente et spécifique des gènes du chr3, mais soulignent seulement une rare inactivation biallelique de ces gènes. A la place, un évènement de LOH des régions du chr3p pourrait abaisser le dosage génique, engendrant une diminution de l'expression des gènes TSG candidats. Plusieurs candidats TSG pourraient être localisés sur le bras 3p, chacun d'entre eux pouvant agir comme un TSG dans un groupe de COSHG.

This work investigates the molecular basis of three genetic diseases of vitamin B12 metabolism: cblA, cblB and cblC. Two genes responsible for isolated forms of methylmalonic aciduria types cblA and cblB, called MMAA and MMAB respectively, were recently identified. We sequenced the coding sequence and flanking regions of the MMAA and MMAB genes from the gDNA of 37 cblA and 35 cblB patient cell lines and identified 31 novel mutations in total. The biochemical properties of these cell lines were examined in cell culture. Haplotype analysis was used to investigate the history of mutations. The occurrence of both rare and common mutations were identified. Attempts were made to make genotype-phenotype correlations and to understand the effects of mutations on protein function. In the MMAA gene 18 novel mutations were identified, eight of which were common to two or more individuals. One mutation, c.433C>T represented 43% of pathogenic alleles and a common haplotype was identified. Diagnostic tests were designed for every mutation identified. In the MMAB gene, 13 novel mutations were identified. Most mutations were clustered in exon 7. One mutation, c.556C>T accounted for 33% of pathogenic alleles, associated with disease presentation in the first year of life, was observed on a common haplotype and seen almost exclusively in European individuals. We used a combination of linkage, sibling pair, homozygosity mapping and haplotype analyses to refine the disease locus and identify the gene responsible for cblC disease on chromosome 1p called MMACHC. We examined the gDNA of 244 cblC patient cell lines and identified 42 different mutations. The large number of patient samples allowed for the identification of specific genotype phenotype correlations. Of the mutations with elevated frequency in the patients examined, the c.271dupA and c.331C>T mutations were associated with early onset disease whereas c.394C>T was associated with late onset disease. Other missense mutations were also associated with onset of disease later in life. Seven mutations showed clustering by ethnicity. Eight SNPs were identified spanning the gDNA of the MMACHC gene and allowing for the identification of specific haplotypes and the determination of recurrent vs common mutations. Infection of the wild-type MMACHC gene into cblC patient fibroblast cell lines showed correction of the cellular phenotype. Examination of EST databases and northern blot analysis demonstrated MMACHC is ubiquitously expressed in humans with higher levels in fetal liver. Multiple sequence alignment of genomic DNA in eukaryotes and of the polypeptide sequence demonstrated that MMACHC is well conserved in eukaryotes. Two functional domains were identified in the MMACHC gene product by comparison with bacterial genes involved in vitamin B12 related functions: a putative vitamin B 12 binding domain and a TonB-like domain. Molecular modeling demonstrated that the C-terminal region of the gene product folds similarly to TonB from E. coli and suggesting that the C-terminal region of MMACHC may function in a similar manner.

Tourette syndrome (TS) is a childhood-onset neuropsychiatric disorder characterized by multiple motor and one or more phonic tics. TS affects all races and ethnic groups and its prevalence is estimated to be 1% of school children who are 6 to 17 years old. The etiology of this disorder is unknown, but there is strong evidence that supports the involvement of genetic factors. No specific gene unequivocally increasing the risk for TS has been identified. However, positive linkage and association studies, as well as chromosomal anomalies have been reported in the past. The aim of this study was to search for genetic variants associated with TS as a step towards the elucidation of the causes of the disorder. This study represents the first population-based genetic analysis of TS in the French Canadian population, a genetically homogenous group with respect to typical outbred human populations. We found associations between TS and variants in two dopaminergic genes, the dopamine D4 receptor and the Monoamine oxidase genes. Furthermore, we identified a new locus on chromosome 7, flanked by Dock 4 and FoxP2 genes, within a larger region previously suggested as candidate for TS by cytogenetic studies. Our results illustrate the multifactorial etiology of TS in the French Canadian population. It is probable that there is locus heterogeneity for TS even in homogenous populations such as the French Canadians in Quebec, which adds to the complexity of the involvement of non-genetic factors. / Le syndrome Gilles de la Tourette (SGT) est une affection neuropsychiatrique caractérisée par de multiples tics moteurs ainsi qu’un ou plusieurs tics vocaux. Chez les écoliers de 6 à 17 ans, la fréquence de la maladie est estimée à environ 1%. Elle touche tous les groupes ethniques. La cause du syndrome n’est pas connue, mais des facteurs génétiques jouent très probablement un rôle important, même si aucun gène augmentant les risques d’exprimer le SGT n’a encore été identifié formellement. Seules des études de linkage positives ainsi que des anomalies chromosomiques ont pour l’instant été rapportées. La recherche de variants génétiques associés au SGT était le but de cette étude; et ce, dans l’optique d’une meilleure compréhension des causes de cette maladie. Cette étude présente les premières analyses génétiques du SGT basées sur une population précise : les Canadiens-français. La relative homogénéité génétique de ce groupe est un facteur important pour ce type de recherche. Plusieurs variants appartenant à deux gènes dopaminergiques se sont avérés être associés à la maladie chez les Canadiens-français. Ces deux gènes sont le récepteur de dopamine D4 ainsi que le gène de la monoamine oxydase. De plus, nous proposons un nouveau locus sur le chromosome 7 comprenant les gènes Dock4 et FoxP2, dans une région auparavant suggérée par des études cytogénétiques. Les résultats présentés ici illustrent bien les multiples causes du syndrome de Tourette dans la population canadienne-française. L’hétérogénéité des locus est très probable, même dans une population homogène comme c’est le cas ici. Cette hétérogénéité doublée de l’influence de facteurs environnementaux rend les études génétiques beaucoup plus complexes. fr

Germ cells are a totipotent stem cell line where meiosis occurs; without germ cell formation sexual and types of asexual reproduction cannot occur. Drosophila germ cell formation depends on a specialized cytoplasm which is at the posterior of early embryos. The germ plasm in Drosophila contains electron dense structures called polar granules. Similar electron dense structures are found in the germ line of many metazoan species. This thesis examines the polar granule component, TUDOR and its molecular function in Drosophila germ cell formation and polar granule assembly. I created a null allele of tud and found that without TUDOR, embryos are incapable of forming germ cells, while some embryos had normally patterned abdomens. As TUDOR was dispensable for somatic functions but central to germ cell formation, I isolated TUDOR containing complexes from embryos. I then compared the proteins found in my TUDOR complexes to those in VASA complexes to determine which TUDOR complex components are polar granule constituents. I examined five proteins in the TUDOR and VASA complexes, TER94, AUBERGINE, Me31B, eIF4A and Pyruvate Kinase. Reduction of VASA or TUDOR from the early embryo along with TER94, Me31B, eIF4A or AUBERGINE results in a decrease in germ cell formation. As well, TER94, Me31B, eIF4A and AUBERGINE all localize to polar granules. Three of the polar granule components we isolated, Me31B, eIF4A and AUBERGINE, are proteins typical of P bodies, sites of mRNA metabolism, suggesting that polar granules might be related to P bodies specific. Interestingly, immuno-electron micrographs of TER94, an endoplasmic reticulum (ER) component, showed that polar granules can associate with ER. We also show Pyruvate Kinase, a glycolytic protein / Les cellules germinales sont des cellules souches, totipotentes, dans lesquelles se produit la méiose et qui sont nécessaires à la reproduction sexuelle et certains cas de reproduction asexuelle. Chez la drosophile, la formation des cellules germinales est liée à l'assemblage du cytoplasme germinal. Ce cytoplasme distinct contient des granules électron-denses appelées granules polaires. Les études présentées dans cette thèse examinent le rôle de TUDOR, un composant des granules polaires, au cours de l'assemblage des granules polaires et lors de la formation des cellules germinales. J'ai créé un allèle nul de tud qui m'a permis de déterminer que TUD est nécessaire à l'établissement des cellules germinales alors qu'il est partiellement dispensable à la formation de l'abdomen. Due à l'importance de TUDOR durant l'établissement des cellules germinales, j'ai d'isolé le complexe de protéines associées à TUDOR. J'ai comparé les protéines ainsi isolées à celles du complexe de VASA afin d'identifier des composants des granules polaires. J'ai ainsi étudié cinq protéines appartenant aux complexes de TUDOR et VASA soit TER94, AUBERGINE, Me31B, eIF4A et Pyruvate Kinase. La réduction de TUDOR ou de VASA en combinaison avec la réduction de TER94, Me31B, eIF4A ou AUBERGINE cause une baisse dans le nombre de cellules germinales formées. De plus, TER94, Me31B, eIF4A et AUBERGINE sont observés dans les granules polaires. Trois de ces composants soit Me31B, eIF4A et AUBERGINE sont des protéines également trouvées dans les « P-bodies », sites de métabolisme d'ARNm, ce qui suggère que les granules polaires sont un type de « Pbodies ». Des images de microscopie immuno-électronique de TER94, une protéine