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The outcome of Leishmania infection depends both on host and pathogen factors. Macrophages, the specialized host cell for uptake and intracellular development of Leishmania parasites, play a central role in the control of infection. Underlying their effector and accessory functions is the activation of signalling pathways, which in turn are largely controlled by events of protein phosphorylation. Consequently, the regulation of protein kinase and phosphatase activities results critical for the sequential progression of the signalling cascade, and therefore for the control of antimicrobial and inflammatory phagocyte functions. This doctoral thesis discusses novel mechanisms of protein tyrosine phosphatase (PTP) regulation in the context of Leishmania-macrophage interactions. Herein are presented two events in which, independently, host and pathogen factors orchestrate the differential regulation of macrophage PTP activity. Chapter 2 describes the role of NRAMP-1 on macrophage PTP activity modulation. These investigations led to discover that iron, a metal substrate of NRAMP-1, inhibits PTP activity, resulting in the upregulation of leishmanicidal macrophage functions, through the positive regulation of JAK/STAT and MAPK signalling. Furthering these observations, an in depth study of the mechanisms underlying iron-dependent PTP inhibition (presented as Chapter 3), identified mononuclear dicitrate iron citrate complexes as specific PTP inhibitors. Despite the role of macrophages as efficient accessory and effector immune cells, Leishmania has evolved strategies to downregulate host cell functions. This is largely mediated by the parasite-induced activation of macrophage PTPs. In Chapter 4 we identified PTP1B and TCPTP as two novel PTPs engaged upon Leishmania infection. More importantly, we unravel an intimate interaction between the Leishmania surface protease GP63 and host PTPs, revealing a novel mechanism of PTP cleavage-dependent activation. Collectively, / L’issue d’une infection avec Leishmania dépend de la réponse de l’hôte ainsi que des facteurs pathogéniques. Le macrophage, la cellule hôte, est spécialisée dans l’internalisation et le développement intracellulaire du parasite Leishmania et joue un rôle clé dans le contrôle de l’infection. Les fonctions effectrices et accessoires du macrophage proviennent de l’activation des voies signalétiques, qui à leur tour sont largement contrôlées par des événements de phosphorylation de protéines. Donc, la régulation de l’activité des protéines kinases et phosphatases devient essentielle dans la progression séquentielle d’une cascade signalétique et, par conséquent, dans le contrôle des fonctions inflammatoires et antimicrobiales du phagocyte. Cette thèse doctorale propose de nouveaux mécanismes de régulation des protéines tyrosine phosphatases (PTPs) dans le cadre des interactions entre le macrophage et Leishmania. Dans cette étude, nous présentons deux événements dans lesquels des facteurs de l’hôte ainsi que du parasite influencent, de façon indépendante, la régulation différentielle de l’activité PTP du macrophage. Le Chapitre 2 décrit le rôle du NRAMP-1 dans la modulation de l’activité PTP du macrophage. Ces recherches nous ont conduits à découvrir que le fer, un métal substrat du NRAMP-1, inhibe l’activité PTP, ayant comme effet l’augmentation des fonctions leishmanicides du macrophage en régulant de façon positive les voies signalétiques JAK/STAT et MAPK. En plus de ces observations, dans une étude plus approfondi des mécanismes responsables de l’inhibition des PTPs dépendents du fer (présentées dans le Chapitre 3), nous avons identifié les complexes mononucléaires dicitrate fer citrate comme des inhibiteurs spécifiques des PTPs.Malgré le rôle central du macrophage comme cellule accessoire et effectrice du système immunitaire, Leishmania a développé des stratégies afin de ré

Peroxisomes are organelles found in eukaryotic cells where several oxidative processes take place. Enzymes destined for the peroxisome generally contain either a C-terminal or a N-terminal peroxisomal targeting signal, named PTS1 and PTS2 respectively. These signals are cytosolically recognized by their correspondent receptors PEX5 and PEX7 prior to being recruited at the surface of the peroxisomal membrane where the complex docks onto PEX14. Then, enzymes are transported in a natively folded fashion inside the organelle where they are released. In trypanosomatids, other metabolic pathways, including glycolysis, are also segregated in the organelle, which has been renamed the glycosome to better reflect its purpose. To gain a better understanding about this transport and translocation machinery that exist in Leishmania donovani, we have first looked at the quaternary structure of the docking protein LdPEX14, and the implication of several domains on the protein using various biochemical and biophysical techniques. Using gel permeation chromatography, analytical ultracentrifugation and chemical cross-linking, we observed that LdPEX14 was forming large oligomeric structures of varying sized both in solution and within the parasite. By domain mapping studies, we identified three domains on LdPEX14, the LdPEX5 binding site, an hydrophobic region and a predicted leucine zipper, to all being implicated in the formation of such oligomer. Moreover, we investigated the structural changes that take place on LdPEX14 upon binding LdPEX5. Both isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy revealed that the hydrophobic region of LdPEX14 became more exposed to the solvent upon attachment to LdPEX5. Likewise, circular dichroism studies demonstrated that a portion of LdPEX14 was losing some secondary structure upon binding to LdPEX5, which was also linked to the formation of a more compact complex based on analytical ultracentrifugation experiments. We hypothesized that these structural features and conformational changes could be link to the formation of pore that will facilitate the translocation of proteins targeted to the glycosome. Such oligmeric structure was also confirmed by immunoelectron microscopy using parasite sections. LdPEX14 clusters adopted round, rosette-like shapes of about 30-40 nm in diameter and were found mainly at the surface of the glycosomal membrane. A lipidomic investigation of the glycosomal membrane from Leishmania donovani revealed the presence of very long chain polyunsaturated fatty acids, and of a relatively high proportion of the negatively charged phospholipids phosphatidyl glycerol and phosphatidyl inositol. These phospholipids appeared to be essential for a proper membrane attachment of LdPEX14. Domain mapping showed that the hydrophobic region of LdPEX14, comprised between the amino acids 149 and 179, was essential for proper binding to liposomes mimicking the glycosomal membrane phospholipid composition. Bioinformatics analysis revealed that this region also contains a important cluster of basic residues which we hypothesize could be involved in the initial membrane attachment. A further investigation using fluorescence spectroscopy showed that this region was sufficient for binding to liposomes mimicking the glycosomal and was penetrating the lipid bilayer. By performing a dye leakage assay from the liposomes, we observed that ldpex14 (120-200), a peptide comprising the hydrophobic region of LdPEX14, was capable of perforating the liposomes and cause a leakage of the encapsulated dye. Finally, using density flotation assays with liposomes, we demonstrated that not only LdPEX14 was recruting LdPEX5 at the surface of the bilayer, but that LdPEX5, upon attachment, was adopting a conformation similar to integral membrane proteins. This observation tends to suggest that LdPEX5 could also be implicated in the pore formation for the translocation of glycosomal enzymes. / Le peroxysome est un organite où plusieurs procédés oxydatifs prennent place. Les enzymes destinés au peroxysome contiennent un signal peptidique soit à leur terminal C ou N, nommés PTS1 ou PTS2 respectivement. Ce signal est reconnu dans le cytoplasme par son récepteur correspondant (PEX5-PTS1, PEX7-PTS2) où le complexe PTS1-PEX5/PEX7-PTS2 s'arrime à PEX14. Ensuite, les enzymes sont transportés sous leur forme native à l'intérieur de l'organite où ils sont relâchés de leur récepteur. Chez les trypanosomatides, plusieurs voies métaboliques, incluant la glycolyse, sont ségrégées dans l'organite (renommé le glycosome pour refléter la présence d'enzymes glycolytiques). Afin d'obtenir une meilleure compréhension à propos du transport et de la machinerie de translocation existant chez Leishmania donovani, nous avons d'abord déterminé la structure quaternaire, en utilisant diverses techniques biochimiques et biophysiques. En faisant usage de la chromatographie d'exclusion stérique, de l'ultracentrifugation analytique et de la réticulation chimique, nous avons observé que LdPEX14 forme de larges structures oligomériques de taille variable en solution et dans le parasite. En excluant différents domaines sur LdPEX14, nous avons identifiés trois domaines impliqués dans la formation de ces oligomères: (i) le site d'attachement à LdPEX5, (ii) une région hydrophobe et (iii) une glissière à leucine. De plus, nous avons recherché quels étaient les changements structuraux prenant place sur LdPEX14 lors de l'attachement à LdPEX5. En utilisant la calorimétrie isotherme à titration et la spectroscopie de fluorescence, nous avons découvert que la région hydrophobe de LdPEX14 devenait exposée au solvant lorsque LdPEX5 s'y attachait. De plus, des études de dichroïsme circulaire ont démontré qu'une portion de LdPEX14 perdait une partie de sa structure secondaire lors de l'attachement à LdPEX5, ce qui fut aussi relié à la formation d'un complexe LdPEX14-LdPEX5 plus compact, tel qu'illustré par ultracentrifugation analytique. Nous avons donc supposé que ces propriétés structurelles et ces changements de conformation seraient liés à la formation d'un pore qui faciliterait la translocation des protéines dirigées vers le glycosome. La structure oligomérique de LdPEX14 fut aussi confirmée par microscopie immuno-électronique en utilisant des sections de parasite. La protéine LdPEX14 s'assemblait en grappes formant des rosettes d'environ 30 nm de diamètre, principalement à la surface extérieure de la membrane du glycosome. Une étude lipidomique de la membrane du glycosome a révélé une proportion importante de phosphatidyl glycérol et de phosphatidyl inositol, phospholipides chargés négativement. Ces derniers sembleraient essentiels pour l'attachement de LdPEX14 à la membrane du glycosome. Nous avons ensuite démontré que la région hydrophobe de LdPEX14, comprise entre les acides aminés 149 et 179, était essentielle pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome. Une investigation plus poussée, utilisant la spectroscopie de fluorescence, a montré que cette région était suffisante pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome, et était de plus capable de pénétrer cette membrane. En effectuant un test d'écoulement de colorant fluorescent encapsulé dans les liposomes, nous avons observé que ldpex14(120-200), un peptide comprenant la région hydrophobe de LdPEX14, était capable de perforer les liposomes et causer un écoulement du colorant fluorescent. Finalement, en utilisant des tests de flottaison par densité différentielle avec des liposomes, nous avons démontré que non seulement LdPEX14 est capable de recruter LdPEX5 à la surface des liposomes, mais que LdPEX5 finissaient par adopter une conformation semblable à une protéine membranaire intégrale. Cette observation tend à suggérer que LdPEX5 pour elle aussi être impliquée dans la formation d'un pore pour la translocation d'enzymes destinés pour le glycosome.

Macrocyclic lactone (ML) resistance has been described in the parasitic nematode, Haemonchus contortus. One of the mechanisms involved could be the over expression of P-glycoproteins (Pgps) which are ABC transporters. These proteins may influence the concentration of MLs that reach their target. In H. contortus one ABC transporter that is overexpressed in ML resistant parasites is Pgp-A (HcPgp-A). The goal of this project was the expression of HcPgp-A, in transfected LLC-PK1 cells, and to see the effect of ivermectin and moxidectin on inhibition of rhodamine 123 transport by the transfected cells. Rhodamine123 was actively transported by HcPgp-A. Ivermectin was four fold more potent at inhibiting rhodamine 123 transport by HcPgp-A than was moxidectin. The work provides the first information showing that MLs can inhibit the transport of Pgp substrates by a parasitic nematode ABC transporter and may indicate an active role for H. contortus Ppgs in ML resistance. / La résistance aux lactones macrocycliques (LM) est bien connue chez le parasite nématode Haemonchus contortus. La surexpression de P-glycoprotéines (Pgp), qui sont des ABC transporteurs, pourrait être impliquée dans un des mécanismes de la résistance aux LM. Ces protéines peuvent influencer la concentration de LM qui atteint leur cible. Pgp-A (HcPgp-A) est un ABC transporteur d' H. contortus qui est surexprimé chez les parasites résistants aux LM. Le but de cette étude était d'exprimer la P-glycoprotéine-A d'H. contortus dans des cellules transfectées LLC-PK1 afin d'évaluer les effets de l'ivermectine et de la moxidectine sur l'inhibition du transport de la rhodamine 123. La rhodamine 123 s'est avérée être transportée activement par HcPgp-A. Les effets de l'ivermectine sur l'inhibition du transport de la rhodamine 123 par HcPgp-A étaient quatre fois plus importants que ceux de la moxidectine. L'étude a montré pour la première fois que les LM pouvaient inhiber le transport des substrats de la P-glycoprotéine grâce à un ABC transporteur d'un nématode parasite. Cette information pourrait indiquer un rôle actif des Pgps d'H. contortus dans la résistance aux LM.

Ivermectin has been a very useful drug for the control of diseases caused by helminths. However, the occurrence of drug resistant parasites is a major concern. In an attempt to mimic the conditions under which ivermectin resistance is selected for in the field, James and Davey (2009) generated the IVR6 and IVR10 Caenorhabditis elegans strains from a wild-type strain by growing them in the presence of sub-lethal doses of ivermectin for several generations. To better understand the mechanisms by which ivermectin resistance might arise, I have investigated the IVR6 and IVR10 strains. I found that the IVR6 and IVR10 strains are dye-filling defective (Dyf), a phenotype previously associated with ivermectin resistance. Our results indicate that IVR6 and IVR10 have the same level of ivermectin resistance. We discovered a frame shift mutation in the dyf-7 gene of both strains. The location of dyf-7 on the X-chromosome is consistent with the results of our resistance mapping experiment. IVR6 and IVR10's dye-filling phenotype is roughly 80% penetrant and we show that ivermectin can select for the phenotype. Only dye-filling defective worms can grow at 10 ng/ml ivermectin. We have tested four other dye-filling defective strains, including a strain carrying a mutant dyf-7 allele and all were ivermectin resistant. Preliminary results indicate that dyf-7 confers levamisole resistance, suggesting an alternate mechanism for multidrug resistance. Taken together, my results show that an allele of the dyf-7 gene is the cause of ivermectin resistance in the IVR6 and IVR10 strains and that the dendrite morphology phenotype of Dyf genes is essential for their ability to confer resistance. / L'Ivermectine est un médicament qui a été très utile pour contrôler des maladies causées par les nématodes parasitiques. Cependant, le développement chez les parasites d'une résistance à ce médicament reste inquiétant. Ainsi, en reproduisant les conditions dans lesquelles les parasites développent une résistance à l'ivermectine, James et Davey (2009) ont généré deux souches de Caenorhabditis elegans, l'IVR6 et l'IVR10, en les cultivant sur une dose non-létale pour quelques générations. Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de la résistance à l'ivermectine, j'ai étudié les souches d'IVR6 et d'IVR10. J'ai découvert que celles-ci sont déficientes en absorption de teinture, soit un phénotype associé à la résistance à l'ivermectine. Les résultats obtenus présentaient le même niveau de résistance pour les deux souches. De plus, nous avons découvert une mutation dans le gène dyf-7, aussi chez les deux souches. L'usage de la cartographie génétique qui utilise les polymorphismes pour un nucléotide (SNPs), m'a permis de déterminer que le locus de résistance est en accord avec le locus de dyf-7. Le phénotype de déficience d'absorption de teinture est pénétrant à 80% chez l'IVR6 et l'IVR10. Quant à l'ivermectine, celui-ci peut sélectionner pour ce phénotype. Seulement les vers déficients en absorption de teinture peuvent survivre sur 10 ng/ml d'ivermectine. J'ai examiné quatre autres souches qui sont déficientes en absorption de teinte, incluant une souche avec un allèle différent de dyf-7; elles démontrent toutes une résistance à l'ivermectine. Des expériences préliminaires indiquent que le dyf-7 induit une résistance à un autre médicament, lévamisole. Ce qui me suggère un nouveau moyen de développer la multirésistance. Pris dans leur ensemble, mes résultats montrent que l'allèle du gène dyf-7 est la cause de la résistance à l'ivermectine chez les souches d'IVR6 et d'IVR10 et que la malformation des dendrites chez les souches Dyf est essentielle au développement de la résistance.

Among the top list of neglected tropical diseases sits schistosomiasis, a parasitic disease caused by the flatworm Schistosoma. The disease involves an intermediate snail host and the definitive human host with infection taking place through the skin in contaminated water, one of the reasons for its wide distribution. The diversity of the life cycle stages and the ability of the parasite to have adapted to quite different environments speak to the complexity of the organism. The underlying system that coordinates and controls all biological functions of the parasite is its nervous system. Signalling in the nervous system is accomplished by the release of neurotransmitters and signal transduction through specific receptors. Of the many neurotransmitters identified thus far in the parasite, serotonin (5-hydroxytryptamine: 5HT) is one of the most abundant. 5HT has been implicated in several biological functions in flatworms, including muscle contraction, motility and metabolism, but its mode of action is poorly understood. Here we provide molecular evidence for a serotonin-specific transporter (SERT) in Schistosoma mansoni as well as a serotonin specific receptor in the same organism. The transporter (SmSERT) was shown to share similar topology to SERTs from other organisms, namely 12 transmembrane regions with several predicted glycosylation sites. In a heterologous expression system, we show that it mediates the uptake of serotonin in a dose-dependent manner and is responsive to classical SERT inhibitors. The transporter is expressed in all life cycle stages tested (cercaria, schistosomulum, and adult) with upregulation occurring in the parasitic stages. Immunolocalization studies showed that the protein is expressed primarily in the nervous system of the parasite, both in central and peripheral neuronal structures. Using RNA interference (RNAi) to knockdown expression, we found strong increases in motility, suggesting that its primary function is in termination of serotonin signalling. The serotonin receptor (Sm5HTr) is the first as such cloned from parasitic flatworms. It shares homology with other 5HT receptors and most closely identifies with the 5HT7 class of receptors. Expression in mammalian cells found that it signals through upregulation of cAMP and not Ca2+. Immunolocalization in adults and larvae found that the receptor is enriched in the central and peripheral nervous system. Additional pharmacological assays using Sm5HTr agonists and antagonists suggest that the receptor may contribute to 5HT-induced stimulation of worm motility. Combined, these results show that there is a fully functional serotonergic system in the parasite S. mansoni and that these proteins play an important role in controlling signal transduction. The wide distribution of these proteins in the parasite nervous system and their apparent involvement in motor control makes them tempting targets for drug design. / Parmi la liste du haut des maladies tropicales négligées est assis la schistosomiase, une maladie parasitaire causée par le Schistosoma. La maladie implique un mollusque intermédiaires et hôte définitif de l'homme avec une infection en cours à travers la peau dans l'eau contaminée, l'une des raisons de sa large diffusion. La diversité des étapes du cycle de vie et de la capacité du parasite à avoir adapté à des environnements très différents parlent de la complexité de l'organisme. Le système sous-jacent qui coordonne et contrôle toutes les fonctions biologiques du parasite est son système nerveux. Signalisation dans le système nerveux est accompli par la libération des neurotransmetteurs et transduction du signal par récepteurs spécifiques. Parmi des nombreux neurotransmetteurs identifiés jusqu'à présent dans le parasite, la sérotonine (5-hydroxytryptamine : 5-HT) est l'un des plus abondants. 5HT a été impliqué dans plusieurs fonctions biologiques dans les vers plats, notamment contraction musculaire, la motilité et le métabolisme, mais son mode d'action est mal comprise. Ici nous fournir preuve moléculaire d'une transporteur de la sérotonine spécifique (SERT) au Schistosoma mansoni ainsi qu'un récepteur de la sérotonine spécifique dans le même organisme. Le transporteur (SmSERT) a été montré à partager la même topologie à SERT provenant d'autres organismes, à savoir 12 régions transmembranaire avec plusieurs sites de glycosylation prédits. Dans une expression hétérologue système, nous montrons qu'il négocie l'absorption de la sérotonine de manière dose-dépendante et est sensible aux inhibiteurs de SERT classiques. Le transporteur est exprimé dans toutes les étapes du cycle de vie testé (cercaria, schistosomula et adulte) avec regulation à la hausse survenant dans les stades parasitaires. Études immunolocalisation ont montré que la protéine est exprimée principalement dans le système nerveux du parasite, à la fois central et périphérique dans les structures neuronales. L'interférence ARN (ARNi) de rabattement d'expression, nous avons trouvé une forte augmentation de la motilité, suggérant que sa fonction principale est en cessation de signalisation de la sérotonine. Le récepteur de la sérotonine (Sm5htr) est le premier en tant que telle cloné à partir de vers plats parasitaires. Il partage homologie avec d'autres récepteurs 5HT et plus étroitement s'identifie à la classe des récepteurs 5-HT7. Expression dans des cellules de mammifères a constaté qu'il signale une regulation positive de l'AMPc et non de Ca2+. Immunolocalisation chez les adultes et les larves découvert que le récepteur est enrichi dans le système nerveux central et périphérique. D'autres essais pharmacologiques utilisant des agonistes et antagonistes suggèrent que le récepteur peut contribuer à la stimulation de la motilité du ver induite par la 5HT. Ensemble, ces résultats montrent qu'il existe un système sérotoninergique pleinement fonctionnel dans le parasite S. mansoni et que ces protéines jouent un rôle important dans le contrôle transduction du signal. La large diffusion de ces protéines dans le parasite système nerveux et leur implication apparente de commande de moteur fait d'eux des cibles tentantes dans la conception des médicaments.

The obligate intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is a highly ubiquitous pathogen that infects virtually any warm-blooded animal. Although the infection generally remains asymptomatic in healthy individuals, the parasite invariably encysts. It has been shown that T. gondii is able to achieve this goal at least by interfering with MHC-II antigen presentation to dampen the development of the CD4+ T helper cell response and gain a head start on the host adaptive immune system. Previous reports have shown that T. gondii inhibits transcription of MHC-II and several other related genes, but the causative inhibitory molecules have yet to be identified.In an attempt to identify these molecules, a forward genetic screening strategy was initially elaborated, with a genome-wide insertional mutagenesis carried out in order to disrupt the genes encoding for the inhibitory molecules followed. By specifically isolating mutants unable to inhibit MHC-II expression and antigen presentation by flow cytometry, isolation of the disrupted loci and database mining could have enabled the identification by of the encoded inhibitory molecules. However, the screen was not carried out due to experimental limitations.Biochemical analyses were employed to further characterize the MHC-II inhibitory activity, revealing that this activity segregated with the high-speed supernatant (HSS) prepared from sonicated parasites and was enriched with increasing centrifugal speeds. The inhibitory activity was protein dose-dependent and was completely abrogated when the HSS was treated with a broad-spectrum protease. Subcellular fractionation revealed that the inhibitory activity was found in fractions enriched with secretory organelles, specifically rhoptries (ROP) and/or dense granules (GRA). Furthermore, excreted-secreted antigens (ESA) from freshly egressed tachyzoites displayed inhibitory activity. Proteins from ESA preparations were separated by a two-step fractionation using ion exchange chromatography followed size-exclusion chromatography, and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Database mining of the MS/MS results generated a list of possible candidates, the majority of which originated from secretory organelles.Although MHC-II expression was inhibited, low levels of MHC-II molecules were still detected in infected or lysate-treated cells. Experimental results argued that the first layer of transcriptional regulation has to be complemented by a post-translational layer of interference in the host cell endocytic pathway, involving the MHC-II associated invariant chain (Ii), and peptide editor H2-DM. Ii mRNA and protein levels were induced in T. gondii-infected cells, while MHC-II and H2-DM IFN-induced expression was down-regulated. Ii accumulated in infected cells from 20 hour post-infection until host cell lysis, mainly in the ER. In Ii KO cells, the absence of Ii restored the ability of infected bone marrow-derived dendritic cells to present a parasite antigen in the context of MHC-II, arguing that Ii acts as a dominant negative on MHC-II-restricted antigen presentation of endogenously acquired parasite antigens. Keys host proteases, namely legumain, and cathepsins L and S, and the acidification of endosomal compartments were modulated by the parasite, pointing toward a wider manipulation of the host endocytic pathway by T. gondii. Opposing expression patterns of Ii and H2-DM had a drastic effect in vivo not only on parasite dissemination towards lymphoid organs, CD4+ T cell activation, and IFNγ production during acute infection, but also on cyst numbers and survival at the chronic phase of the infection. Altogether, these findings reveal a broader manipulation of host cell processes by T. gondii, and shed new light on the intricate interactions between intracellular pathogens and host cells, and their ability to subvert immune functions to establish successful infections. / Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii, l'agent causant la toxoplasmose, est un pathogène ubiquitaire capable d'infecter tout animal à sang chaud. En dépit du fait que l'infection reste généralement asymptomatique chez les individus en bonne santé, le parasite s'enkyste inévitablement. Il a été démontré que T. gondii est capable d'atteindre ce but en partie en interférant avec la présentation d'antigène par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH)-II pour diminuer le développement de la réponse des cellules T CD4+ et pour ainsi devancer la réponse adaptative du système immunitaire. Il a été démontré que T. gondii inhibe la transcription de CMH-II et autres gènes liés, mais les molécules inhibitrices causatives restent inconnues.Pour identifier ces molécules, une stratégie pour un criblage génétique avait été élaborée. Une mutagénèse insertionelle à travers le génome devait être conduite pour perturber les gènes codant pour ces molécules inhibitrices, suivie d'un tri par cytométrie en flux de cellules infectées avec des mutants. En isolant les mutants incapables d'inhiber l'expression de CMH-II, l'isolement des locus génétiques et l'exploration des bases de données auraient pu permettre l'identification des molécules codées. Cependant, ce criblage ne fut complété dû à des limitations expérimentales. Des analyses biochimiques ont démontré que l'activité inhibitrice se retrouvait dans le surnageant d'haute-vitesse (HSS) préparé à partir de parasites soniqués, et était enrichie avec des vitesses de centrifugation croissantes. L'activité inhibitrice était dose-dépendante de protéines et était complètement abrogée lorsque le SHV était préalablement traité avec une protéase. Un fractionnement subcellulaire révéla que l'activité se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires (rhoptries et granules denses). Aussi, des antigènes excrétés-sécrétés (ESA) obtenus de tachyzoïtes fraîchement lysés possédaient une activité inhibitrice. Les protéines d'ESA furent séparées par fractionnement en deux étapes, commençant par une chromatographie par échange d'ions, suivi par une chromatographie d'exclusion par taille et analysées par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Les résultats obtenus furent comparés aux bases de données, et une liste fut dressée avec de candidats potentiels, la majorité d'entre eux provenant d'organelles de sécrétion.Malgré l'expression réduite, quelques molécules de CMH-II étaient détectés dans les cellules infectées ou traitées. Nos résultats démontrent que la régulation transcriptionelle doit être complémentée par une interférence au niveau post-traductionel dans la voie endocytique de la cellule hôte qui implique la chaîne invariante associée au CMH-II (Ii) et l'éditeur de peptide H2-DM. Les niveaux d'ARNm et de protéines d'Ii étaient induits dans les cellules infectées, alors que ceux de CMH-II et d'H2-DM étaient inhibés. Ii s'accumulait dans les cellules infectées dès 20 heures post-infection, principalement dans le RE. Dans les cellules Ii KO, l'absence d'Ii rétablit la capacité de cellules dendritiques à présenter un antigène du parasite dans le contexte de CMH-II, proposant ainsi qu'Ii agit comme un dominant négatif sur la présentation d'antigènes endogènes provenant du parasite. Des protéases de l'hôte (légumaine, cathepsines L et S) et l'acidification des compartiments endosomaux étaient modulées par le parasite, révélant une manipulation plus étendue de la voie endocytique. Les modes d'expression opposés d'Ii et H2-DM avaient un effet in vivo sur la dissémination des parasites vers des organes lymphoïdes, l'activation des cellules T CD4+, la production d'IFN, le nombre de kystes et la survie. Collectivement, nos résultats montrent l'étendue des processus de manipulation par T. gondii, révélant de complexes interactions avec l'hôte et sa capacité de subvertir les fonctions immunitaires pour établir une infection chronique.

Most mitochondrial mRNAs in trypanosomatid parasites require uridine insertion/deletion RNA editing, a process mediated by guide RNA (gRNA) and catalyzed by multi-protein complexes called editosomes. The research presented in this thesis began at a time when many of the proteins in the editosome complexes and some of their functions and interactions had been identified. However, little was known about how these proteins assemble and work together. Recent studies have established that the six oligonucleotide/ oligosaccharide binding (OB)-fold proteins (KREPA1-A6), are a part of the common core of editosomes where they form a network of interactions essential for the stability of the editosomes and some of them also bind the substrate RNA. This thesis explores the RNA and protein interactions of an OB-fold protein KREPA4 to gain better understanding of its role in the structural and functional organization of editosomes. KREPA4 is an RNA binding protein essential for the integrity of editosome complex and survival of Trypanosoma brucei. Recombinant KREPA4 binds to gRNA with a preference for the gRNA 3ʹ oligo(U) tail. The only other protein, with which KREPA4 is currently known to have a direct interaction, is another OB-fold protein, KREPA6. KREPA4 has two predicted low compositional complexity regions (LCRs) at its N-terminus, besides the predicted OB-fold domain at the C-terminal end. Different parts of one or both of these regions may be involved in the RNA and protein interactions of KREPA4 within the editosome complex, and these possibilities have been investigated in this thesis. In the first part of the thesis, I examined the gRNA binding properties of KREPA4. To map the RNA-binding domain, I created deletion mutants of KREPA4, and evaluated their gRNA-binding affinities as well as specificities by gel shift RNA binding and competition experiments. My results demonstrate that the predicted C-terminal OB-fold of KREPA4 is responsible for high-affinity binding of this protein to gRNA via interaction with the gRNA oligo(U) tail. I also show that the stem-loop structure of gRNA contributes to the affinity and specificity of KREPA4-RNA interaction by binding to the N-terminal LCRs of KREPA4. Furthermore, I tested KREPA4 for the presence of a possible RNA annealing activity and found the annealing function to be associated with the predicted OB-fold, representing the first report of such activity for a core component of the RNA editing complex. The second part of this thesis is devoted to a study characterizing the protein interaction interfaces of KREPA4 in the editosome complex. By screening a series of N- and C-terminally truncated KREPA4 fragments, I determined that a predicted α-helix of KREPA4 OB-fold is required for its interaction with KREPA6. An antibody against the KREPA4 α-helix or mutations of this region can eliminate association with KREPA6; while a peptide fragment corresponding to the α-helix can independently interact with KREPA6, thereby supporting the identification of KREPA4-KREPA6 interface. I also established that the predicted OB-fold of KREPA4; independent of its interaction with gRNA, is responsible for the stable integration of KREPA4 in the editosomes, and editing complexes co-purified with the tagged OB-fold can catalyze RNA editing. Therefore, while KREPA4 interacts with KREPA6 through the α-helix region of its OB-fold, the entire OB-fold is required for its integration in the functional editosome, possibly through additional protein-protein interactions. Overall, these studies have lead to the identification and characterization of RNA binding and protein interaction interfaces of KREPA4, and also revealed the RNA annealing function of this protein. Therefore, this work provides new insight into the possible molecular interactions of KREPA4 within the editosome, thus contributing significantly to the emerging picture of the structural and functional organization of the editosome complex. / La plupart des ARN messager mitochondriaux dans les parasites de la famille des trypanosomatides nécessite l'édition de l'ARN par insertion ou délétion de l'uridine, un processus médié par l'ARN guide (ARNg) et catalyser par des complexes multi protéiques appelés éditosomes. De récentes études ont montré que les six protéines de liaison oligonucleotide/oligosaccharide (KREPA1-A6), font partie du même groupe d'éditosome où ils forment un réseau d'interactions essentiels pour la stabilité des éditosomes. Certains de ces éditosomes s'associent aussi à l'ARN. Cette thèse explore l'interaction ARN-protéine de la protéine de liaison OB, KREPA4, pour obtenir une meilleure compréhension de son rôle dans l'organisation structurelle et fonctionnelle des éditosomes. KREPA4 est une protéine de liaison à l'ARN, essentielle pour l'intégrité du complexe d'éditosome et pour la survie du parasite Trypanosoma brucei. La protéine recombinante KREPA4 se lie à l'ARNg avec une préférence pour la queue oligo (U) à l'extrémité 3' de l'ARNg. La seule autre protéine présentement connu comme ayant une interaction directe avec KREPA4, est une autre protéine de liaison OB, KREPA6. KREPA4 possède à son extrémité N-terminale, deux régions de basse complexité (LCRs) prédites en plus du domaine de liaison OB à son extrémité C-terminale. Différentes parties d'une ou de deux de ces régions pourraient être impliqué dans les interactions de KREPA4 à l'ARN et à la protéine au sein du complexe d'éditosome. Dans la première partie de cette thèse, Je présente une étude examinant les propriétés de liaison à l'ARNg de la protéine KREPA4. Afin de cartographier le domaine de liaison à l'ARN, nous avons créé des mutants de délétion de la protéine KREPA4 et évalué leur affinité de liaison à l'ARNg ainsi que leur spécificité par des expériences de compétitions ou de retard sur gel. Nos résultats ont montrés que le domaine prédit à l'extrémité C-terminale OB de la protéine KREPA4 est responsable de la forte affinité de liaison de cette protéine à l'ARNg via l'interaction avec la queue oligo (U) de l'ARNg. Nous avons aussi montré que la structure en tige-boucle de l'ARNg contribue à l'affinité et à la spécificité de l'interaction entre KREPA4 et l'ARN par la liaison aux LCRs de l'extrémité N-terminale de KREPA4. De plus, nous avons testé KREPA4 pour la présence d'une possible activité d'annelation et nous avons trouvé la fonction d'annelation qui est associe avec le domaine prédit OB, ce qui représente le premier rapport d'une telle activité pour un composant essentiel du complexe d'édition de l'ARN. La deuxième partie de cette thèse est consacrée à une étude caractérisant des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4 dans le complexe d'éditosome. Nous avons déterminé qu'une α-hélice prédite du domaine prédit OB de KREPA4 est nécessaire pour son interaction avec KREPA6. Un anticorps ciblant l'α-hélice de KREPA4 ou les mutations de cette région peut éliminer son association avec KREPA6, alors qu'un fragment peptidique correspondant à l'α-hélice peut interagir indépendamment avec KREPA6, supportant ainsi l'identification de l'interface KREPA4-KREPA6. Nous avons également établi que le domaine OB prédit de KREPA4, indépendant de son interaction avec ARNg, est responsable de l'intégration stable de KREPA4 dans les éditosomes. Par conséquent, si KREPA4 interagit avec KREPA6 dans la région α-hélice de son domaine OB, l'ensemble du domaine OB est nécessaire pour son intégration dans un éditosome fonctionnelle, possiblement par le biais d'interactions protéine-protéine additionnelles. Dans l'ensemble, ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de la liaison des ARNs et des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4, et a également révélé la fonction d'annelation d'ARN de cette protéine. Par conséquent, ce travail offre une nouvelle perspective sur les interactions moléculaires possibles de KREPA4 dans l'éditosome.

Background: Although growth stunting, height for age Z score (HAZ) <-2SD, results from sustained poor diet and frequent infection both of which are influenced by social and biophysical factors, few studies have used a transdisciplinary ecohealth framework for a comprehensive analysis of this relationship. Objective: To examine the interrelationships between preschool child stunting and gastrointestinal infections within the biophysical, social and spatial context of extreme poverty among the Ngäbe in Western Panama where conditional food voucher (FV) and cash transfer (CT) programs occurred. Methods: A 16-mo longitudinal study of 356 preschool children involved two reinfection cycles following albendazole treatment. Data collection included repeated fecal samples, household socio-behavioural questionnaires, multiple dietary records and anthropometric measures, water samples, GPS and participatory workshops. An asset-based household wealth index (HW), an index of household dispersion (HD), index of chronicity of diarrhea (CDI) and protozoan infection (CPI), and dietary pattern scores were generated and incorporated into spatial cluster analysis and multiple regression models of anthropometric and infection outcomes. Influence diagrams created during small group workshops identified participant perceptions of health. Results: Households with higher HWI had a latrine, aqueduct access, cell phone, and/or stove and HD ranged from 5–113 households/km2. High prevalence clusters of hookworm and Trichuris (but not Ascaris) occurred in regions with lowest HWI and HD. Ascaris and hookworm reinfection was driven by individual susceptibility traits (stunting) whereas Trichuris reinfection was dependent on household (maternal education) and regional (high prevalence cluster) characteristics. The high frequency of diarrhea was consistent with community perceptions of health priorities and of the link between diarrhea and poor water quality. Both E. coli counts and CDI were higher in households without aqueduct access. Sixty percent of children were stunted and 22% were underweight. The detrimental effect of CPI on HAZ was driven by household density but moderated by household wealth. Diet also influenced growth. The basic diet (rice, beans, coffee, sugar) was supplemented with fruits and vegetables (FV region) or market snacks (CT region). A "Market" diet pattern was concentrated in the CT region close to the road. Meat was beneficial for linear growth but only in the FV region whereas carbohydrates (sweets in FV region and root vegetables in CT region) were detrimental, even after controlling for infection and socio-economic status. With regard to weight gain, fish and eggs were beneficial in the FV region whereas, in the CT region, milk products were beneficial, but chips and sweets were detrimental. Implications: This transdisciplinary research highlighted key public health messages necessary to improve growth and reduce infection in this vulnerable population. / Contexte: Le retard de croissance, correspondant à une valeur centrée réduite (z-score) de la taille par rapport à l'âge (ZTA) inférieur à deux écarts type, découle d'une diète pauvre et d'infections fréquentes qui sont influencées par des facteurs sociaux et biophysiques. Seulement peu d'études ont utilisé une approche multidisciplinaire santé-écologie pour analyser la relation entre ces facteurs et la fréquence des arrêt de croissance. Objectif: Examiner les relations entre le retard de croissance chez les enfants en âge préscolaire et les infections gastro-intestinales avec le contexte social, biophysique et spatial dans des conditions de pauvreté extrêmes chez les peoples Ngabe de l'ouest du Panamá, où prennent place des programmes d'aide alimentaire (AA) et de transfert monétaire (TM). Méthodes: Dans le carde d'une étude de 16 mois, nous avons suivi 356 enfants d'âge préscolaire impliqués dans deux cycles de réinfections à la suite d'un traitement à l'albendazole. Les données recueillies inclues des échantillons répétés de matière fécale, questionnaires sur les comportements sociaux des ménages, journaux alimentaires et mesures anthropométriques, échantillons d'eau, données de système de localisation GPS et ateliers participatifs. Des indices de richesse des ménages (IRM) basé sur le patrimoine, de dispersion des ménages (IDM), de chronicité des la diarrhée (ICD) et de l'infection aux protozoaires (CIP), et une note sur les habitude alimentaires ont été calculés. Ces indices ont été inclus dans une analyse spatiale de regroupement et des analyses de régression linéaire multiple pour prédire les mesures anthropométriques et le résultat des infections. Les diagrammes d'influence créés durant les ateliers ont permis d'évaluer les perceptions des participants par rapport à la santé. Résultats Les ménages avec les IRM élevés avaient une toilette, l'accès à l'aqueduc, un téléphone cellulaire et/ou un poêle. Leur IDM variait de 5-113 ménages/km2. Des regroupements de prévalence d'ankylostome et de Trichuris (mais pas d'Ascaris) étaient présents dans les régions avec les IRM et les IDM les plus faibles. Les réinfections par Ascaris et par des ankylostomes étaient influencées par des traits de sensibilité personnelle (retard de croissance): la réinfection par Trichuris dépendait des caractéristiques du ménage (éducation maternelle) et de la région (regroupement de prévalence élevée). La fréquence élevé de diarrhée correspondait avec la perception de la communauté sur les priorité en matière de santé et avec la mauvaise qualité des eaux. Les dénombrements d'E. coli et le ICD étaient plus élevés dans les ménages qui n'avaient pas accès à l'aqueduc. Soixante-six pour cent des enfants étaient atteints d'arrêt de croissance et 22% souffraient d'insuffisance pondérale. L'effet nuisible de la CIP sur la ZTA était principalement influencé par la densité de ménage mais aussi par le patrimoine du ménage. Le régime alimentaire avait aussi un effet sur la croissance. Le régime de base (riz, haricots, café, sucre) était complété avec des fruits et des légumes (région AA) ou des friandises du marché (région TM). Un régime « du marché » était concentré dans la région TM proche de la route. La présence de viande avait un effet bénéfique sur la croissance linéaire seulement dans la région AA alors que les glucides (sucreries dans la région AA et légumes racines dans le région TM) avait un effet néfaste, même en tenant compte des infections et du statut socio-économique. Le poisson et les œufs avaient un effet bénéfique sur le gain de masse corporelle dans la région AA. Dans la région TM, les produits laitiers avait un effet bénéfique sur la prise de masse alors que les croustilles et les sucreries avaient un effet néfaste. Implications: Cette étude multidisciplinaire souligne des messages important en santé publique pour améliorer la croissance et diminuer les infections dans cette population vulnérable.