Paramyxoviruses, such as measles virus, are among the most infectious viral pathogens of humans and animals. Paramyxovirus outbreaks in naïve populations can be devastating. Vaccines exist for some agents, but coverage is not always sufficient to protect communities. Vitamin A can significantly decrease measles-associated morbidity and mortality. The underlying mechanism of this beneficial effect is not well defined. Vitamin A can inhibit the replication of measles virus (MeV) in vitro through an RARα- and type I interferon (IFN)-dependent mechanism. Retinoid-induced gene I (RIG-I) expression can be induced by retinoids, is activated by MeV RNA and is important for IFN signalling. The findings presented herein demonstrate that retinoid signalling acts in combination with IFN to induce high levels of RIG-I expression. This activation is due to transcriptional regulation of the RIG-I promoter by both retinoids and MeV. RIG-I is required for the retinoid-MeV antiviral response and its induction is dependent on both IFN and IRF-1. The in vitro antiviral activity of vitamin A (retinoids) is not limited to MeV. It is likely that viruses recognized by RIG-I will be susceptible to vitamin A inhibition. Mumps virus (MuV) is another highly infectious paramyxovirus that continues to cause outbreaks despite the availability of a vaccine. There is no current treatment for mumps. We have now shown that retinoids inhibit MuV replication in uninfected bystander cells through a RARα, IFN and RIG-I dependent manner making them refractory to subsequent rounds of viral replication and infection. Further, this antiviral response is virus non-specific and short-lived. However, mumps virus isolates that can inhibit type I IFN pathways are able to circumvent the retinoid antiviral response. / Les Paramyxoviridaes, comme les virus de la rougeole (MeV), sont parmi les virus les plus infectieux pour les humains et les animaux. Une épidémie dans une population naïve peut être dévastatrice. Plusieurs vaccins existent, mais leur couverture n'est pas toujours suffisante pour protéger les communautés. La vitamine A peut, de façon significative, baisser la morbidité et la mortalité associées à la rougeole. Le mécanisme sous-jacent de cet effet bénéfice n'est pas encore bien défini. La vitamine A peut inhiber la réplication du virus de la rougeole (MeV) in vitro en utilisant un mécanisme dépendant du RARα et d'un interféron de type 1. L'expression du Retinoid Induced Gene I (RIG-I) peut être induite par des rétinoïdes qui sont activés par le RNA du MeV et est important pour le signalement IFN. Les résultats présentés ici démontrent que le signalement des rétinoïdes agi en tandem avec l'IFN pour induire de hauts niveaux d'expression de RIG-I. Cette activation prend place grâce à la régulation transcriptionnelle de l'adjuvant RIG-I par les rétinoïdes ainsi que le MeV. Ces résultats indiquent que le traitement des rétinoïdes et du MeV induisent un niveau significatif de RIG-I qui est un élément requis pour la réponse antivirale du rétinoïde-MeV. L'induction est dépendante de l'IFN, des rétinoïdes et de l'IRF-1.La vitamine A peut inhiber, in vitro, certains virus, comme le MeV. Il est fort probable que les virus reconnus par RIG-I seront susceptibles d'être inhiber par la vitamine A. Le virus des oreillons (MuV) est un paramyxovirus très infectieux. Malgré la disponibilité d'un vaccin, les épidémies de MuV sont régulières et sans traitement. Les rétinoïdes inhibent la réplication de MuV dans les cellules spectatrices non-infectées en utilisant le RARα, l'IFN ainsi que le RIG-I, les rendant ainsi réfractaires aux prochaines réplications et infections virales. Cette réponse antivirale est de courte durée et n'est pas précise à un certain virus. De plus, les virus qui ont la capacité d'inhiber les voies d'IFN de type 1 sont aussi capables de contourner la réponse antivirale des rétinoïdes.

The HIV-1 RNA genome encodes the main structural polyprotein Gag, Gag/Pol (structural proteins and enzymes), auxiliary (Vpr, Vpu, Vif) and regulatory proteins (Tat, Rev, Nef). The expression of the full complement of viral gene products enhances both the replication and the pathogenic potential of the virus. In our previous work we showed that HIV-1 expression prevented eIF2alpha-dependent stress granule (SG) assembly in cells. SGs are translationally silent sites of RNA triage and can be readily visualized in cells due to clustering of cytoplasmic RNA and the recruitment of multiple cytoplasmic proteins (e.g., TIA/R, G3BP and eIF3). In this work, we attempted to understand how HIV-1 blocks SG formation and defined the determinant in HIV-1 that mediates this. To initiate SG assembly, the drug Pateamine A was used. Pateamine A causes an activation of eIF4A, which will lead to a disassembly of the eIF4F complex and an arrest in translation all in an eIF2alpha-independent manner. To identify the responsible gene, proviral constructs with individually deleted auxiliary and regulatory viral genes were expressed in HeLa cells. Among the proviral deletion constructs tested, two were found to be unable to block SG assembly: pNLXX, and Rev-. Both of these constructs share one important similarity in that they all do not express the main structural protein Gag due either to the presence of premature stop codons (pNLXX) or the nuclear retention of the genomic RNA that encodes Gag (Rev-). To directly test the hypothesis that the Gag polyprotein alone blocks stress granule assembly, we transfected cells with various mammalian expression constructs of Gag. These all prevented SG assembly. We went on to further map the responsible domain of Gag to the N-terminus of the Capsid domain, specifically to two amino acids. In conclusion, HIV-1 Gag prevents SG assembly via the N-terminus of Capsid and may confer to the virus a replicative advantage during times of stress. / Le génome du virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) comprend les protéines structurales principales Gag, Gag/Pol (structurale et enzymatique), auxiliaires (Vpr, Vpu, Vif) et régulatrices (Tat, Rev, Nef). L'expression de toutes ces protéines virales augmente la réplication et le potentiel pathogène du virus. Nos résultats précédents montrent que l'assemblage des granules de stress par un processus dépendant de eIF2alpha peut être bloqué par l'expression des gènes du VIH-1. Les granules de stress sont des sites de triage d'ARN sans traduction et elles peuvent être visualisées grâce à l'accumulation d'ARN cytoplasmique et au recrutement de plusieurs protéines cytoplasmiques (TIA/R, G3BP and eIF3, par exemple). Les résultats présentés ici montrent comment le VIH-1 empêche la formation des granules de stress et caractérisent les facteurs impliqués dans ce processus. Pour provoquer la formation de granules de stress, le composé Pateamine A a été utilisé. Pateamine A cause l'activation de eIF4A, qui provoque la dissolution du complexe eIF4F et arrête la traduction par un processus indépendant de eIF2alpha. Pour identifier le gène du VIH qui empêche la formation de granules de stress, des constructions provirales individuellement déficientes dans un gène auxiliaire ou régulateur ont été exprimées dans des cellules HeLa. Parmi les constructions provirales testées, deux étaient incapables de prévenir la formation de granules de stress: pNLXX, et Rev-. Ces deux constructions ne peuvent pas exprimer la protéine structurale Gag, soit à cause de la présence de codons stop prématurés (pNL-XX), soit à cause de la rétention dans le noyau de l'ARN viral codant pour Gag (Rev-). Pour déterminer si la polyprotéine Gag est suffisante pour empêcher la formation de granules de stress, des cellules HeLa ont été transfectées avec plusieurs différents vecteurs exprimant Gag. Tous ont empêché la formation de granules de stress. De plus, nous avons déterminé que l'extrémité N-terminale du domaine de Capside de Gag est responsable de cette inhibition. En particulier, l'activité anti-granules de stresse réside dans deux acides aminés. Ainsi, la protéine Gag du VIH-1 empêche la formation de granules de stress via l'extrémité N-terminale de la Capside et pourrait donner au virus un avantage réplicatif dans des conditions de stress.

During viral infection, the production of interferons (IFNs) plays a critical role in the host innate immune system due to its ability to upregulate genes that contribute to the antiviral state. One of the most studied IFN-stimulated genes is the dsRNA-activated protein kinase R (PKR), which has an important function in the antiviral response by preventing translation initiation through phosphorylation of the α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α). Both cellular and viral factors contribute to PKR regulation. During human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) replication, the viral TAR RNA element activates PKR while the viral protein Tat and cellular proteins adenosine deaminase acting on RNA (ADAR1) and TAR RNA binding protein (TRBP) inhibit PKR function. The PKR activator (PACT) is the best known cellular activator of PKR and acts under conditions of cellular stress. While IFN has been effective in decreasing HIV-1 replication in cell culture, the IFN response may also contribute to persistent immune activation and a decline in CD4+ T-cell count, thus hindering its effectiveness in vivo. In investigating the role of PACT during HIV-1 infection, we have found that there is an increased association between PACT and PKR at the peak of infection. We have also observed that during HIV-1 replication, PACT actually inhibits PKR activation and increases HIV-1 protein expression and viral production in HEK 293T cells. Conversely, shRNA knockdown of PACT decreases HIV-1 production and protein expression. While there is an apparent change of function in PACT during HIV-1 production, the mechanism by which PACT becomes a PKR inhibitor has yet to be elucidated. Deciphering PKR regulation by PACT will contribute to a better understanding of the innate immune response against HIV-1 and the role of innate immunity in control of disease progression. / Pendant l'infection virale, la production d'interférons (IFNs) joue un rôle critique dans le système immunitaire de l'hôte en augmentant l'expression de gènes qui contribuent à l'état antiviral. Un des gènes stimulés par l'IFN qui est le plus étudié est la protéine kinase activée par le double-brin ARN (PKR), qui a une fonction importante dans la réponse antivirale en empêchant l'initiation de la traduction par la phosphorylation de la sous-unité α du facteur eucaryote d'initiation de la traduction 2 (eIF2α). Plusieurs facteurs cellulaires et viraux contribuent à la régulation de PKR. Pendant la réplication du virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1), l'élément ARN TAR active la PKR alors que la protéine virale Tat et les protéines cellulaires adenosine deaminase agissant sur l'ARN (ADAR1) et protéine de liaison à l'ARN TAR (TRBP) inhibent la fonction de PKR. L'activateur de PKR (PACT) est l'activateur cellulaire de PKR le plus connu et agit en présence de stress cellulaire. Malgré le fait que l'IFN est efficace pour diminuer la réplication du VIH-1 en culture cellulaire, il est possible que la réponse IFN contribue aussi à une activation immunitaire persistante et à un déclin du nombre de cellules T CD4+, ce qui inhibe son efficacité in vivo. En étudiant le rôle de PACT pendant l'infection du VIH-1, nous avons trouvé une association accrue entre PACT et PKR au pic de l'infection. Nous avons aussi observé que pendant la réplication du VIH-1, PACT inhibe l'activation de PKR et augmente l'expression des protéines du VIH-1 et la production virale dans les cellules HEK 293T. En contrepartie, la diminution de l'expression de PACT par des ARNs interférants diminue la production du VIH-1 et l'expression des protéines virales. Nous avons constaté que la fonction de PACT change pendant la production du VIH-1. Cependant, il reste à déterminer par quel mécanisme PACT devient un inhibiteur de PKR. Une meilleure connaissance de la régulation de PKR par PACT contribuera à une compréhension plus complète de la réponse immunitaire innée contre le VIH-1 et au rôle de l'immunité innée dans le contrôle de la progression de la maladie.

HIV-1 co-opts host cell proteins at every step of its replication cycle to ensure proper replication. Our work identified that the HIV-1 genomic RNA is not a substrate for nonsense-mediated mRNA decay (NMD) even though it has multiple open reading frames as well as a long 3'UTR. We demonstrate that Up-frameshift protein 1 (UPF1) is involved in HIV-1 genomic RNA stability such that overexpression of UPF1 increases HIV-1 genomic RNA levels and Gag translation. Moreover, the role of UPF1 in HIV-1 is NMD-independent, is observed in both nuclear and cytoplasmic compartments and does not require binding to UPF2. Furthermore, the shuttling function of UPF1 is required for HIV-1 genomic RNA export since a UPF1 nuclear export mutant sequesters the genomic RNA in the nucleus and a nuclear localization mutant does not immunoprecipitate with the HIV-1 genomic RNA. UPF1's role in HIV-1 genomic RNA export is observed in both Rev-dependent and -independent conditions. In addition, UPF1 is found in complex with Rev, CRM1, Nup62 and DDX3, cellular proteins with already characterized roles in HIV-1 genomic RNA export. Lastly, we also identified UPF2 as a negative regulator, such that its binding to UPF1 results in the nuclear sequestration of the HIV-1 genomic RNA. We have identified a possible mechanism to explain how HIV-1 escapes the RNA quality control mechanism of NMD by co-opting UPF1 function for efficient HIV-1 genomic RNA export, stability and translation. / Le VIH-1 requiert plusieurs protéines cellulaires à chaque étape de son cycle de réplication pour assurer une réplication efficace. Notre travail a mené à l'identification que l'ARN génomique du VIH-1 n'est pas un substrat pour la dégradation des ARNm aberrants (NMD), même si elle a plusieurs cadres de lecture ainsi qu'une longue 3'UTR. Nous avons démontré que UPF1 est impliqué dans la stabilité de l'ARN génomique du VIH-1 car la surexpression de UPF1 a engendré une augmentation des niveaux d'ARN du VIH-1 et de Gag. Par ailleurs, le rôle de UPF1 est distinct de son rôle dans le mécanisme NMD, il est observé dans les compartiments nucléaires et cytoplasmiques et ne nécessite pas sa liaison à UPF2. De plus, la fonction navette de UPF1 est requise pour assurer l'exportation de l'ARN génomique du VIH-1 car le mutant NES d'UPF1 bloque son export et le mutant NLS n'immunoprécipite pas avec celui-ci. Ce nouveau rôle d'UPF1 est observé dans la présence et l'absence de Rev. De plus, UPF1 se trouve en complexe avec Rev, CRM1, Nup62 et DDX3, les protéines cellulaires déjà caractérisées comme étant impliquées dans l'exportation de l'ARN génomique du VIH-1. Enfin, nous avons également identifié UPF2 comme étant un régulateur négatif, de telle sorte que sa liaison à UPF1 engendre un blocage nucléaire de l'ARN génomique du VIH-1. Nous avons identifié un mécanisme possible démontrant comment le VIH-1 s'évade du mécanisme NMD en cooptant UPF1 pour faciliter l'exportation, la stabilité et la traduction de l'ARN génomique du VIH-1.

34 million individuals worldwide are currently infected with the human immunodeficiency virus (HIV). Following the isolation of HIV, the first direct acting antiviral was approved. This particular compound targeted the reverse transcriptase (RT) enzyme, and resulted in a decrease in viral load in patients receiving therapy. Shortly after, it was demonstrated that the use of a single inhibitor quickly leads to the selection of drug resistance mutations, and subsequently to viral rebound. To combat this, combination therapy was introduced which targets multiple proteins, including RT and other enzymes, such as HIV integrase (IN). RT reverse transcribes the single-stranded RNA genome into double-stranded DNA, followed by the insertion of this product into the host genome by IN. A detailed understanding of the mechanism of action of the drug target, the inhibitor itself, as well as how resistance-associated mutations act, is necessary to improve current therapies. Typically, drug resistance mutations occur near the binding site of the inhibitor. However, the first part of this thesis examines a mutation in HIV-1 RT, N348I, which confers, and is distant from the binding site of, both nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs). We describe the specific stage during HIV-1 reverse transcription where N348I exerts its effect on the first-generation NNRTI, neverapine, but not efavirenz. RT is targeted by multiple classes of drugs, while only one inhibitor, raltegravir (RAL), is currently approved to target HIV-1 IN. The development of IN inhibitors has been hindered by the lack of structural information with respect to the enzyme, IN-DNA interactions, as well as the mechanism of action of RAL. We pinpoint several interactions between HIV-1 IN and its DNA substrate, which are important for enzymatic activity. We also elucidate the contributions of these interactions in the context of inhibition by RAL, with respect to the wild-type enzyme, as well as the IN drug resistance mutation N155H. Following the acquisition of primary resistance mutations in HIV-1 IN, such as N155H, secondary mutations often appear. These mutations compensate for decreased viral fitness, and can potentially amplify resistance. The final study presented herein, examines whether one such mutation recently identified in RAL-experienced patients at position N117, confers resistance to RAL. / 34 millions de personnes dans le monde sont infectées par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Après l'isolement du VIH, le premier antiviral d'action directe a été approuvé. Cet antirétroviral ciblait l'enzyme de la transcriptase inverse (RT), et entrainait une diminution de la réplication virale chez les patients. Peu de temps après, il a été démontré que l'utilisation d'un seul inhibiteur conduit rapidement à la sélection de mutations de résistance contre le médicament, et par conséquent un rebond de la réplication virale. Pour résoudre ce problème, la thérapie combinée a été introduite. Celle-ci repose sur le principe où plusieurs protéines virales sont ciblé simultanément comme par exemple RT et l'intégrase du VIH (IN). RT permet de transcrire en direction inverse (rétrotranscription) l'ARN génomiques virale en ADN, suivie par l'insertion de cet ADN dans l'ADN génomique de l'hôte par IN. Une compréhension du mécanisme d'action de la cible du médicament, de l'inhibiteur lui-même, ainsi que du mécansime conférant les mutations de résistance aux inhibiteurs viraux est nécessaire pour améliorer les traitements courants. En règle générale, les mutations qui confèrent une résistance aux médicaments ce produisent a proximité du site de liaison de l'inhibiteur. Toutefois, la première partie de cette thèse examine une mutation du VIH-1 RT, N348I, qui confère la résistance malgré le fait que la mutation soit éloigné du site de liaison des inhibiteurs nucléosidique (NRTIs) et non nucléosidique de la transcriptase inverse (NNRTIs). Notre étude nous permet de décrire l'étape spécifique lors de la transcription inverse du VIH-1 où N348I exerce son effet sur un NNRTI de première génération, la névirapine, mais pas sur l'éfavirenz. Alors qu'une multitude de médicaments appartenant soit aux NRTIs ou aux NNRTIs cible la RT, un seul inhibiteur, le raltégravir (RAL), est actuellement approuvé pour cibler l'IN du VIH-1. Le développement d'inhibiteurs de l'IN a été entravée par le manque d'information structurelle à l'égard de l'enzyme, les interactions entre l'IN et l'ADN, ainsi que le mécanisme d'action du RAL. Notre étude a permis de characteriser plusieurs interactions entre le VIH-1 IN et son substrat d'ADN qui sont importantes pour l'activité enzymatique. Également, nous avons élucidé les contributions de ces interactions dans le contexte de l'inhibition par le RAL à l'égard de l'enzyme de type sauvage, ainsi qu'en présence de la mutation de résistance au médicament N155H . Suite à l'acquisition de mutations de résistance primaires du VIH-1 IN, tels que N155H, des mutations secondaires apparaissent souvent. Ces mutations compensent pour la diminution de l'efficacité virale tout en amplifiant significativement la résistance au médicament. Finalement, la dernière étude présentée ici examine si une telle mutation qui a été récemment identifié en position N117 chez les patients traités avec le RAL confère une résistance au médicament.

Human immunodeficiency virus (HIV-1) continues to persist indefinitely in long-lived CD4 T cells despite the maximal suppressive ability of antiretroviral therapy (ART). Evidence over the years has appointed persistent and generalized inflammation as being the prominent drivers of HIV disease progression, which involve elevated tryptophan (Trp) catabolites in the circulation such as kynurenine (Kyn). Indoleamine 2,3 Dioxegenase (IDO) is an intracellular enzyme that catabolizes Trp into immunosuppressive catabolites such as Kyn and has been implicated in suppressing T-cell immunity. Moreover, IDO can regulate the balance between Th17 and Treg and this dysregulation was shown to be associated with increased bacterial translocation from the gut into the systemic circulation causing increased inflammation, immune activation and further activation of Trp catabolism.Given that catabolites from the dendritic cell (DC)-induced IDO pathway may foster inflammation, we have explored the importance of IDO-induced Trp catabolism in HIV infection in patients successfully treated on ART, untreated ART-naïve subjects and elite controllers as a model for viral control. We hypothesized that ART treatment may normalize Trp catabolism in HIV infection associated with a recovered Th17/Treg balance. Under spontaneous viral replication control, we also hypothesize that elite controllers may mediate similar IDO-induced Trp catabolism associated with a protected Th17/Treg balance that is observed in treated patients. We obtained levels of plasmatic Trp and its catabolites via an automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatographic-tandem mass spectrometric (XLC-MS/MS) method and IDO-1 mRNA levels by RT-PCR. We demonstrated a depletion in Trp and an increase in catabolites Kyn and 3OH-Kyn, IDO-1 enzyme activity (Kyn/Trp ratio) and IDO-1 mRNA expression in ART-naïve subjects when compared to healthy controls. As measured by flow cytometry, ART-naive subjects had a low Th17/Treg ratio when compared with ART-treated subjects. This low Th17/Treg ratio was positively associated with IDO activity and elevated soluble CD14 (sCD14), a marker of bacterial translocation. Thus prolonged ART seems to normalize IDO-induced Trp catabolism as seen by the partial restoration in Trp levels and suppressed Trp catabolites, IDO activity and IDO-1 mRNA expression, in association with a recovered Th17/Treg balance. Moreover, mRNA expression of IDO-2 and tryptophan 2,3 Dioxegenase (TDO), which catabolize the same step as IDO-1, were measured. IDO-2 remained unchanged between study groups whereas TDO was not fully suppressed in ART-treated subjects compared to ART-naives. ART-naïve subjects demonstrated elevated levels of inflammatory factors implicated in IDO induction such as TNF-α and soluble CD40L (sCD40L) which were positively associated with IDO enzyme activity. Interestingly, elite controllers had similar levels of Trp catabolites and IDO enzyme activity compared to ART-treated subjects, whereas Trp depletion was similar to ART-naives suggesting a distinct Trp metabolism in these subjects associated with viral suppression. Levels of TDO were significantly low in elite controllers thus this may not account for Trp depletion observed. DC-induced IDO activity is triggered by IFN-γ and by sCD40L after T-cell interaction and the latter was found to be immunosuppressive in cancer associated with an expansion of Treg. We expanded these findings in HIV infection and found that sCD40L was positively associated with Treg frequency, favours expansion of Tregs and favours its differentiation in vitro. Thus elevated sCD40L may play an immunosuppressive role in HIV disease progression in association with IDO-induced Trp catabolism by favouring Treg expansion and differentiation. Collectively, the IDO-induced Trp metabolism on Th17/Treg balance contributes to enhance a vicious inflammatory cycle between HIV and microbial translocation via DC and T cell interactions. / Le VIH continue de persister indéfiniment malgré la suppression par le traitement antirétroviral (ARV). La persistance de l'inflammation représente un facteur indépendant de la progression clinique dans l'infection à VIH, en lien avec une augmentation des catabolites de Trp. L'Indoleamine 2,3 dioxygénase (IDO) qui métabolise le Trp peut aussi réguler l'équilibre entre le Th17 et Treg. La diminution du ratio Th17/Treg est associée au niveau de translocation bactérienne observé dans la circulation systémique, entrainant une augmentation de l'inflammation qui favorise l'induction supplémentaire du catabolisme de Trp. Étant donné que les catabolites produits par IDO, peuvent favoriser l'inflammation, nous avons exploré l'importance du catabolisme de Trp durant l'infection par le VIH chez les patients traités par des ARVs, les sujets non-traités et les contrôleurs élites utilisés comme modèle pour le contrôle viral. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le traitement ARV peut normaliser le catabolisme de Trp dans l'infection par le VIH qui est associée à une normalisation du ratio du Th17/Treg. Durant un contrôle du virus modérée, nous émettons l'hypothèse que les contrôleurs élites pourraient véhiculer des résultats similaires sur le catabolisme de Trp induit par IDO associée à un ratio de Th17/Treg protégé. Les niveaux plasmatiques de Trp et ses catabolites étaient obtenus par la méthode d'extraction en phase solide couplée avec la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (XLC-MS/MS) et les niveaux d'ARNm de l'enzyme IDO-1 par RT-PCR. Nous avons démontré chez les patients non-traités VIH+, une déplétion en Trp et une augmentation des catabolites (Kyn et 3OH-Kyn), l'activité enzymatique d'IDO-1 et d'ARNm d'IDO. Comme mesurée par la cytométrie en flux, les sujets non-traités VIH+ avaient une perte du ratio de Th17/Treg qui a été partiellement restauré dans les sujets traités par ARVs. La balance Th17/Treg était corrélée positivement avec l'activité d'IDO et le CD14 soluble (sCD14), un marqueur de la translocation bactérienne. Donc, le traitement par les ARVs semble normaliser le catabolisme de Trp induit par IDO comme vu par un rétablissement partiel des niveaux de Trp et une dépression de ces catabolites et l'activité de l'IDO en liaison avec un équilibre Th17/Treg récupéré. En outre, les niveaux d'IDO-2 et TDO, qui catabolise la même étape qu'IDO-1, ont été mesurés. L'expression d'IDO-2 n'avait pas changé entre les groupes d'étude. L'expression de TDO n'était pas totalement supprimée dans les sujets traités par ARV et significativement faibles chez les contrôleurs elites. Les sujets non-traités VIH ont démontré des niveaux élevés de facteurs inflammatoires impliqués dans l'induction d'IDO telles que TNF-α et CD40L soluble (sCD40L) qui étaient corrélées positivement avec l'activité de l'enzyme IDO. Fait intéressant, comparativement aux sujets traités par ARV, les contrôleurs élites avaient des niveaux similaires des catabolites de Trp et d'activité de l'enzyme IDO tandis que la déplétion de Trp était semblable à celle des sujets non-traités, suggérant un métabolisme de Trp unique chez ces sujets. L'activité IDO induite dans les cellules dendritiques est déclenchée par l'IFN-γ et par sCD40L après l'interaction des cellules T et ce dernier a été jugée immunosuppressive dans le cancer associée à une expansion des Treg. Au niveau de VIH, nos résultats ont constaté que sCD40L était positivement associée à la fréquence de Treg, induit l'expansion des Treg et favorise leurs différenciation in vitro. Donc une augmentation de sCD40L pourrait jouer un rôle immunosuppresseur dans la progression du VIH en association avec une induction d'IDO en favorisant la différenciation et l'expansion de Treg. Collectivement, l'impact du métabolisme de Trp induite par IDO sur la balance de Th17/Treg peut aider la conception de nouvelles stratégies immunothérapeutiques pour renforcer le contrôle immunitaire dans les sujets VIH+.

Hepatitis C (HCV) non-structural protein 5a (NS5a) is an RNA binding protein that plays an essential role in viral replication and assembly. NS5a domain I (NS5a-DI) forms a dimer and has been crystalized in two different conformations. The specific amino acid residues involved in dimerization and RNA binding are currently unknown, however, the dimeric form of NS5a-DI is proposed to be the active RNA binding conformation. There are currently no cell-free assays to study the NS5a dimerization and only a limited number of RNA-binding assays. We non-specifically labeled NS5a-DI with fluorescent Cy3 or Cy5-maleimide dyes under optimized conditions and used the occurrence of FRET as a measure of dimerization when Cy3-NS5a-DI was incubated with Cy5-NS5a-DI. Competition assays were also performed by adding unlabeled RNA to Cy3—NS5a-DI and Cy5-NS5a-DI and monitoring the change in FRET values. In addition, we measured direct binding of RNA to NS5a by the occurrence of FRET when Cy3-NS5a-DI was incubated with unlabeled RNA in the presence of a cationic conjugated polymer (CP+) donor. Our direct RNA binding CP+ assay shows that a FRET signal is observed when CP+ is incubated with RNA and Cy3-NS5a-DI, but abolished when RNA is replaced with DNA. This suggests that NS5a-DI binds RNA, but not DNA, as expected. Our NS5a dimerization assay shows a dose responsive FRET value when different concentrations of Cy3-NS5a-DI are incubated with Cy5-NS5a-DI. This FRET signal is reversed by increasing salt concentration, suggesting the observed FRET is a result of reversible dimer formation rather than irreversible aggregation. Competition assays with unlabeled RNA results in a dose response decrease of FRET between Cy3-NS5a-DI and Cy5-NS5a-DI, suggesting that RNA binding affects dimerization. Our results lay the basis for the development of novel plate-based assays capable of using FRET to characterize NS5a dimers and their interactions. / La protéine non structurale 5a (NS5a) du virus de l'hépatite C (VCH) est une protéine de liaison à l'ARN qui joue un rôle essentiel dans la réplication virale et l'assemblage du virus. Le domaine I de NS5a (NS5a-DI) forme un dimère, et la structure de ce domaine a été cristallisée dans deux conformations différentes. Les résidus spécifiques d'acides aminés impliqués dans la dimérisation et de liaison à l'ARN sont inconnus. Cependant, la forme dimère de NS5a-DI est proposé d'être la conformation active de liaison d'ARN. Présentement, il n'y a actuellement aucune technique biochimique établit pour étudier la dimérisation de NS5a, et seul un nombre limité de techniques existe pour mesurer la liaison à l'ARN. Nous avons lié un colorant fluorescent Cy3 ou Cy5- maléimide chimiquement à NS5a-DI d'une manière non spécifique au site de fixation, en utilisant des conditions optimisées. Par le suite, nous avons utilisé la présence de FRET en tant que mesure de dimérisation lorsque Cy3-NS5a-DI a été incubée avec Cy5-NS5a-DI. Des essais de compétition ont également été réalisées en observant la variation des valeurs de FRET après l'ajout d'ARN sans fluorophore à Cy3-NS5a-DI et Cy5-NS5a-DI. Nous avons également mesuré la liaison directe de NS5a à l'ARN par la présence de FRET quand Cy3-NS5a-DI a été incubée avec l'ARN sans fluorophore en présence d'un polymère cationique conjugué (PC+) comme donneur de fluorescence. Notre essai de liaison directe d'ARN par PC+ montre qu'un signal de FRET est observé lorsque PC+ est incubé avec l'ARN et Cy3-NS5a-DI, mais est aboli lorsque l'ARN est remplacé par de l'ADN. Ceci suggère que NS5a-DI se lie à l'ARN, mais pas à l'ADN, comme prévu. Notre essai de dimérisation pour NS5a montre une valeur de FRET avec une relation de dose-réponse lorsque différentes concentrations de Cy3-NS5a-DI sont incubées avec Cy5-NS5a-DI. Ce signal de FRET est diminué en augmentant la concentration de sel, suggérant le signal de FRET est observé à la suite de la formation de dimères réversibles plutôt que de l'agrégation irréversible. Des essais de compétition avec l'ARN sans fluorophore demontrent une diminution dans la dose-réponse de FRET entre Cy3-NS5a-DI et Cy5-NS5a-DI, ce qui suggère que la liaison à l'ARN affecte dimérisation. Nos résultats créent une base pour le développement de nouveaux essais basés sur la plaque de 96 puits capables d'utiliser la technique de FRET pour caractériser les dimères de NS5A et leurs interactions.

<p> Dengue virus (DENV) is the leading cause of arthropod transmitted disease worldwide, with an estimated 2.5 billion individuals at risk for infection each year in tropical and subtropical areas. There are four serotypes of DENV which are transmitted by the mosquito <i>Aedes aegypti</i> and <i> Aedes albopictus.</i> Although DENV infections are asymptomatic, dengue disease can present as dengue fever (DF), dengue hemorrhagic fever (DHF), and dengue shock syndrome (DSS). There are several hypotheses as to explain differences in disease severity. This thesis investigates the contribution of intrinsic viral factors to the innate immune response in primary immune cells utilizing clinical isolates of DENV-3 from Sri Lanka before and after the emergence of DHF in 1989. Using these clinical isolates we analyzed their replication and innate immune phenotype in a primary human system. Our data shows an increase in interferon (IFN) and IFN-stimulated gene induction only in dendritic cells (DCs) infected with post-DHF DENV-3, compared to the pre-DHF DENV-3. Co-culture experiments reveal that DCs infected with post-DHF DENV-3 prime T cells more efficiently towards Th1 responses than DCs infected with pre-DHF DENV-3. DCs infected with post-DHF DENV-3 also undergo apoptosis at higher levels in an IFN dependent manner compared with DCs infected with pre-DHF DENV-3. Current work investigates specific mutations in the DENV NS2B3 and NS5 genes may correspond to some of the observed differences in virulence between the viruses.</p><p> Secondly, as human-to-human transmission is very rare, this thesis examines the contribution of the vector to the immune response against DENV. We investigated the innate immune response in primary cells to DENV grown in a variety of mammalian cells (primary and cell lines) in addition to DENV grown in mosquito cells and whole mosquitos. Although we do not observe a significant difference in DENV grown in mammalian cells, dendritic cells infected with mosquito DENV express higher levels of pro-inflammatory cytokines at early time points after infection. Dendritic cells treated with mosquito homogenate also upregulated these cytokines suggesting that upregulation of proinflammatory cytokines could be caused by a mosquito factor. Future experiments will examine immune responses to individual mosquito salivary factor proteins. </p>

Viruses are among the ultimate conquerors. Even the exploits of Genghis Khan and Alexander the Great seem pale when compared to viral feats. To give but one example, over the last 50 years, the human immunodeficiency virus (HIV) has swept across six continents, now claiming several million lives yearly. Despite sustained intense research efforts, there is still no treatment to eradicate HIV infection. / For billions of years, viruses evolved strategies to enter and take control of organisms to generate progeny viruses. Eukaryotic cell viruses developed various means of hijacking the cellular protein synthesis machinery. Understanding these mechanisms opens a unique window of opportunity: that of eventually being able to specifically inhibit virus protein production. In this context, we investigated how HIV-1 translation is regulated. This work initially characterizes an RNA structural element in the HIV-1 leader able to directly recruit the protein synthesis machinery, i.e. an internal ribosome entry site (IRES). This element is capable of driving protein synthesis during the G2/M cell-cycle phase when cap-dependent translation is inhibited. / Several virus families use IRESs. IRES-dependent translation usually involves a subset of the factors implicated in cellular protein synthesis. However, toeprinting studies suggest that HIV-1 requires factors different from the canonical translation initiation factors to initiate protein synthesis. HeLa cell protein fractionation studies identified p97, an eIF4G homolog, its apoptotic cleavage product, p86, and a novel protein, ropp120, as putative HIV-1 transactivators. Further testing revealed that these proteins do not directly stimulate HIV-1 leader dependent translation. Experiments also showed that La autoantigen, another likely HIV-1 IRES transactivator candidate, does not directly stimulate HIV-1 dependent translation. / The last portion of this work investigates the interplay of the HIV-1 IRES with cap structures, polyA tails and the HIV-1 3'UTR region since these elements are present on the viral genomic RNA. We found that the HIV-1 leader does not synergize nor does it interfere with the translation stimulation mediated by the cap, the polyA and the HIV-1 3'UTR. Data presented herein suggest that the HIV-1 leader is an IRES able to shunt initiation complexes from the cap structure to drive protein synthesis.

The research for this doctoral dissertation was undertaken to: (1)establish a rationale that is supported by published laboratory and clinical data for prospective clinical investigation of the therapeutic maintenance of the M184V mutation in human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) reverse transcriptase (RT) in antiretroviral therapy-experienced patients with virological failure, and, (2)to study the relative effectiveness of various nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) that are structurally-unrelated to 3TC in selecting and/or maintaining M184V in tissue culture and whether continuous exposure to therapeutic levels of 3TC is the only means of attaining this objective. Accordingly, we have evaluated the ability of zalcitabine (D.C.), didanosine (ddI), abacavir (ABC) and the novel nucleoside analogue SPD754, in addition to 3TC, to maintain the presence of M184V in tissue culture and have shown that each of SPD754, ABC and 3TC were able to preserve M184V in mixed dual infections consisting of wild-type viruses and clinical isolates in which the M184V mutation was present either alone or in a genetic background consisting of several other resistance-conferring mutations in the RT gene. Moreover, M184V could also be maintained in these cultures when a subtherapeutic concentration of 3TC (i.e., 0.05 muM) was used. In contrast, neither ddI nor D.C. were able to maintain M184V to the same extent as the other drugs tested after up to ten weeks of tissue culture in mixtures of wild-type viruses and isolates containing only M184V, especially when the latter represented a minority species in the viral population. The M184V substitution in HIV-1 RT develops rapidly following initiation of therapy with 3TC and confers high-level phenotypic resistance to this drug and a related analogue, FTC, both in vitro and in vivo. Interestingly, the proximity of the M184V mutation in relation to the polymerase active site is also respons