The paucity of CAR in malignant glioma cell lines and grade IV primary astrocytomas (glioblastoma multiforme) suggest that CAR expression may be disadvantageous to malignant gliomas. The present study directly tested this hypothesis by determining the effect of forced CAR expression on the invasion and growth of the human glioma cell line U87-MG expressing no detectable levels of CAR. We also studied the requirement of the cytoplasmic domain of CAR in mediating for these effects. We have found that forced expression of the full-length forms of mCAR1 isoform in U87-MG cell lines (i) does not affect their growth in vitro in monolayer, but does significantly reduce the tumor volumes generated by implanted glioma cells in mouse brains in vivo; and (ii) reduced invasion by glioma cells in a three-dimensional spheroid model. In contrast, expression in U87 cells of the tailless-CAR having the entire cytoplasmic domain deleted except for the first two intracellular juxtamembrane cysteine-cysteine amino acids did not significantly reduce the invasion rate of the glioma spheroid in vitro, nor did it reduce the tumor volume generated in vivo in the brain. Together these results suggest that the paucity of CAR expression in malignant gliomas may confer the tumors selective advantage in growth and invasion.

It has been postulated that intracellular binding sites for platelet activating factor (PAF) contribute to pro-inflammatory responses to PAF. Isolated nuclei from porcine cerebral microvascular endothelial cells (PCEC) produced PAF-molecular species in response to H2O2 . Using fluorescent-activated cell sorter analysis, we demonstrated the expression of PAF receptors (PAFR) on cell and nuclear surfaces of PCEC. Confocal microscopy studies performed on PCEC, Chinese hamster ovary cells stably overexpressing PAFR and on isolated nuclei from PCEC also showed a robust nuclear distribution of PAFR. Presence of PAFR at the cell nucleus was further revealed in brain endothelial cells by radioligand binding experiments, immunoblotting, and in situ in brain by immunoelectron microscopy. Stimulation of nuclei with PAF evoked a decrease in cAMP production and a pertussis toxin (PTX)-sensitive rise in nuclear calcium, unlike observations in plasma membrane, which exhibited a PTX-insensitive elevation in inositol phosphates. Moreover, on isolated nuclei C-PAF evoked the expression of pro-inflammatory genes inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 (COX-2), and was associated with augmented ERK1/2 phosphorylation and NF-kappaB binding to DNA consensus sequence; COX-2 expression was prevented by MEK/ERK1/2 and NF-kappaB inhibitors. This study describes for the first time the nucleus as a putative organelle capable of generating PAF and expresses its receptor, which upon stimulation induces the expression of pro-inflammatory gene COX-2.

In this thesis, the mechanism of endoplasmic reticulum localization of Saccharomyces cerevisiae alpha1,2-mannosidase is studied. alpha1,2-mannosidase is a type II membrane glycoprotein localized in the endoplasmic reticulum, yet it does not have any of the known endoplasmic reticulum localization signals. / Immunofluorescence studies show that the endoplasmic reticulum localization of alpha1,2-mannosidase depends on the Golgi protein Rer1p, since in rer1-deleted cells, alpha1,2-mannosidase migrates to the vacuoles. Furthermore, alpha1,2-mannosidase acquires Golgi-specific carbohydrate modification. These results show that the steady state endoplasmic reticulum localization of alpha1,2-mannosidase involves recycling from the Golgi apparatus. The transmembrane domain of alpha1,2-mannosidase is important for endoplasmic reticulum localization since fusing it to the Golgi protein Kre2p results in the endoplasmic reticulum localization of the chimera in an Rer1p-dependent manner. Mutation of the polar residues in the transmembrane domain do not affect endoplasmic reticulum localization of alpha1,2-mannosidase, nor Rer1p-dependent recycling, indicating that the polar residues are not important for these processes. alpha1,2-Mannosidase and Rer1p interact, determined using the split-ubiquitin system, a genetic method adapted to study membrane protein interactions in vivo. Therefore, the transmembrane domain of alpha1,2-mannosidase mediates recycling from the Golgi apparatus in a mechanism that involves interaction with the Golgi protein Rer1p. / When solubilized and subjected to gel filtration analysis, endogenous alpha1,2-mannosidase is eluted on Sephacryl S-200 as twice the molecular weight of the purified recombinant enzyme lacking its transmembrane domain. Immunoprecipitation studies show that alpha1,2-mannosidase can form a homodimer. Furthermore, mutation of the asparagine residue at position 3, or the tyrosine residues at positions 20 and 21, prevents dimerization.

We previously identified the USP19 deubiquitinating enzyme. To further characterize the functions of USP19, we used siRNA to deplete this enzyme in cultured cells. Depletion of USP19 in FR3T3 fibroblasts resulted in an impairment of cell growth, delay in entry into S phase and accumulation of p27Kip1, an inhibitor of G1 to S phase progression. This increased p27Kip1 upon USP19 depletion was due to a decrease in the rate of degradation of p27Kip1 in G0 and G1 phases, but not at the G1/S transition. The increased p27Kip1 in USP19 depleted FR3T3 cells was associated with reduced levels of KPC1, the catalytic subunit of a ubiquitin protein ligase for p27Kip1, but no changes in levels of Pirh2 or Skp2, other ligases for p27Kip1. KPC1 was ubiquitinated in vivo and stabilized by proteasome inhibitors and by overexpression of USP19, and it also coimmunoprecipitated with USP19. Cell growth impairment upon USP19 depletion was partially reversed in cell lines stably expressing KPC1 or in p27Kip1−/− MEF cells. These findings indicated that in normal fibroblasts, USP19 exerts its effects on cell proliferation through KPC1/ p27Kip1 dependent mechanisms, by deubiquitinating and stabilizing KPC1 which in turn leads to increased ubiquitination of p27Kip1, and also by a KPC1/ p27Kip1 independent pathway(s). / To determine the importance of these pathways in other cells, in particular cancer cells, USP19 was depleted in a panel of cell lines, including prostate cancer DU145, PC-3, LNCaP and 22RV1, breast epithelial MCF10A, breast carcinoma MCF7 and MDA-MB-231 as well as transformed Hela and 293T cells. The ability of USP19 to regulate cell growth generally correlated with its ability to modulate p27Kip1 except in the Hela and 293T cells in which the regulation of p27Kip1 was maintained, but the regulation of cell growth was lost. These effects seemed to be independent of KPC1, Pirh2 or Skp2, as their levels were not changed upon USP19 depletion. These findings suggested that transformation can lead to loss of regulatory effects of USP19. Indeed, depletion of USP19 in Ras-transformed FR3T3 cells had no effects on cell growth, p27Kip1 or KPC1. / Thus, this work is conceptually significant in identifying USP19 as a new regulator of p27Kip1 and of G1 progression in normal fibroblasts and some prostate cancer cell lines. This work suggests USP19 as a potential novel target for treatment of prostate cancer. / Nous avons précédemment décrit la protéine USP19 comme étant une enzyme de déubiquitination. Maintenant, pour mieux comprendre le rôle de USP19, nous avons réduit les niveaux de l'enzyme en utilisant des ARNs interférents dans des cellules en culture. En réduisant la protéine USP19 dans des fibroblastes FR3T3, nous avons obtenu une altération de la croissance cellulaire, ainsi qu'un délai d'entrée en phase S du cycle cellulaire et une accumulation de p27Kip1, un inhibiteur de la progression cellulaire de la phase G1 à S. Cette augmentation de p27Kip1 suite à la réduction de USP19 est due à une diminution du taux de dégradation de p27Kip1 durant les phases G0 et G1 et non durant la transition G1/S. L'augmentation de p27Kip1 dans les cellules FR3T3 traitées avec l'ARN interférent contre USP19 est associée à une réduction des niveaux de KPC1, la sous-unité catalytique de KPC qui est une enzyme de ligation à l'ubiquitine pour p27Kip1. Par contre, aucun changement n'a été observé dans les niveaux de Pirh2 ou Skp2, deux autres enzymes de ligation à l'ubiquitine associée à p27Kip1. KPC1 est conjugué à l'ubiquitine in vivo et est stabilisé par des inhibiteurs du protéasome ou par la surexpression de USP19. KPC1 peut aussi être coimmunoprécipité avec USP19. L'altération de la croissance cellulaire suite à la réduction de USP19 peut être partiellement inversée dans des lignées cellulaires qui exprime KPC1 de façon stable ou dans des cellules MEF p27Kip1−/−. Ces résultats nous indiquent que dans des fibroblastes normaux, USP19 exerce son effet sur la prolifération cellulaire via des mécanismes dépendants de KPC1/ p27Kip1 et ce en déubiquitinant et en stabilisant KPC1 qui à son tour mènera à une augmentation de l'ubiquitination de p27Kip1. Toutefois, USP19 peut aussi exercer son effet par des voies indépendantes de KPC1/ p27Kip1. / Pour déterminer l'importance des ces mécanismes dans d'autres types de cellules, en particulier dans des cellules cancéreuses, nous avons réduit les niveaux de USP19 dans une panoplie de lignées cellulaires, incluant des lignées de cancer de prostate comme DU145, PC-3, LNCaP et 22RV1, des lignées de cancer du sein comme MCF7 et MDA-MB-231, d'épithélium mammaire comme MCF10A ainsi que dans des lignées transformées comme les cellules Hela et 293T. La capacité de USP19 à réguler la croissance cellulaire corrèle généralement avec sa capacité à moduler p27Kip1, à l'exception des cellules Hela et 293T dans lesquelles la régulation de p27Kip1 est maintenue mais où la régulation de la croissance cellulaire est perdue. Ces effets semblent être indépendants de KPC1, Pirh2 ou Skp2, étant donné que leurs niveaux protéiques restent inchangés suite à la réduction de USP19. Ces résultats suggèrent que la transformation cellulaire peut mener à la perte de l'effet de régulation de USP19. En effet, lorsque USP19 est réduit dans des cellules FR3T3 qui ont été transformées par l'oncogène Ras, aucun effet n'est observé sur la croissance cellulaire ou sur les niveaux de p27Kip1 ou KPC1. / Par conséquent, cette étude est conceptuellement significative car elle identifie USP19 comme étant un nouveau régulateur de p27Kip1 et de la progression G1 dans des fibroblastes normaux ainsi que dans certaines lignées cellulaires de cancer de prostate. Cette étude suggère que USP19 pourrait devenir une nouvelle cible pour le traitement du cancer de la prostate.

Mineralization of the extracellular matrix of bone is a cell-mediated process, which is tightly regulated by a delicate balance between stimulatory and inhibitory molecules. A disruption in the metabolism or levels of these mediating factors results in pathologically hypomineralized or hypermineralized bone. The experimental results presented in this thesis describe the effects of key proteins, peptides and small-molecule ions on an osteoblast cell-culture model of bone mineralization. / This study presents evidence that pyrophosphate inhibits mineralization by at least three different mechanisms that include direct binding to hydroxyapatite crystals, induction of osteopontin expression, and inhibition of alkaline phosphatase activity. The data presented also demonstrate that inhibition of mineralization by mineral-binding osteopontin and MEPE ASARM peptides is phosphorylation-dependent and that this inhibition can be rescued by enzymatic degradation of the peptides by PHEX. This result identifies a novel mechanism by which loss of PHEX activity can lead to extracellular matrix accumulation of ASARM resulting in the osteomalacia of X-linked hypophosphatasia. Finally, the thesis describes the novel effects of a potentially physiologic modulator of mineralization, inositol hexakisphosphate, on osteoblast activity – namely, that inositol hexakisphosphate inhibits osteoblast culture mineralization, adsorbs to mineral and induces expression of osteopontin. / In summary, the findings herein suggest a model whereby regulation of crystal propagation/growth within the extracellular matrix is maintained by the enzymatic removal (e.g. by alkaline phosphatase and PHEX) of mineralization inhibitors (e.g. pyrophosphate and ASARM peptides) and that these inibitors regulate mineralization by acting on both the mineral phase and on the cellular expression of mineral-regulating genes. / Minéralisation de la matrice extracellulaire de l'os est un processus de médiation cellulaire, qui est rigoureusement réglementé par un délicat équilibre entre les molécules stimulatoires et inhibitrices. Un dysfonctionnement dans le métabolisme de ces facteurs donnera soit une déficience ou un excès des minéraux dans les os. Les résultats expérimentaux présentés dans cette thèse, décrivent les effets des protéines et des ions principaux sur un modèle de cellule-culture d'osteoblaste de minéralisation d'os. / Cette étude présente les éléments de preuve que le pyrophosphate inhibe la minéralisation par au moins trois différents mécanismes qui incluent la liaison directe aux cristaux d'hydroxyapatite, à l'induction de expression d'osteopontin et à l'inhibition de l'activité de la phosphatase alcaline. Les données présentées démontrent également que l'inhibition de la minéralisation par la liaison de minéraux osteopontin/MEPE ASARM peptides est phosphorylation dépendante et que cette inhibition peut être sauvée par dégradation enzymatique avec PHEX. Ce résultat identifie un nouveau mécanisme par lequelle une perte d'activité de PHEX peut conduire à l'accumulation d'ASARM dans la matrice ce qui se traduit par la ostéomalacie de X-linked hypophosphatasia. / Enfin, la thèse décrit les effets d'un nouveau modulateur de minéralisation, l'inositol hexakisphosphate, de l'activité d'ostéoblaste. Nous avons trouver que l'inositol hexakisphosphate inhibe la minéralisation de culture d'ostéoblastes, s'attache aux minéraux et augmente l'expression d'osteopontin.

Complex cellular processes involve the specific and coordinated expression of networks of genes in space and time. This thesis explores existing and novel high-throughput methods of measuring gene transcription in such dynamic systems. We used expression microarrays to perform a time series analysis of differentiating C2C12 myoblasts, with dense temporal sampling within the first day of differentiation. Analysis of this data revealed that a large proportion of transcriptional regulators (TRs) are differentially expressed early in myogenesis. Using a high-content shRNA screen, we identified 48 TRs that significantly inhibit myogenesis when knocked down. These include known regulators of myogenesis, but also 26 TRs not previously associated with the process. In addition to showing the requirement of many differentially expressed genes during differentiation, our data also reveals that stably expressed genes are critical components to complex processes such as myogenesis. / Current approaches to measuring transcriptional changes in high throughput rely on discrete measurements of signals that have been averaged over large numbers of cells. To address these limitations, we developed a high-throughput platform called the Living Microarray for measuring transcriptional changes in single mammalian cells at a high temporal sampling density. By combining reverse-transfection microarrays with automated fluorescence microscopy, we are able to make single-cell expression measurements of inducible fluorescent reporters transfected in 600 independent clusters of cells over 24 hours. Automated segmentation and tracking of over 11 million cells revealed that cells display substantial heterogeneity in their responses. Our method is scalable and readily adaptable to studying other systems, including cell proliferation, differentiation and apoptosis. / Les processus cellulaires nécessitent l'expression spécifique et coordonnée de réseaux de gènes de façon temporelle et spatiale. Cette thèse explore des méthodes à haut-débit, ainsi que de nouvelles techniques qui mesurent la transcription de gènes dans de tels systèmes dynamiques. Nous avons utilisé les puces à ADN pour effectuer une analyse chronologique de la transcription des gènes impliqués dans la différenciation des cellules myoblastiques C2C12. En particulier, nous avons utilisé un échantillonnage à intervalle court durant le premier jour de la différenciation. L'analyse de ces données a révélé qu'une forte proportion des régulateurs transcriptionnels (RT) sont exprimés de façon différentielle au début de la myogenèse. En employant un criblage shRNA à haut-débit, nous avons identifié 48 RT nécessaires à la myogenèse. Parmi ceux-ci se trouvent plusieurs régulateurs connus, mais aussi 26 RT qui n'ont jamais été liés à ce processus. En plus de démontrer l'importance de nombreux gènes exprimés de façon différentielle tôt lors de la différenciation, nos données révèlent que les gènes exprimés de manière constante sont aussi des composantes essentielles pour les processus complexes tels que la myogenèse. / Les méthodes à haut-débit actuelles visant à mesurer la transcription génèrent des mesures uniques de signaux représentant la moyenne d'un grand nombre de cellules. Afin d'améliorer ces technologies, nous avons développé la Micropuce Vivante, une méthode à haut-débit qui mesure les changements de transcription dans des cellules vivantes de mammifères à plusieurs intervalles très courts. En combinant des puces à transfection inverse avec la microscopie à fluorescence automatisée, nous pouvons mesurer l'induction de gènes fluorescents transfectés dans 600 groupes de cellules pendant 24 heures ou plus. L'analyse détaillée de plus de 11 millions de cellules a révélé qu'il existe une hétérogénéité importante entre cellules en ce qui concerne leur réponse au traitement. Notre méthode peut être utilisée pour l'étude de plusieurs systèmes, comme la division cellulaire, la différenciation cellulaire et l'apoptose.

During liver transplantation, donor organs experience some degree of cold ischemia/reperfusion injury (IRI). The magnitude of this preservation injury is critical for transplantation outcome since it influences the allograft early function. However, the multifactorial and complex cellular response initiated upon IRI remains unclear. Herein, we used liver biopsies collected during the early phases of organ procurement and transplantation to characterize the global patterns of protein expression and phosphorylation in order to identify new regulatory mechanisms involved in ischemia-induced graft damage. / First, a targeted functional proteomic approach, which combined protein expression profiling and mass spectrometry phosphoproteins analysis, allowed us to identify IQGAP1, a Cdc42/Rac1 effector, as a potential regulator of IRI-induced actin cytoskeleton remodeling and the related bile canaliculi (BC) loss of integrity. We demonstrated that IQGAP1 expression and localization are affected upon IRI and related to actin reorganization. Furthermore, using an IRI model in hepatoma cells, we showed that IQGAP1 silencing decreases the basal level of actin polymerisation at BC periphery, reflecting a defect in BC structure, coincident with a reduced cellular resistance to IRI. / Our proteomic data also led us to postulate that IRI-induced cellular damages may cause alterations of the secretory pathway, suggesting the activation of endoplasmic reticulum (ER) specific stress responses. Using semi quantitative RT-PCR and immunoblot with phospho-specific antibodies, we showed that the IRE-1 pathway, leading to both adaptive and pro-apoptotic responses, is first activated upon early ischemia and, in a second phase, upon early reperfusion. In contrast, the PERK pathway, leading to inhibition of capdependent translation, is mainly activated upon reperfusion, restrictively in sinusoidal endothelial cells, and could contribute to the exagerated sensitivity of this liver cell type to IRI. / In summary, our work allowed to gain new mechanistic insights in the global regulation of the cellular response to IRI, and also led to the identification of new molecular mechanisms specifically involved in mediating liver resistance to IRI. First, IQGAP1, as a regulator of BC structure could be participate in maintaining a proper bile secretion, essential for graft post-transplant recovery. Then, the balance between pro-adaptive and pro-apoptotic responses triggered in the ER might, as well, influence liver secretory functions and, as a consequence, condition liver transplantation outcomes.

Over the course of the last decade, mesenchymal stromal cells (MSC) have made a remarkable entry in the field of cell-based immunotherapy. In vitro, MSC were shown to modulate the immune response, either by acting as an immunosuppressant on several immune cells, or upon IFN-γ stimulation, as an antigen presenting cell (APC) for the priming of CD4+ T cells. Although a vast array of in vivo experiments in animals and humans has undeniably proven the immunological properties of MSC, the exact mechanisms by which MSC mediate their effects remain unclear. In Chapter 1, I presented a succinct review of the literature in regards to the characteristics of MSC. In Chapter 2, I addressed the immunosuppressive mechanisms of human MSC toward T cell proliferation. Using an in vitro proliferation assay, I demonstrated that human MSC suppressed T cell proliferation through the expression indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) induced following IFN-γ priming. In addition, MSC derived from different donors were shown to suppress T cell proliferation at variable degrees, which corresponded to their individual expression level of IDO. The use of whole peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as opposed to purified T cells revealed the role played by monocytes in the suppression of T cell proliferation by MSC. Factors secreted by MSC in addition to the enzymatic activity of IDO induced the differentiation of monocytes into immunosuppressive M2 macrophages. Stimulation by IFN-γ not only triggered the immunosuppressive mechanisms of MSC but also induced APC-like properties in MSC. In Chapter 3, I investigated the molecular mechanisms implicated in the modulation of IFN-γ-inducible expression of MHC class II molecules and mediated antigen presentation in MSC. I demonstrated that IFN-γ mediated the transcriptional activation of the class II transactivator gene (CIITA), which is responsible for the upregulation of MHC class II molecules on both mouse and human MSC, and that TGF-β counter-acted the effect of IFN-γ by inhibiting the transcription of CIITA. In addition, cell culture density also modulated MHC class II-mediated antigen presentation differentially in mouse and human MSC. In Chapter 4, I examined the capacity of mouse MSC to cross-present exogenously acquired antigens as part of their APC-like features. I demonstrated that cross-presentation by mouse MSC was induced by IFN-γ and dependent on MHC class I machinery molecules, TAP complex and proteasome. I also demonstrated using an in vivo immune reconstitution assay, that mouse MSC can prime CD8+ T cells against a specific antigen, a characteristic of professional APC. Finally, I investigated in Chapter 5 the immunological impact of TLR expression and signaling in human and mouse MSC. I demonstrated that TLR activation in MSC induced the expression of chemokines and cytokines, which created an attractive inflammatory milieu for immune cells. I concluded by demonstrating that MSC differ from classic APC in that they did not express IL-12p70, an essential cytokine involved in both innate and adaptive immunity, in response to TLR activation. The findings in this thesis illustrate the complexity of the mechanisms by which MSC modulate the immune system. Their response to environment clues such as inflammation and pathogens activate either their suppressive or stimulatory immune functions, depending on the situation. Overall, these findings help optimize the utilization of MSC in cell-based immunotherapy. / Au cours de la dernière décennie, les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) ont fait une entrée remarquée dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire. In vitro, les MSC ont démontrées des propriétés immunomodulatrices, soit par leur action inhibitrice sur les fonctions des cellules du système immunitaire ou par leur capacité à présenter des antigènes aux lymphocytes T CD4+, à la suite d'une stimulation par IFN-. Malgré l'existence de nombreuses recherches in vivo chez les animaux et l'homme prouvant leurs propriétés immunologiques, les mécanismes par lesquels les MSC modulent le système immunitaire n'ont pas encore été élucidés. Dans le Chapitre 1, j'ai présenté une revue succincte de la littérature traitant des caractéristiques des MSC. Dans le Chapitre 2, j'ai adressé les mécanismes immunosuppressifs des MSC humaines sur les lymphocytes T. À l'aide d'un test de prolifération in vitro, j'ai démontré que les MSC humaines suppriment la prolifération des lymphocytes T par grâce à l'expression indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) induite par l'exposition à l'IFN-. De plus, les MSC isolées de différents donneurs inhibent la prolifération des lymphocytes T à différents degrés qui correspondent au le niveau d'expression d'IDO par chaque donneur. L'utilisation de cellules mononucléaires sanguines (PBMC) complet comparativement à l'utilisation de lymphocytes T purifiés a révélé le rôle joué par les monocytes dans la suppression de la prolifération des lymphocytes T par les MSC. L'activité enzymatique d'IDO en combinaison avec d'autres facteurs sécrétés par les MSC induisent la différentiation des monocytes en macrophages immunosuppressifs de type M2. En plus de déclencher les mécanismes immunosuppressifs des MSC, l'IFN-a aussi eu pour effet d'induire des propriétés typiques des cellules présentatrices d'antigène (CPA) chez les MSC. Dans le Chapitre 3, j'ai étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l'expression des molécules MHC de type II et la présentation d'antigène par celles-ci dans les MSC. J'ai démontré que l'IFN- active la transcription du transactivateur de classe II (CIITA), ce qui a eu pour résultat d'uprégulation les molécules MHC de type II dans les MSC murines et humaines, et que l'ajout de TGF- contrecarre l'effet de l'IFN- en inhibant la transcription de CIITA. De plus, la densité cellulaire des MSC en culture module la présentation d'antigène en affectant l'expression des molécules MHC de type II différemment chez les MSC murines et humaines. Dans le Chapitre 4, j'ai examiné la capacité des MSC de souris à cross-présenter des antigènes exogènes, une autre propriété typique des CPA. J'ai démontré que l'IFN- induit la cross-présentation dans les MSC murines et que celle-ci dépend des molécules TAP et du protéasome. J'ai aussi prouvé à l'aide d'un modèle de reconstitution immunitaire in vivo, que les MSC murines peuvent induire l'activation des lymphocytes T CD8+ contre un antigène spécifique. Finalement, j'ai enquêté dans le Chapitre 5, l'impact immunologique de l'expression et de la signalisation par les TLR chez les MSC humaines et murines. J'ai illustré que l'activation des TLR induisait l'expression de chemokines et de cytokines par les MSC créant ainsi un milieu inflammatoire propice au recrutement des cellules immunitaires. J'ai conclue en démontrant que les MSC différaient des CPA classiques par l'absence de production IL-12p70, une cytokine essentielle à la réponse immunitaire innée et acquise, en réponse à la stimulation des TLR. Les résultats inclus dans cette thèse illustrent la complexité des mécanismes immunomodulatoires des MSC. Leurs réponses face aux signaux de leur environnement, tel que l'inflammation ou l'infection activent soit leurs propriétés immunosuppressives ou –stimulatrices dépendamment de la situation. Mes découvertes pourront optimiser l'utilisation des MSC dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire.

Normal development of the chorionic villi in human placenta is critical for proper exchange of nutrients and oxygen between the mother and the fetus. The chorionic villi of the placenta are formed by the differentiation of trophoblast cells into cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells, which are both important for proper placental function. Tmed2 was shown to be required for normal embryo and placental development in the mouse. In Tmed2 mutant embryos, the labyrinth layer of the placenta fails to form. The labyrinth layer of the mouse placenta is equivalent to the chorionic villi of the human placenta, and is essential for a successful pregnancy. We hypothesized that TMED2 is expressed in the human placenta, and could be involved in trophoblast differentiation. The objectives of this study are to characterize TMED2 expression in first trimester and term human placenta, and to compare TMED2 mRNA and protein levels in two cell lines, BeWo and JEG-3, that are widely used for studying trophoblast differentiation. We found by immunocytochemistry that TMED2 is expressed in both first trimester and term human placenta. We also found that TMED2 is expressed in BeWo cells, which are known to form syncytiotrophoblast after forskolin treatment, but not expressed in JEG-3 cells, which do not undergo syncytiotrophoblast differentiation. / Le développement normal des villosités choriales dans le placenta humain est essentiel pour l'échange adéquat des nutriments et de l'oxygène entre la mère et le fœtus. Les villosités choriales du placenta sont formées par la différentiation des cellules du trophoblaste en cellules de cytotrophoblaste et syncytiotrophoblaste, qui sont essentielles pour le fonctionnement du placenta. Tmed2 a été démontré comme étant requis pour le développement normal de l'embryon et du placenta chez la souris. Dans les embryons mutants pour Tmed2, la couche labyrinthe du placenta ne se forme pas. La couche labyrinthe du placenta de souris est l'équivalent des villosités choriales du placenta humain, et est requise pour une grossesse saine. Nous avons donc émis l'hypothèse que TMED2 est exprimé dans le placenta humain, et pourrait être impliquée dans la différentiation du trophoblaste. Les objectifs de cette étude sont de caractériser l'expression de TMED2 dans le placenta humain du premier trimestre et à terme, ainsi que de comparer les niveaux des protéines et d'ARNm de TMED2 dans deux lignées cellulaires, BeWo et JEG-3, qui sont couramment utilisées pour étudier la différentiation des trophoblastes. Nous avons trouvé par immunocytochimie que TMED2 est exprimé dans le placenta de premier trimestre et à terme chez l'humain. Nous avons aussi démontré que TMED2 est exprimé dans les cellules BeWo qui forment des synctyiotrophoblastes après traitement à la forskoline, mais n'est pas exprimé dans les cellules JEG-3 qui ne subissent pas de différentiation en syncytiotrophoblastes

A major drawback of cartilage tissue engineering is that human mesenchymalstem cells (hMSCs) from osteoarthritic (OA) patients express high levels of typeX collagen. Type X collagen is a marker of late stage chondrocyte hypertrophy, linked with endochondral ossification. It has been shown that a novel plasmapolymer, called nitrogen-rich plasma-polymerized ethylene (PPE:N), is able to inhibit type X collagen expression in committed MSCs. The aim of this study was to determine if the decreased expression of type X collagen, induced by PPE:N, is maintained when MSCs are transferred to pellet cultures, an arrangement of cells which mimics embryonic condensation of mesenchymal stem cells, which results in prehypertrophic chondrocytes. hMSCs were obtained from the bone marrow of donors undergoing total hip replacement for OA. hMSCs were cultured on polystyrene dishes and on two different PPE:N surfaces: high (H) and low (L)pressure deposition for 7 days. Cells were transferred for 7 additional days in serum free media in pellet culture. RNA was extracted using a standard TRIzolprotocol. RNA was subjected to RT-PCR using primers specific for type I and X collagen. As observed in previous studies, type X collagen mRNA level was suppressed when cultured on both H- and L-PPE:N. HPPE:N was more effective in decreasing type X collagen expression than LPPE:N. Results also showed that the decreased type X collagen expression was maintained when cells were removed from the PPE:N surfaces and transferred to pellet cultures. Culturing hMSCs from OA patients on PPE:N surfaces and in pellet culture had however no effect on the level of type I collagen mRNA. The present study confirmed the potential of PPE:N surfaces in suppressing type X collagen expression in hMSCs from OA patients. More importantly, when these cells are transferred to pellet cultures, type X collagen suppression is maintained. These results show a promising future for tissue engineering using autologous hMSCs. / Un inconvénient majeur de l'ingénierie tissulaire du cartilage est dû aux niveaux de collagène de type X élevés exprimés dans les cellules souches mésenchymateuses (CSM) des patients arthritiques. Le collagène de type X est un marqueur de l'hypertrophie avancée des chondrocytes, qui est lié à l'ossification endochondrale. Il a été démontré que l'expression du collagène de type X par les CSM différenciées peut être inhibée en présence des polymères plasma enrichies d'azote (PPE:N, nitrogen-rich plasma-polymerized ethylene). Le but de cette étude était de déterminer si la diminution de l'expression du collagène de type X, induite par PPE:N serait maintenue lorsque les CSM sont transférée dans des cultures culots. Les dernières sont un arrangement de cellules mimant la condensation embryonique des CSM résultant ainsi en des chrondrocytes prehypertrophiques. Les CSM ont été obtenus à partir de la moelle osseuse des donneurs subissant une arthroplastie totale de la hanche. Les CSM ont été cultivées sur des boîtes de polystyrène, ainsi que sur deux surfaces de PPE:N différents; à haute (H) et à faible (L) pression de dépôt pendant 7 jours. Les cellules ont été transférées pour 7 jours supplémentaires dans des milieux sans sérum dans la culture culot. L'ARN a été extrait selon un protocole standard TRIzol. L'ARN a été soumis à la RT-PCR avec des amorces spécifiques pour les collagènes de type I et X. Tel qu'observé dans des études antérieures, la quantité de ARNm de collagène X été supprimée lorsque les CSM était cultivées sur les surfaces HPPE:N et LPPE:N. Le HPPE:N était plus efficace pour diminuer l'expression de collagène de type X que le LPPE:N. De plus, la diminution d'expression du collagène de type X a été maintenue bien que les cellules ont été retirées de la surface PPE:N et transférées à des cultures culots. Cependant, le niveau de ARNm du collagène de type I récupéré dans les patients atteints d'arthrose n'a pas été influencé par les surface PPE:N, ni par la culture culot. Cette étude a établie le potentiel des surfaces PPE:N en supprimant l'expression de collagène de type X par les CSM chez les personnes souffrant d'arthrose. Plus important encore, lorsque ces cellules sont transférées à des cultures culots, la suppression du collagène de type X est maintenue. Ces résultats montrent un avenir prometteur pour l'ingénierie tissulaire en combinaison avec les CSM autologues.