Geometric and tomographic methods of reconstructing three-dimensional cerebral blood vessels from two-dimensional digital subtraction angiograms are studied experimentally. / Three-dimensional vessel geometry is reconstructed from center-line coordinates of corresponding vessel branches in both stereo and biplane angiogram pairs. The problem associated with finding corresponding vessel branches in biplane images was shown to be reduced by re-projection of stereoscopically reconstructed vessels. Results indicate that the limiting factor in reconstruction accuracy is the degree of vessel foreshortening in biplane image pairs. / An iterative algorithm ('Clean') is adapted to tomographic reconstruction of vessel cross-sections from a small number of views. Star-pattern artifacts in images initially formed by back-projection are removed by iterative deconvolution guided by 'a priori' object knowledge. This procedure is repeated for a set of two-dimensional sections that describe the three-dimensional vascular structure. Results show that there is sufficient detail in reconstructed sections to determine the location of vascular structures.

The sensitive and specific detection of proteins is at the center of many routine analyses in fundamental research, medical diagnosis, food quality control and environmental safety. The current gold standard for these applications remains the laborious and costly microwell plate ELISA. Over the last decade, new miniaturized devices have emerged: microfluidic systems that can drastically reduce the costs and the time of analysis. Many approaches and designs have been proposed. However, some recurrent difficulties remain that prevent the achievement of a system with the necessary balance between scientific performance, cost-effectiveness and user friendliness. These limitations include the complexity to maintain a constant flow rate in a simple and repeatable fashion, to mix solutions in a laminar flow regime, to control undesired surface effects, and to connect the chip to external pumping instruments. This thesis describes a novel microfluidic immunoassay platform that addresses the aforementioned issues while also achieving highly sensitive parallel measurements for the rapid quantification of protein biomarkers. The development of this platform followed three consecutive stages: (i) the establishment of an initial design for the simple manipulation of solutions in stop-flow mode, and the elaboration of strategies for mixing and for the simultaneous detection of parallel reactions, (ii) the introduction of the concept of Dual Network system, which removes the need for channel passivation against the non-specific adsorption of proteins, and (iii) the optimization of the critical assay parameters for the quantification of the cytokine TNF-alpha. The main attributes of the developed platform are also presented: the straightforward fabrication process, the simplified flow control, the enzymatically generated fluorescent signal, and the multi-purpose use of magnetic beads. These microbeads were utilized as functionalized substrate to capture the analyte, but also to / La détection sensible et spécifique de protéines se trouve au cœur d'analyses de routine dans la recherche fondamentale, le diagnostique médical, le contrôle qualité de la nourriture et la sûreté environnementale. Le standard actuel pour ces applications est toujours le coûteux et laborieux test ELISA en micropuits. Au cours de la dernière décennie, de nouveaux dispositifs miniaturisés ont fait leur apparition : des systèmes microfluidiques pouvant réduire de manière drastique les coûts et les temps d'analyse. Plusieurs approches et designs ont été proposés. Cependant, certaines difficultés récurrentes entravent toujours l'avènement d'un système possédant l'équilibre nécessaire entre la performance scientifique, le maintient de coûts bas, et la facilité d'utilisation. Ces limitations incluent la complixité de fixer une vitesse de flot constante de façon simple et reproductible, de mixer des solutions en régime laminaire, de contrôler les effets de surfaces indésireux, et de connecter la puce à des instruments de pompage externes. Cette thèse décrit une nouvelle plateforme d'immunoessais microfluidiques, qui adresse les problèmes mentionnés tout en réalisant des mesures hautement sensibles et en parallèle pour la quantification de biomarqueurs protéiques. Son développement a suivi trois étapes consécutives : (i) l'établissement d'un design initial pour la manipulation aisée de solutions en mode stop-flow, l'élaboration de stratégies de mixage et de détection simultanée de réactions parallèles, (ii) l'introduction du concept de système Dual Network, qui supprime la nécessité de passiver les canaux contre l'adsorption non-spécifique de protéines, et (iii) l'optimisation des paramètres critiques de l'essai pour la quantification de la cytokine TNF-alpha. Les attribues principaux de la plateforme sont également présentés : le procédé de fabrication rapide, le contrôle du flot simplifié, le signal$

Myeloid cell leukemia 1 (MCL-1), an anti-apoptotic BCL-2 member, is active in the preservation of mitochondrial integrity during apoptosis. By collective data from nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and titration calorimetry, we revealed the selectivity of MCL-1 in binding BH3 ligands of interest to mammalian biology, and proved that the core domain of MCL-1 (cMCL-1) is necessary and sufficient for BH3 ligand binding. We characterized the in vitro protein-protein interaction between cMCL-1 and activated BID, which occurs in a very slow manner in solution but is otherwise similar to the interaction between cMCL-1 and BID-BH3 peptide. We also present the solution structure of complex cMCL-1:BID-BH3, which may greatly facilitate drug discovery studies of human tumor malignancies. BAK, a multi-region pro-apoptotic protein, directly mediates the mitochondrial outer membrane permeablization (MOMP). We completed a structural investigation of BAK by X-ray crystallography. We report two structures of BAK's homo-dimers, one zinc-mediated (cBAK) and one disulphide-bond-linked (cBAK-o). Their dimerizing sites locate closely at D160 and H164 in cBAK and C166 in cBAK-o, which allow them to compose a unique regulatory element to switch BAK's activity as suggested in mitochondria activity-testing assays. BAK is tightly regulated through protein-protein interactions by MCL-1. We characterize the conformational changes in BAK and MCL-1 using detergents to mimic the membrane environment, and studied their interaction in vitro. The non-ionic detergent IGEPAL and the zwitterionic detergent CHAPS have different effects on these two proteins, but both initiate the heterodimerization. The complex of MCL-1 and BAK can be disrupted by either a BID-BH3 peptide, which acts through binding to MCL-1, or a mutation in BH3 region of BAK (L78A), demonstrating the essential role of BAK's BH3 in its regulation by MCL-1. This thesis concludes with a hybrid model for BAK activation: / La protéine MCL-1 (Myeloid cell leukemia 1), qui appartient à la classe de protéines anti-apoptotiques BCL-2, joue un rôle dans le maintien de l'intégrité mitochondriale durant l'apoptose. Les résultats obtenus par résonance magnétique nucléaire (RMN) et par titrage calorimétrique, nous ont permis de mettre en évidence la sélectivité de la protéine MCL-1 pour les ligands mammifères d'interêt biologiques qui contiennent le motif BH3 et nous avons ainsi démontré que le domaine central du facteur MCL-1 (cMCL-1) est nécessaire et suffisant pour cette interaction. Nous avons caractérisé in vitro l'interaction entre le domaine cMCL-1 et le facteur activé BID; cette interaction se produit lentement en solution mais est similaire à celle observée entre le domaine cMCL-1 et le peptide BID-BH3. De plus nous avons résolu la structure du complexe cMCL-1:BID-BH3, qui est une cible potentielle qui pourrait être à la base d'un criblage d'une banque de petites molécules dans le cas de tumeurs humaines malignes. BAK, une protéine pro-apoptotic modulaire, permet la perméabilité de la membrane externe de la mitochondrie: ce mécanisme est dénommé “MOMP” pour “the mitochondrial outer membrane permeablization”. Nous avons accompli l'étude structurale de la protéine BAK par cristallographie et diffraction de rayons X. Nous présentons deux complexes de la protéine BAK: un homodimère lié par une molécule de zinc (cBAK) et une qui contient un pont disulfure (cBAK-o). Le site de dimérisation se situe proche des résidu D160 et H164 pour cBAK et C166 pour cBAK-o, ce qui leur confère un élément de régulation unique pour moduler l'activité de BAK comme suggéré dans des essais d'activité mitochondriale. La protéine BAK est finement régulée grâce à son interaction protéine-protéine avec MCL-1. Nous avons caractérisé les changements conformations des facteurs BAK et MCL-1 à l'aide de détergents pour modéliser un environnement m

The blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) signal is one of the most recently developed imaging techniques used to identify localized changes in brain activity. The BOLD signal is a function of cerebral blood flow (CBF), the cerebral metabolic rate of oxygen consumption (CMRO2), and cerebral blood volume (CBV). Normally coupled changes in these physiological parameters during regional increases in neural activity will result in BOLD signal increases. This makes the BOLD signal useful as a tool for identifying areas of increased neural activity. Moreover, it can also be used to infer changes in neurophysiology as a response to certain stimuli in the healthy brain, in individuals with certain neurological conditions affecting the cerebrovasculature and under the effect of some types of drugs. There is a major challenge to be faced when using the BOLD signal to study neurophysiological changes that occur under the effect of certain drugs or in the case of neurovascular disease. Under these circumstances, the underlying physiology and normally coupled vascular/metabolic response to a stimulus will be altered. Consequently, changes seen in the BOLD signal during regional increases in neural activity may not be associated with the same neurovascular changes that would occur in the healthy brain. Caffeine is an example of a widely used drug which has been shown to elicit such changes in the neurophysiological state. Two experiments were performed on a group of healthy volunteers in order quantify the effects of caffeine on both baseline neurophysiology and the BOLD signal changes evoked during a visual stimulus. The first involved the measurement of the oxygen extraction fraction(OEF) by performing venous blood magnetic resonance (MR) relaxometry and the second, the measurement of the BOLD and CBF response to a visual stimulus. The results obtained demonstrate that after caffeine consumption there is an increase in baseline OEF (OEF0) and a decrease in baseline CBF (CBF0), but a non-significant change in baseline CMRO2 (CMRO2,0). The caffeine-induced change in the individual BOLD and CBF response to a visual stimulus was found to correlate negatively with individual caffeine-induced change in CBF0. However, the average percent change in visually evoked BOLD and CBF signals across all subjects remained unaltered following caffeine consumption, whereas the CMRO2 response to a visual stimulus was found to increase. / L'effet BOLD (blood oxygenation level dependent) est l'une des plus récentes techniques d'imagerie par résonance magnetique (IRM) utilisée pour identifier les changements localisés d'activité cérébrale. Le signal BOLD varie en fonction de la circulation sanguine cérébrale (CBF), du taux métabolique cérébral de la consommation d'oxygène (CMRO2), et du volume sanguin cérébral (CBV). Les changements normalement-couplés de ces paramètres physiologiques lors d'une augmentation régionale d'activité neurale causeront une augmentation du signal BOLD. Cela rend le signal BOLD utile comme outil pour identifier les régions d'augmentation de l'activité neuronale. Deplus, le signal BOLD permet de déterminer quels changements neurophysiologiques suivent certains stimulus dans les cas suivants : le cerveau sain; le cerveau de personnes atteintes d'affections neurologiques affectant la cérébrovasculature; et le cerveau sous l'effet de certains types de médicaments. Un défi majeur se présente lorsque le signal BOLD est utilisé pour étudier les changements neurophysiologiques se produisant sous l'effet de certains médicaments ou en cas de maladie neuro-vasculaire. Lors de ce type d'utilisation, la physiologie sous-jacente et la réponse normalement-couplée vasculaire/métabolique à un stimulus est altérée. Par conséquent, les changements observés dans le signal BOLD au cours des augmentations régionales d'activité neuronale ne correspondent pas aux changements neurovasculaires qui se produisent normalement dans le cas du cerveau sain. La caféine est un médicament couramment utilisé qui a suscité de tels changements dans l'état neurophysiologique. Deux expériences ont été réalisées sur un groupe de volontaires sains dans le but de quantifier les effets de la caféine sur la neurophysiologie de base et les changements évoqués sur le signal BOLD lorsd'un stimulus visuel. La première expérience mesure la fraction de l'extraction d'oxygène (OEF) en effectuant de la relaxométrie par résonance magnetique sur le sang veineux. La deuxième expérience mesure la réponse du signal BOLD et CBFà un stimulus visuel. Les résultats montrent que, après la consommation de caféine il y a une augmentation de l'OEF, une augmentation de la réponse du CMRO2 au stimulus visuel, une diminution de la CBF de base (CBF0) et un changement non-significatif du CMRO2 de base (CMRO2,0). On observe une corrélation négative entre les changements générés par la consommation de caféine sur les réponses du signal BOLD et de la CBF au stimulus visuel et les changements générés par la consommation de caféine sur la CBF0. Néanmoins, en moyenne, la consommation de caféine ne génére aucun changement sur la réponse du signal BOLD et de la CBF au stimulus visuel.

The primary aim of this thesis is the reconciliation of two seemingly disparate quantitative magnetic resonance imaging (MRI) techniques proposed to characterize human brain white matter (WM) in health and disease. Quantitative magnetization transfer imaging (QMTI) and multi-component analysis of T2 relaxation (QT2) both attempt to quantify myelin content in vivo, but are based on fundamentally different models of WM. QMTI probes the macromolecular component of tissue using a two-pool model of magnetization transfer, while QT2 isolates the water signal from distinct micro-anatomical compartments. The specific objectives were to determine the interrelationship between measurements made with both techniques in the context of potential pathological changes associated with multiple sclerosis (MS), and to apply both to track WM changes in the acute phase of MS lesions. First, simulations were used to evaluate the theoretical sensitivity of each technique to the characteristics of a model of WM that incorporates four pools of magnetization, based on published in vitro measurements. Next, the experimental reproducibility of each technique was investigated, and the impact of certain basic variations in the data acquisition and analysis procedures was evaluated. In the final stage, both methods were applied longitudinally in vivo to assess the dynamic changes that occur in acute, contrast-enhancing lesions of MS. The theoretical results illustrate the sensitivity and limitations of QMTI and QT2 to specific pathology-inspired modifications of WM, and shed new light on the potential specificity of often-neglected QMTI parameters. The reproducibility of both techniques is acceptable for use in repeated clinical measurements, and QMTI has lower variability overall. The importance of corrections for magnetic field inhomogeneity in QMTI is demonstrated, and a simple optimization of the QMTI data acquisition is introduc / L'objectif principal de cette thèse est la réconciliation de deux techniques quantitatives d'imagerie par résonance magnétique, en apparence difféerentes, utilisées pour la caractérisation de la susbtance blanche du cerveau humain en santé ou affectée par la maladie. Les techniques d'imagerie quantitative par transfert de magnétisation (QTM) et d'analyse de la relaxation T2 par de multiples composantes (QT2) proposent toutes deux des mesures in vivo de la quantitée de myéline, mais à l'aide de modèles fondamentalement différents. D'un côté, l'imagerie QTM sonde la composante macro-moléculaire des tissues à l'aide d'un modèle à deux réservoirs pour le transfert de magnétisation. De l'autre, l'imagerie QT2 sépare les signaux acqueux provenant de compartiments micro-anatomiques distincts. Plus spécifiquement, cet ouvrage cherche à mieux comprendre l'interdépendance des mesures de ces deux techniques dans le contexte pathologique de la sclérose en plaques (SEP), pour ensuite les appliquer à l' étude de lésions aigues de SEP. En premier lieu, des simulations ont été effectuées pour évaluer la sensibilité de chaque technique aux caractéristiques d'un modèle plus complet de la substance blanche, qui découle de résultats in vitro publiés et incorpore quatre réservoirs de magnétisation. Ensuite, la reproductibilité de chacune des techniques a été évaluée; de plus, quelques variations élémentaires des méthodes d'acquisition et d'analyse des données examinées. En dernier lieu, les deux techniques ont été utilisées in vivo afin de mesurer les changements dynamiques des lésions aigues de SEP, présentant un hyper-signal rehaussée par un agent de contraste. Les résultats des simulations démontrent d'un point de vue théorique la sensibilité et les limites de chacune de ces technique aux changements dans la substance blanche. Ces résultats apportent égalem

The effect of shear rate on the ADP-induced aggregation of human blood platelets in flow through tubes was studied over the full physiologically significant range. The extent of single platelet aggregation at 0.2 $ mu$M ADP in citrated platelet-rich plasma, PRP, was greatest at mean tube shear rate, G = 314 s$ sp{-1}$; however, aggregate size steadily decreased from G = 39.3 to 1800 s$ sp{-1}$. At 1.0 $ mu$M ADP the rate of aggregation increased up to G = 1800 s$ sp{-1}$ where virtually no unaggregated platelets remained after 43 s of flow, although, aggregate size was still limited by shear rate. A shear-dependent delay in the onset of aggregation and an increase in collision efficiency with time suggest the existence of a time and shear-dependency in the expression of bonds mediating aggregation. Greater aggregation of platelets from female donors than male donors was due to differences in the ionized calcium concentration, (Ca$ sp{2+}$), in the plasma of donors of different hematocrit when the chelating agent citrate is used as anticoagulant. At physiological (Ca$ sp{2+}$) aggregation was much greater in heparinized and hirudinized plasma than in citrated plasma and no sex difference was present. Aggregation in whole blood was much greater than in PRP due to a shear-dependent increase in the frequency of collision between activated platelets caused by the motion of red cells.

Photodynamic therapy (PDT) is a treatment that makes use of light and a photosensitizing drug to destroy malignant cells. Current clinically approved drugs suffer from many limitations; the most prevalent of these is due to the absorption coefficient of human tissues in the wavelength regime where these drugs are excitable. Semiconductor quantum dots (QDs) can overcome this drawback since they can be synthesized to become excited at any wavelength. The goal of this thesis is to explore the possibility of using core/shell Indium Phosphide/Zinc Sulfide (InP/ZnS) quantum dots (QDs) for photodynamic therapy applications. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy and colorimetric assays were used to identify the nature of toxic species produced. From these findings, the physical mechanism by which these particles produce toxic species is discussed. It was found that InP/ZnS QDs produced superoxide anions and hydroxyl radicals, the levels of which depended on the ZnS shell thickness. Furthermore, the level of cellular uptake was studied in different cell lines using confocal microscopy. It was found that InP localized in the perinuclear region of all cell lines and that B16 melanoma cells showed the most efficient levels of uptake (2.5 times greater than the uptake from KB cells). Lastly, conjugation of InP QDs to the chemotherapeutic drug doxorubicin (Dox) was studied using flow cytometry and colorimetric assays. It was found that conjugation of Dox to InP led to enhanced levels of cell death; it is proposed that this was due to more efficient drug delivery by the conjugate. In summary, photosensitization processes in InP/ZnS QDs can be exploited for PDT applications; these particles also prove to be promising as a drug delivery agent. Despite this, photophysical processes of these QDs must be further explored to ameliorate their design for PDT. / La thérapie photodynamique (TPD) est un traitement médical qui détruit les cellules cancéreuses en utilisant des photons de lumière, typiquement en forme de laser, afin d'activer des drogues photosensibles. Présentement, les médicaments approuvés pour usage clinique ont d'importantes limitations. Particulièrement, le coefficient d'absorption des tissus humains se retrouve dans la même gamme de longueur d'onde où les médicaments sont excitables; par conséquent, leur efficacité est compromise. Les nanoparticules de matériaux semi-conducteurs, appelées aussi points quantiques (PQs), ont l'habilité de surpasser cette limitation parce qu'ils peuvent être produits pour absorber la lumière à n'importe quelle longueur d'onde. L'objectif de cette thèse est donc d'évaluer la possibilité d'utiliser les PQs pour la TPD. Plus spécifiquement, les PQs composés d'un cœur de phosphure d'indium (InP) avec une coquille du sulfure de zinc (ZnS) ont été examinés. La spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (RPE) et les tests colorimétriques ont été utilisés pour identifier la nature des espèces toxiques produites, ainsi que le mécanisme responsable de leur formation. Les résultats ont montré que les particules de InP/ZnS produisent des anions de superoxyde et des radicaux d'hydroxyle; la quantité des radicaux formés dépend de l'épaisseur de la coquille ZnS. En plus, la microscopie confocale a été utilisée pour évaluer l'ingestion intracellulaire des PQs par divers types de cellules. Ces images ont démontré que les PQs se concentrent dans le cytoplasme autour du noyau et que les cellules mélanomes de type B16 sont celles qui absorbent le plus (2.5 fois plus que les cellules KB). Finalement, les PQs ont été conjuguées à un agent chimiothérapeutique (doxorubicin (Dox)) et leur toxicité a été explorée par cytométrie en flux et des tests colorimétriques. La mort cellulaire a augmenté avec l'attachement de PQs, ce qui s'explique par une amélioration de la livraison intracellulaire de Dox. En conclusion, les PQs InP/Zn révèlent être des candidats prometteurs en tant que médicaments et agents de livraison pour la TPD, cependant certains éléments de leur structure restent à être améliorés.

Numerical simulations are invaluable in the development and understanding of magnetic resonance imaging (MRI) techniques. Motivated by the goal of understanding the behaviour of the functional MRI (fMRI) signal in brain tissue, this thesis employs a deterministic simulation technique in which the transverse magnetization and B0 inhomogeneity within a voxel are spatially discretized and the stochastic self-diffusion of water molecules is modelled as a Gaussian isotropic blurring of the transverse magnetization. While this simulation technique has existed since fMRI was in its infancy, its use has increased recently as investigators have attempted to quantitatively interpret the measured signal. Despite its recent popularity, thorough quantitative validation of the technique is lacking in the literature.With the development of quantitative fMRI techniques being the driving force, this thesis validates three-dimensional deterministic simulations of the MR signal with a focus on their application in cerebral microvasculature. Individual blood vessels are modelled by infinite cylinders with a realistic distribution of radii. Using a spin echo sequence, the effects of several simulation parameters are investigated.Validations ignoring the effect of diffusion show that the discretization of the voxel into subvoxels can be very coarse – up to 10 μm subvoxel widths – without adversely affecting the simulation outcomes. Simulations including diffusion are validated using an analytical solution to the Bloch-Torrey equation for comparison. In the presence of diffusion, subvoxel size is a key factor and it needs to be sufficiently small (~ 2 μm), depending on the rest of the simulation parameters, in order for the simulations to be accurate. Finally, as a proof-of-concept, it is shown that larger subvoxels can be used and still produce accurate simulations if the diffusion coefficient is scaled by a correction factor to produce the desired time series. / Les simulations numériques sont d'une valeur inestimable pour le développement et la compréhension des techniques d'imagerie par résonance magnétique (IRM). Cette thèse, motivée par le but de comprendre le comportement du signal de l'IRM fonctionnelle (IRMf) dans le tissu cérébral, utilise une technique de simulation déterministe dans laquelle la magnétisation transversale et l'inhomogénéité B0 au sein d'un voxel sont spatialement discrétisées et l'auto-diffusion stochastique des molécules d'eau est modélisée par un flou gaussien isotrope de la magnétisation transversale. Bien que cette technique de simulation existe depuis les débuts de l'IRMf, son utilisation a augmenté récemment par des chercheurs tentant d'interpréter quantitativement le signal mesuré. Malgré sa popularité récente, une validation quantitative approfondie de cette technique est absente de la littérature.Ayant pour force motrice le développement de techniques d'IRMf quantitatives, cette thèse valide des simulations tridimensionnelles déterministes du signal IRM en mettant l'emphase sur leur application dans la microvascularisation cérébrale. Les vaisseaux sanguins individuels sont modélisés par des cylindres infinis avec une distribution de rayons réaliste. Les effets de plusieurs paramètres de simulation sont étudiées en utilisant une séquence écho de spin.Des validations ignorant l'effet de diffusion montrent que la discrétisation des voxel en sous-voxels peut être très grossière - jusqu'à des tailles de sous-voxels de 10 μm - sans détériorer les résultats de la simulation. Des simulations tenant compte de la diffusion sont validées à l'aide d'une solution analytique à l'équation de Bloch-Torrey. En présence de diffusion, la taille des sous-voxels est un facteur clé et doit être petite (~ 2 μm, dépendamment des autres paramètres de simulation) pour que les simulations soient précises. Enfin, comme preuve de concept, il est démontré que des simulations précises peuvent être obtenues avec des sous-voxels plus grands pourvu que le coefficient de diffusion soit multiplié par un facteur de correction pour produire la série temporelle désirée.

The Varian TrueBeam STx linear accelerator features a developer's mode in which treatment plans can be programmed that include patient couch motion during radiation delivery. The combination of synchronous couch/gantry trajectories with Varian volumetric modulated arc therapy (VMAT) optimizations, called RapidArc, can result in a treatment technique that has been designated Virtual Isocenter RapidArc (VIRA). Prior to its implementation, the accuracy of dose calculations in the Varian Eclipse treatment planning system, on which the RapidArc optimization depends, must be validated, as well as the positional accuracy of the TrueBeam patient couch. The dose calculation accuracy was evaluated extrinsically through the delivery of clinical dynamic multileaf collimator (DMLC) intensity modulated radiotherapy (IMRT) treatment plans as a function of source-to-surface distance (SSD) and measurement with ionization chamber and Gafchromic EBT3 film. Parameters intrinsic to dose calculations in Eclipse, the dosimetric leaf gap (DLG) and leaf transmission (LT), were also investigated for their dependence on SSD. The positional accuracy of the treatment couch was assessed through the generation of treatment plans with static couch/gantry, static couch/rotating gantry, and synchronous couch and gantry motion, with measurement of the real-time ionization chamber current positioned in a cylindrical phantom during radiation delivery. The relative agreement of ionization chamber measurements to Eclipse dose calculations for DMLC IMRT treatment plans decreased by 1.5±0.3% over SSDs in the range of 85 cm to 135 cm (less than 1.0% deviation from standard clinical reference conditions of 100 cm SSD). Gafchromic EBT3 film measurements were consistent with ionization chamber results, though noise in the film data at low doses resulted in large uncertainties. Measurements of DLG were independent of SSD, following corrections for geometric projection. LT showed a dependence on SSD of 0.09±0.02% over the SSD range investigated. The ionization chamber current measurements for synchronous couch and gantry rotation, analogous to the proposed VIRA technique, indicated a maximum deviation of 0.2 cm relative to treatment isocenter, equal to the deviation observed for the rotating gantry/static couch treatment, analogous to conventional VMAT delivery. These results indicate that the Varian TrueBeam and Eclipse maintain the necessary positional and dosimetric accuracy required for VMAT treatments involving dynamic couch trajectories. / L'accélérateur linéaire TrueBeam STx de Varian possède un mode d'utilisation avancé où des plans de traitement peuvent être programmés pour inclure un mouvement de la table où repose le patient pendant le traitement. La combinaison des trajectoires synchronisés de la table de traitement ainsi que du gantry avec la plate-forme d'optimisation RapidArc pour la radiothérapie conformationnelle avec modulation d'intensité volumétrique (VMAT) produit une technique de traitement appelée RapidArc avec isocentre virtuel (VIRA). En vue de réaliser cette nouvelle technique, la justesse du calcul de dose dans la plate-forme de planification de traitements Eclipse, sur laquelle l'optimisation RapidArc dépend, doit être validée ainsi que la justesse du positionnement de la table de traitement. La justesse du calcul de dose fut évaluée de façon extrinsèque en comparant le résultat de la plate-forme RapidArc pour un plan de traitement de radiothérapie conformationnelle avec modulation d'intensité (IMRT) utilisant un collimateur multilames dynamique (DMLC) à des valeurs mesurés à l'aide d'une chambre d'ionisation ainsi que des films Gafchromic EBT3 en fonction de la distance entre la source et la surface (SSD) d'un phantôme. La dépendence sur SSD de deux paramètres instrinsèques au calcul de dose dans Eclipse, l'écart dosimétrique entre les lames (DLG) et la transmission des lames (LT) fut aussi étudiée. La justesse du positionnement de la table de traitement fut évaluée en produisant des plans de traitements avec la table et le gantry stationnaire, la table stationnaire et le gantry en mouvement ainsi qu'avec le mouvement synchronisé de la table et du gantry, tout en ayant une chambre d'ionisation positionnée dans un phantôme cylindrique durant la période d'irradiation. L'accord relatif entre les valeurs obtenus de la chambre d'ionisation et ceux d'Eclipse pour les plans DMLC IMRT est descendu de 1.5±0.3% en changeant le SSD de 85 cm jusqu'à 135 cm (moins de 1% de deviation des conditions de références clinique où le SSD est de 100 cm). Les valeurs obtenus à partir des films Gafchromic EBT3 sont en accord avec ceux de la chambre d'ionisation. Par contre, le bruit dans les données du film à basses doses a produit une grande incertitude. En corrigeant pour la projection géométrique, les valeurs du DLG ont été observé comme étant indépendantes du SSD. Le LT a démontré une dépendence sur le SSD de 0.09±0.02% sur la portée de SSD étudiés. Les valeurs de la chambre d'ionisation pour le mouvement synchronisé de la table de traitement et du gantry proposé pour la technique VIRA ont indiqué une déviation maximale de 0.2 cm relativement à l'isocentre du traitement. La même déviation fut observé pour le traitement où la table était stationnaire et le gantry était en mouvement, ce qui correspond aux traitements conventionnels VMAT. Ces résultats démontrent que l'accélérateur linéaire TrueBeam de Varian ainsi q'Eclipse maintiennent la justesse dosimétrique nécéssaire pour les traitements VMAT impliquant des trajectoires dynamiques de la table de traitement.

Aminoglycosides are broad-spectrum antibiotics that corrupt normal protein synthesis by acting on the coding and translocation mechanisms of the 30S ribosomal subunit. The most common mechanism of resistance to this class of antibiotics is enzymatic modification. There are three families of aminoglycoside modifying enzymes: the N-acetyltransferases (AAC), the O-phosphotransferases (APH), and the O-adenyltransferases (ANT). The focus of this thesis is on the APH and ANT families. Spectinomycin kinase (SpcN), also referred to as APH(9)-Ib, catalyzes the phosphorylation of spectinomycin exclusively, rendering it inactive. It shares its substrate specificity with APH(9)-Ia, for which the crystal structure has been described (Fong et al, 2010). Structural elements related to substrate binding remain largely conserved within the APH family, and the structural characterization of various APHs can provide valuable insight into structure-function relationships, such as substrate spectrum. Here, we report initial overexpression and purification methods for SpcN and explore solubilization methods to improve protein overexpression. Aminoglycoside nucleotidyltransferase (2”)-Ia (ANT(2”)-Ia) is among the most prevalent and widespread AMEs in North America (Ramirez & Tomalsky, 2010). It catalyzes the transfer of adenosine monophosphate to the 2” position of 4-6-disubstituted aminoglycosides, preventing binding to the 30S ribosomal subunit. Its clinical relevance makes it an important target for structure-based drug design. Previous studies of ANT(2”)-Ia were limited due to the formation of inclusion bodies during ANT(2”)-Ia overexpression (Ekman et al., 2001). Here, we report the increase in protein solubility and stability as a result of cleaving 50 extraneous amino acids from the N-terminus. Overexpression and purification of this construct yields 17 mg of soluble, stable, and active protein per liter of culture. We used heteronuclear single quantum correlation (HSQC) and HNCACB, CBCAcoNH triple resonance NMR experiments to characterize the protein. We sequentially assigned 144 of the 176 non-proline amide backbone residues of ANT(2”)-Ia. Titration analyses of ANT(2”)-Ia with tobramycin and ATP separately at 1:1 concentration ratios show unique global chemical shift perturbations for each, suggesting different binding pockets for both substrates. / Les aminosides sont une classe d'antibiotiques à large spectre qui affectent l'efficacité de la synthèse protéique. Parmi les mécanismes de résistance contre cette classe d'antibiotique, l'inactivation enzymatique est le plus souvent fréquenté. Il existe trois classes d'enzymes capable d'inactiver les aminosides: les N-acetiltransferases (AAC), les O-phosphotransferases (APH), et les O-adeniltransferases (ANT). Cette thèse discutera les familles ANT et APH. Spectinomycin kinase (SpcN), aussi nommé APH(9)-Ib, catalyse la phosphorylation et l'inactivation de l'aminoside spectinomicin exclusivement. Il partage cette spécificité du substrat avec APH(9)-Ia, pour lequel la structure cristallographique à déjà été caractérisée (Fong et al., 2010). Étant donné que les éléments structurels reliés à la liaison du substrat et au site de reconnaissance sont largement conservés parmi les membres de la famille APH, les études sur la configuration tridimensionnelle des APH fournissent des informations importantes sur la relation entre structure et fonction, dont la spécificité du site de reconnaissance par exemple. Cette thèse explique les démarches prisent pour exprimer, solubiliser et purifier SpcN.L'aminoside nucleotidilstransferase 2"-Ia (ANT(2")-Ia) est parmi les enzymes de résistance contre les aminosides les plus souvent fréquentés (Ramirez & Tomalsky, 2010). Il catalyse le transfert de adénosine monophosphate à la position 2" des aminosides 4,6-bisubstituées, ce qui les empêchent de se lier au sous-unité 30S du ribosome. Son importance dans le milieu clinique fait en sorte qu'il et un cible intéressant pour la recherche et le développement d'antibiotiques basée sur les structures tridimensionnelles. À date, les études sur ANT(2")-Ia on été limitées par le fait qu'il s'exprime de façon non soluble (Ekman et al., 2001). Nos études, décrient dans cette thèse, propose une nouvelle forme soluble et active de ANT(2")-Ia qui serait la version plus physiologiquement exacte. Nous avons pu obtenir 17 mg de protéine pure, soluble et active à partir d'un litre de culture. Nous avons fait l'attribution séquentielle des déplacements chimiques des atomes de la chaîne principale par RNM en utilisant des expériences bi- et tri-dimensionnelles, dont HSQC et HNCACB et CNCAcoNH. Nous avons complété l'attribution de 144 des 176 résidus (excluant les prolines). Nous avons aussi fait des analyses de titration avec les substrats de ANT(2")-Ia, ATP et tobramicin séparément, à une concentration de 1:1. Ces analyses démontrent des perturbations globales des déplacement chimiques uniques pour chaque interaction, ce qui suggère que les sites de reconnaissances pour chaque substrat sont différents.