In fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS), fluctuations in the fluorescence signal emitted by molecules diffusing in a sample of interest are analyzed to extract information about the properties of the molecules themselves, such as their concentration, molecular brightness, or diffusion coefficients. Most techniques, however, either analyze correlations over time to extract information about the diffusion properties of the sample, or analyze fluctuations in the amplitude to extract information about the molecular brightness of the different species in the sample, but cannot do both. We first extend dual color photon counting histograms theory, a brightness analysis method that monitors the brightness of different species in two spectral channels, so that the observation volumes in each channel can be of different sizes, which is necessary if different excitation wavelengths are used for each channel. We then extend the theory so that the two channels can be shifted in time from one another, so that both correlation information and amplitude information can be extracted simultaneously. This new method, which we call correlated photon counting histograms (cPCH), is sensitive to both the brightness and diffusion properties of the sample of interest. We also derive expressions for the factorial cumulants of cPCH, which provide a convenient and efficient means of summarizing the information in the distributions. We show that fluorescence correlation spectroscopy (FCS) curves can be generated using the first joint moment of the cPCH distribution, while a regular photon counting histogram (PCH) can be generated at any time shift by summing over the photon counts in one channel. We show, using simulated data, that cPCH can resolve two different species with less uncertainty than either FCS or PCH if the two species differ in both their brightness and diffusion properties. If spectral information can be used as well, dual color cPCH can resolve two different species with less uncertainty than single channel cPCH. We develop a novel fitting algorithm that takes advantage of the analytical solutions to the factorial cumulant equations to sample the parameters that are consistent with the data, by resampling the measured factorial cumulants using the measured variances of each factorial cumulant. We show, using simulated data, that the parameter set that results in the minimum fit energy is often a poor estimate of the actual parameters used to create the data. We develop extensions to the theory that take into consideration triplet states, longer binning times, detector dead-times, and detector afterpulsing. Next, we extend cPCH so that it can be applied to images. Spatial cPCH allows both immobile and mobile species in a series of images to be resolved, using their brightness and diffusion properties, and can be used to generate spatiotemporal information about the different species in the sample. Finally, we develop models to take into account the effect that the photomultiplication process in analog photomultiplier tubes can have on the signal statistics, making fluorescence fluctuation spectroscopy techniques such as spatial cPCH available to a wider range of researchers. / En spectroscopie de fluctuation de fluorescence (FFS), les fluctuations du signal de fluorescence émis par des molécules diffusantes dans un échantillon d'intérêt sont analysés pour extraire des informations sur les propriétés des molécules elles-mêmes, comme leur concentration, la luminosité moléculaire, ou des coefficients de diffusion. Cependant, la plupart des techniques analyse des corrélations dans le temps pour extraire des informations sur les propriétés de diffusion de l'échantillon, ou bien analyse les fluctuations de l'amplitude pour extraire des informations sur la luminosité moléculaire des différentes espèces dans l'échantillon, mais ne peut pas faire les deux. Nous étendons d'abord la théorie de histogramme de comptage de photons bicolores, une méthode d'analyse de la luminosité qui surveille la luminosité de différentes espèces dans deux canaux spectraux, de sorte que les volumes d'observation dans chaque canal peut être de tailles différentes, ce qui est nécessaire si des longueurs d'onde d'excitation différentes sont utilisées pour chaque canal. Ensuite nous améliorons la théorie de telle sorte que les deux canaux peuvent être décalées dans le temps les uns des autres, de sorte que les détails de corrélation et d'amplitude peuvent être extraits simultanément. Cette nouvelle méthode, que nous appelons histogramme de comptage de photons corrélés (cPCH), est sensible à la luminosité et des propriétés de diffusion de l'échantillon d'intérêt. Nous dérivons également des expressions pour les cumulants factoriels de cPCH, qui fournissent un moyen pratique et efficace de résumer l'information contenue dans les distributions. Nous montrons que les courbes de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) peuvent être générées en utilisant le premier moment conjoint de la distribution cPCH, tandis qu'un histogramme de comptage de photons (PCH) régulier peut être généré à tout décalage dans le temps par sommation sur les comptages de photons dans un canal. Nous montrons, en utilisant des données simulées, que le cPCH peut résoudre deux espèces différentes avec moins d'incertitude que soit FCS ou PCH si les deux espèces sont distiguées à la fois par leur luminosité et leur propriétés de diffusion. Si l'information spectrale peut être utilisée aussi bien, cPCH bicolore peut résoudre deux espèces différentes avec moins d'incertitude que cPCH seul canal. Nous développons un nouvel algorithme de montage qui utilise des solutions analytiques aux équations cumulants factoriels pour échantillonner les paramètres qui sont compatibles avec les données, par rééchantillonnage des cumulants factoriels mesurées en utilisant les variances mesurées de chaque cumulant factoriel. Nous montrons, en utilisant des données simulées, que le jeu de paramètres qui se traduit par l'énergie d'ajustement minimale est souvent une mauvaise estimation des paramètres réels utilisés pour créer les données. Nous développons des extensions de la théorie qui considères les états triplets, les intervalles de classe plus longues, le temps morts du détecteur, et les post impulsions (afterpulsing) du détecteur. Ensuite, nous étendons cPCH afin qu'il puisse être appliqué aux images. cPCH spatiale permet de résoudre des espèces à la fois immobiles et mobiles dans une série d'images, à l'aide de leur luminosité et de leurs propriétés de diffusion, et peut être utilisé pour générer des informations spatio-temporelle sur les différentes espèces dans l'échantillon. Enfin, nous développons des modèles pour tenir compte de l'effet que le processus de photomultiplication dans les tubes photomultiplicateurs analogues peut avoir sur les statistiques du signal, ce qui rend les techniques de spectroscopie de fluctuation de fluorescence comme cPCH spatiale disponible à un éventail de chercheurs plus large.

Living cells, depending on their physiological functions, are subjected to a variety of mechanical stimulation. The magnitude and frequency of such mechanical stimulation varies dramatically in different organs. Oscillatory mechanical stimulation at relatively high frequancies, as occurs in walking, respiration and circulation, is one of the most extensively studied schemes. However, the stimulation at extremely low frequencies is rarely examined. This research investigates the effects of relatively low frequency mechanical stimulation in molecular scale, on different cell types. Throughout the work presented in this document, the emphasis was on the stem cells differentiation, and primary cells dedifferentiation. The results suggested that performing extremely slow activities, namely low frequency movements, significantly affects the differentiation pathways of stem cells. In addition, it was found that slow movement of surface culture area enhances phenotypical characteristics of primary cells. / Toutes les cellules vivantes, selon leur fonctions physiologiques, sont soumises à différentes stimulations mécaniques. L'ampleur et la fréquence de ces stimulations mécaniques varies considérablement d'un organe à un autre. Les stimulations oscillantes dues notamment à la marche, la respiration et la circulation sanguine sont largement étudiées. Par contre, les travaux concernant les stimulations a très faibles fréquences sont rare. Cette recherche examine les effets sur différents types de molécules, des stimulations mécaniques à relativement basse fréquence, à l'échelle moléculaire. Tout au long du travail présenté ici, l'accent a été mis sur la différenciation des cellules souches et la dedifférenciation des cellules primaires. Les résultats suggèrent que la pratique d'activités extrêmement lentes, à savoir les mouvements à basse fréquence, affectent, de manière significative, le mécanisme de différentiation des cellules souches. En outre, il a été constaté que les mouvements lents à la surface des cultures améliorent les caractéristiques phénotypiques des cellules primaires.

Muscles are the motors of human movement. The most commonly accepted theory of muscle contraction, the "crossbridge theory", was postulated by A.F Huxley in 1957, and since then it has been widely accepted to model and explain how a muscle contracts. However, some phenomena are still not fully understood in the framework of the crossbridge theory, including the effects of muscle stretching and shortening on force production. More specifically, there is still controversy in the literature about the mechanisms responsible for the increase in force observed during and after stretch, and the decrease in force observed during and after shortening. The goal of the studies presented in this thesis was to investigate the mechanisms responsible for changes in force during and after length changes to test the following hypotheses: (i) force development during stretch is caused by crossbridges in a pre-powerstroke state, (ii) force development during shortening is affected by biasing crossbridges into pre-powerstroke, (iii) force enhancement after stretch is due to an increase in the number of attached crossbridges, (iv) force enhancement after stretch is caused by half-sarcomere non-uniformities, (v) force enhancement after stretch is caused by stiffening of non-contractile proteins induced by Ca2+, and (vi) force depression after shortening is caused by a decrease in the number of attached crossbridges. In order to achieve this goal, we developed four studies. First we investigated the mechanisms of force development (i) during stretch, and (ii) during shortening separately. We then investigated the link between the changes in force during length changes with the changes observed after length changes (iii). These three studies were performed with skinned muscle fibres from the rabbit psoas muscle. Finally, we investigated in details a potential mechanism for the residual force enhancement observed after stretch using a new preparation that we developed in our laboratory – isolated half-sarcomeres (iv). Our results suggest that (i) the force increase during stretch is largely caused by crossbridges in a pre-powerstroke state, (ii) the force decrease during shortening is related to the engagement of pre-powerstrokes only at the initial, rapid phase of force change, (iii) force enhancement after stretch is caused by an increase in the number of crossbridges attached to actin, half-sarcomere non-uniformities, and titin stiffening upon Ca2+ activation, and (iv) force depression after shortening is caused by myosin crossbridge deactivation. / Les muscles sont les moteurs du mouvement humain. La théorie la plus communément reconnue de la contraction musculaire, "théorie des pontages croisés", mis en avant par AF Huxley en 1957, est depuis largement utilisée comme model d'explication afin de démontrer comment un muscle se contracte. Toutefois, certains phénomènes ne sont pas encore entièrement compris dans la structure de cette théorie, notamment les effets d'étirement et de raccourcissement du muscle sur la production de la force. D'ailleurs, il existe toujours une controverse dans la littérature sur les mécanismes responsables de l'augmentation de la force observée pendant et après l'étirement, et la diminution de la force observée pendant et après le raccourcissement. L'objectif des travaux présentés dans cette thèse est d'étudier les mécanismes responsables des changements au niveau de la force pendant et après une modification de la longueur du muscle afin de tester les hypothèses suivantes: (i) le développement de la force au cours de l'étirement est causé par les pontages croisés en pré-course de puissance, (ii) le développement de la force au cours du raccourcissement est affecté par la polarisation des pontages croisés en pré-course de puissance, (iii) l'augmentation de la force après étirement est due à une augmentation du nombre de pontages croisés attachés, (iv) l'augmentation de la force après étirement est causée par les non-uniformités du demi-sarcomère, (v) l'augmentation de la force après étirement est causée par le raidissement des protéines non contractiles induites par le Ca2+, et (vi) la diminution de la force après raccourcissement est provoquée par une diminution du nombre de pontages croisés attachés. Dans le but d'atteindre cet objectif, nous avons élaboré quatre études. D'abord, nous avons étudié séparément les mécanismes de développement de la force (i) au cours de l'étirement, et (ii) au cours du raccourcissement. Ensuite, nous avons étudié le lien entre les changements de la force observés pendant et après une modification de la longueur du muscle. (iii). Ces trois études ont été réalisées à l'aide de fibres musculaires provenant du psoas du lapin. Enfin, nous avons étudié en détail un mécanisme potentiel pour l'augmentation de la force résiduelle observée après étirement en utilisant une nouvelle préparation développée en laboratoire - demi-sarcomères isolés (iv). Nos résultats nous amènent à penser que (i) l'augmentation de la force durant l'étirement est en grande partie causée par les pontages croisés dans un état de pré-course de puissance, (ii) la diminution de la force au cours du raccourcissement du muscle est lié à l'engagement de la pré-course de puissance, seulement au moment de la phase initiale rapide du changement de la force, (iii) l'augmentation de la force après étirement est provoquée par une augmentation du nombre de ponts fixés à l'actine, des non-uniformités du demi-sarcomère et du durcissement de la titine sur l'activation du Ca2+, et (iv) la diminution de force après raccourcissement est causée par la désactivation du pontage croisé de myosine.

The objective of this thesis is the development and use of a novel fluorescence fluctuation technique for determining the oligomeric state of fluorescently labeled proteins in situ via microscopy imaging. High order moment analysis of fluorescence intensity fluctuations from individual confocal laser scanning microscopy (CLSM) images applied to study monomer-oligomer distributions of fluorescently labeled proteins was developed. Using computer simulations and experiments with fluorescent microspheres and organic fluorescent dyes, the detection limits and accuracy of this statistical approach were determined. A series of control experiments were carried out to support the membrane receptor oligomerization studies in this thesis. The methods were then applied to study oligomerization states in various biological systems. Epidermal growth factor receptors (EGFR) play a critical role in cell growth, proliferation and survival. The activation steps of signal transduction pathways are known to involve EGFR oligomerization. Pharmacodynamic studies of ligand-induced clustering of EGF receptors were carried out. Spatial intensity distribution analysis (SpIDA), which accurately measures monomer-dimer distributions, was used to measure the increase in EGFR dimeric population upon addition of EGF ligand. The distribution of aggregates forming in the course of EGFR internalization was evaluated using two-population moment analysis. The findings supported an existing model proposing two distinct receptor internalization pathways. The electrogenic sodium bicarbonate cotransporter NBCe1-A plays an important role in absorbing sodium bicarbonate across the basolateral membrane of the proximal tubule. The fluorescence moment image analysis and SpIDA were applied to study the oligomeric state of NBCe1-A in cultured mammalian cells expressing various mutants of cotransporter. Spatial fluctuation analysis revealed that NBCe1-A existed on the cell membrane predominantly as a monomer and negligibly as higher order oligomers. To measure the oligomerization state of the native cotransporter, samples of rat kidney tissues were prepared and the native NBCe1-A was immunostained using fluorescently labeled primary antibody against the wild type cotransporter. The image analysis showed that NBCe1-A was present on the proximal tubule basolateral membrane in predominantly dimeric and rarely monomeric or higher order oligomeric states. Human immunodeficiency virus (HIV) diverts the cellular ESCRT machinery to promote the release of newly formed virions from host cells. The ATPase, VPS4A, acts at a late stage of ESCRT function. It provides energy for dissociation of ESCRT complexes and membrane abscision. The fluorescence moment analysis of VPS4A-eGFP images revealed the monomeric distribution of the protein in the plasma membrane outside budding sites and formation of two to five VPS4A dodecamers at the budding sites. The combination of the results of VPS4A dynamics studies together with the VPS4A burst size analysis shed light on steps in the HIV lifecycle and release. / L'objectif de cette thèse réside dans le développement et l'utilisation d'une nouvelle technique de mesure de fluctuation de fluorescence. Cette technique d'imagerie par microscopie permet de déterminer in situ l'état d'oligomérisation de protéines couplées à un fluorophore. L'analyse par mesure de moments d'ordres supérieurs d'intensité de fluctuation de fluorescence d'images obtenues à partir d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM) a été développée afin de mesurer la distribution en monomères/oligomères de protéines marquées par fluorescence. En utilisant des simulations par ordinateur ainsi que des expériences avec des microsphères fluorescentes, les limites de détection et l'exactitude de cette approche statistique ont pu être déterminées. Une série d'expériences contrôles a été effectuée afin de valider l'étude d'état d'oligomérisation de récepteurs membranaires présentée dans cette thèse. Cette méthode a ensuite été appliquée à l'étude de l'état d'oligomérisation dans divers systèmes biologiques. Le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) joue un rôle critique dans la croissance, la prolifération et la survie cellulaire. Les étapes d'activation des voies de transduction du signal sont connues pour impliquer l'oligomérisation de l'EGFR. Des études de pharmaco-dynamique d'agglomération provoquée par liaison d'un ligand ont été conduites. La technique d'analyse de distribution spatiale d'intensité (SpIDA), qui permet de mesurer précisément la distribution de monomères/dimères a été utilisée pour mesurer l'augmentation de la population de dimères d'EGFR après liaison du ligand (EGF). La distribution des agrégats se formant au cours de l'internalisation d'EGFR a été mesurée par analyse de moments pour deux populations. Les résultats confirment une hypothèse proposant deux voies distinctes d'internalisation du récepteur. Le co-transporteur électrogénique au bicarbonate de sodium NBCe1-A joue un rôle important dans l'absorption du bicarbonate de sodium à travers la membrane baso-latérale du tubule proximal rénal. Les analyses par moments de fluorescence et SpIDA ont été appliquées pour étudier l'état d'oligomérisation de NBCe1-A dans des cellules mammifères en cultures exprimant plusieurs mutants du co-transporteur. L'analyse de fluctuation spatiale montre que NBCe1-A est présent majoritairement sous forme de monomère sur la membrane cellulaire et de façon négligeable sous forme d'oligomères d'ordres supérieurs. Afin de mesurer l'état d'oligomérisation du co-transporteur naturel, des échantillons de reins de rats ont été préparés et NBCe1-A a été marqué par immunoréaction avec des anticorps fluorescents reconnaissant le type naturel du co-transporteur. L'analyse d'image indique que NBCe1-A est présent sous forme de dimère et rarement sous forme de monomère ou d'oligomères d'ordre supérieurs sur la membrane baso-latérale des tubules proximaux. Le virus humain d'immunodéficience (VIH) détourne la machinerie cellulaire ESCRT pour promouvoir la sortie de la cellule hôte de virions nouvellement formés. L'ATPase VPS4A est impliquée à une étape avancée de la fonction ESCRT en produisant de l'énergie pour la dissociation du complexe ESCRT et l'invagination de la membrane plasmique. L'analyse du moment de fluorescence d'images de VPS4A-eGFP montre une distribution monomérique à l'extérieur des sites de bourgeonnement ainsi que la présence de deux à quatre dodécamères sur les sites de bourgeonnement. La combinaison des résultats des études de la dynamique de VPS4A ainsi que l'analyse de la taille des pics d'intensité lumineux permet de mieux comprendre le cycle de vie du VIH ainsi que son processus de relargage.

Rationale: Calcium (Ca2+) activation of the thin filament cannot solely explain force regulation in cardiac muscles, including the rates of force development, force responses to mechanical perturbations, and relaxation. Cooperative activation between myosin cross-bridges induced by the strong-binding between myosin•actin•ADP has been suggested to also contribute to thin filament activation and force development. Little is known about ADP-induced activation in striated muscles. Hypotheses: ADP-induced activation and cooperativity between myosin cross-bridges contributes to cardiac force regulation with Ca2+. Methods: MgADP-induced activation in myofibrils isolated from cardiac muscles were investigated for their force development, force redevelopment following shortening-stretch protocols, and relaxation, and compared to Ca2+-activated myofibrils. Results: MgADP-activated myofibrils showed a lower rate of force development and redevelopment than Ca2+-activated myofibrils. Furthermore, MgADP activation decreased the rates of relaxation of myofibrils after full force development.Conclusions: MgADP-induced activation and cooperativity of cross-bridges partially regulate cardiac muscle contraction, including the rates of force development, rates of force changes in response to length perturbations and the rates of relaxation. Thus, the complex myosin•actin•ADP is important in regulating force production, and may be influential in controlling cardiac muscle performance. / Rationale: L'activation du filament fin par le calcium (Ca2+) ne peut pas en soit expliquer la régulation de la force du myocarde, incluant les fréquences de génération de force, les réponses de force aux perturbations mécaniques et la relaxation. Il a aussi été suggéré que l'activation coopérative des liens transversaux de myosine induits par les liaisons à haute affinité entre myosine•actine•ADP contribue à l'activation et à la génération de force par le filament fin. L'effet activateur de l'ADP dans les muscles striés n'est pas bien défini. Hypothèse: L'activation du filament fin par l'ADP et la coopération entre les liens transversaux de myosine contribuent à la régulation du myocarde par le Ca2+.Méthodes: Nous avons étudié la force développée et la force re-développée suite à des protocoles de rétrécissement-étirement et de relaxation induits par le MgADP, et comparé ces réponses à celles induites par le Ca2+, dans des myofibrilles isolés de muscles cardiaques. Résultats: Une fréquence plus basse de la force développée et re-développée a été observée dans les myofibrilles activées par le MgADP comparées aux myofibrilles activées par le Ca2+. De plus, l'activation par l'ADP a diminué les fréquences de relaxation des myofibrilles suite à la génération de force maximale. Conclusions:L'activation induite par le MgADP et la coopération des liens transversaux regularise partiellement la contraction du myocarde, incluant les fréquences de development de force, les fréquences de changement de force en réponse à des perturbations de longueur et les fréquences de relaxation. La complexe myosine•actine•ADP est donc important dans la régulation de la génération de force, et pourrait ainsi influencer la performance du myocarde.

Several cell types are found in organisms. Each type displays specific characteristics such as morphology, proliferation rate, genetic expression, mechanical properties, etc. Many investigations have been performed to study the effect of chemical cues on these cell properties. This is in contrast to the present work, which investigates the effect of mechanical properties of the global or local surroundings. Here, we have studied the effect of the matrix stiffness on the mechanical properties of airway smooth muscle cells using Atomic Force Microscopy (AFM). Our results show that the elastic modulus (G') of these cells increases to 820 ± 360 Pa when cultured on stiff gels when compared to the elastic modulus of 340 ± 160 Pa for cells cultured on soft polyacrylamide gels. We notice no significant difference in elastic modulus for cells plated on a glass substrate when compared to the stiffer gels. There is no evident effect of substrate stiffness on the loss modulus. The variability of the measured elastic modulus is attributed to cellular variability. This variability is smaller for cells cultured on the soft gel. When the cell cultures were labeled with Red-phalloidin, we observed an increase in the organization of the actin fibers at the cell cortex for stiffer substrates. We thus hypothesize that the increase in cellular stiffness is the consequence of the actin organization beneath the cell membrane.Proliferation rate was significantly diminished when the cells were cultured on the softer polyacrylamide gels. Matrix stiffness also had an effect on genetic expression as demonstrated by gene arrays. We observed a significant difference of genetic expression when cells were cultured on a glass substrate. All these results indicate that smooth muscle cells respond structurally and genetrically to the mechanical properties of the environment.Neurons are mechanically much more fragile and responsive than smooth muscle cells. We locally changed the mechano-chemical environment of axons and observed that this was sufficient to induce major structural changes such as synapse formation and even the extraction of proteins containing membrane strings. We developed a new approach to induce and study the creation of presynaptic site formation in axons through a combination of local modification to the mechano-chemical environment using a combination of AFM and fluorescence microscopy. First, we use a poly-D-lysine coated bead attached to an AFM tip to induce a synapse. We used transfection techniques and fluorescence microscopy to study the recruitment of two synaptic proteins, bassoon and synaptophysin, and measure their absolute arrival times to the presynaptic site. We find that bassoon arrives after 23 ± 10 minutes and that synaptophysin arrives after 43 ± 9 minutes. Finally, we observed the formation of long (several 10s of μm) membrane strings as the AFM tip was withdrawn from the axon. These membrane strings seemed functionally intact. It is conceivable that these strings might be a mechanism by which new neurites and branch points along existing neurites can be generated in situ. / Plusieurs types de cellules se retrouvent dans les organismes. Chaque type présente des caractéristiques spécifiques telles que la morphologie, le taux de prolifération, l'expression génétique, les propriétés mécaniques, etc. De nombreuses enquêtes ont été réalisées afin d'étudier l'effet des signaux chimiques dans la cellule. Ceci contraste avec les travaux actuels qui étudie l'effet des propriétés mécaniques sur l'environnement global et local. Ici, nous avons étudié l'influence de la rigidité du substrat sur les propriétés mécaniques et l'expression génétique des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Nos résultats démontrent que le module d'élasticité (G') des cellules augmente à 820 ± 360 Pa lorsqu'elles sont cultivées sur les gels rigides par rapport à 340 ± 160 Pa aux cellules cultivées sur les gels polyacrylamides doux. Nous n'avons pas remarqué de différence significative dans le module d'élasticité pour les cellules étalées sur un substrat de verre en comparaison aux gels rigides. L'effet de rigidité sur le module de perte n'est donc pas observé. La variabilité du module d'élasticité mesuré est attribuée à la variabilité cellulaire. Cette variabilité cellulaire est moins effective pour les cellules cultivées sur les gels doux. Lorsque les cultures de cellules ont été marquées avec Red-phalloïdine, nous observons une augmentation dans l'organisation des fibres d'actine au niveau du cortex cellulaire. Ainsi, nous émettons l'hypothèse que l'augmentation de la rigidité cellulaire est une conséquence de l'organisation d'actine sous la membrane cellulaire.Le taux de prolifération a significativement diminué lorsque les cellules ont été cultivées dans les gels de polyacrylamide plus doux. La rigidité du substrat a également une influence sur l'expression génétique comme démontrée dans les réseaux de gènes. D'un autre côté, une variation significative sur l'expression génétique a été observée dans les cellules cultivées sur du verre. Tous ces résultats suggèrent que les cellules musculaires lisses répondent aux propriétés fournis par l'environment. Les neurones sont mécaniquement beaucoup plus fragiles et sensibles que les cellules musculaires lisses. Nous avons localement changé l'environment mécanochimique des axones et avons observé que cela suffisait pour induire des changements structurels significatifs tels que la formation des synapses et même l'extraction de protéines contenant des chaînes membranaires. Nous avons développé une nouvelle approche pour inciter et étudier la formation des sites présynaptiques dans les axones par une combinaison de modifications locales de l'environnement mécano-chimique en utilisant une combinaison de l'AFM et de la microscopie à fluorescence. Tout d'abord, nous utilisons une bille enrobée de poly-D-lysine pour attacher sur une pointe d'AFM dans le but d'induire une synapse. Nous avons utilisé des techniques de transfection et la microscopie à fluorescence pour étudier le recrutement de deux protéines synaptiques, basson et synaptophysine, et de mesurer leur temps d'arrivée absolue aux sites présynaptiques. Nous constatons que le basson arrive après 23 ± 10 minutes et que la synaptophysine arrive après 43 ± 9 minutes. Finalement, nous avons observé la formation de longues chaînes membranaires contenant des protéines de l'ordre de 10µm quand la pointe d'AFM a été retirée de l'axone. Ces chaînes membranaires semblent être fonctionnellement intactes. Il est concevable que ces chaînes pourraient être un mécanisme rénovateur par lequel les nouvelles neurites et les nouveaux points de branchement au long des neurites existants peuvent être générés in situ.

Kainate receptors are members of the ionotropic glutamate receptor family and are widely expressed throughout the mammalian central nervous system where they act as regulators of network activity. Given this, there is considerable interest in KAR gating, both to improve our understanding but also to aid in drug design. And the most striking and unique aspect of KAR gating is their strong sensitivity to and absolute requirement for external ions.Altering either the species or concentration of external cations such as Na+ or external anions such as Cl- can dramatically affect the extent and duration of KAR activation. These parallel effects are not seen with closely related AMPA receptors. But how can ions of opposite charge exert the same effect on KARs? Using rapid agonist application techniques in conjunction with point mutations and existing crystal structures, we found that anions and cations regulate KARs through a dipole mechanism. Specifically, both anions and cations bind adjacent to one another at the crucial interface between KAR ligand binding domains (LBDs). This important position, called the dimer interface, and close apposition accounts for their common effects. Given the role of this dimer interface in KAR agonist efficacy, and that external ions bind to this interface, we examined whether anions and cations regulate the relative efficacy of KAR agonists. We found that cations, but surprisingly not anions, control the relative strength of KAR agonists through this dimer interface site. We also observed a general inverse relationship between peak and equilibrium activation across all agonists and ionic conditions. Full agonists produce large peak responses with relatively small equilibrium activation but as agonist efficacy decreases the relative size of the equilibrium response increases. This ubiquitous behaviour, found in both AMPAR and KARs, is best reproduced by simulations which explicitly model conformational changes occurring after agonist binding but before channel opening. More generally, such pre-gating transitions may be a crucial determinant of agonist efficacy at KARs, and perhaps all other ligand-gated ion channels. In the course of these experiments, we uncovered an unexpected ability of the smallest cation, Li+, to potentiate KAR peak and equilibrium activation as well as to slow decay kinetics. Surprisingly, this effect was only seen with agonists containing a pyrrolidine ring structure, KA and Dom, demonstrating agonist-dependent conformations of the intact receptor. Moreover, Li+ potentiation of these agonists occurs from a novel binding site distinct from the known cation binding site. My results lead to four general conclusions. First, cations and anions regulate KAR through a dipole mechanism. Second, despite their dipole arrangement, cations but not anions govern KAR relative agonist efficacy. Third, agonist efficacy at KARs maybe determined by pre-gating transitions. And finally, KARs posses a Li+-selective allosteric site which potentiates activation in an agonist-dependent manner. These conclusions advance our understanding of KAR gating but also suggest some new ideas about partial agonism which may apply to other ligand-gated ion channels. / Les récepteurs kaïnate (KARs) sont des récepteurs ionotropes glutamatergiques qui sont exprimés à travers le système nerveux central, où ils agissent en tant que régulateurs de réseaux neuronaux. Par conséquent, il est considérablement pertinent d'étudier leur fonctionnement afin d'approfondir nos connaissances ainsi que pour aider à la conception de médicaments. Les aspects les plus frappants et particuliers de ces récepteurs sont leur forte sensibilité ainsi que leur dépendance inconditionnelle à la présence d'ions externes.Changer l'identité ou la concentration des cations externes, tel le Na+, ou des anions externes, tel le Cl-, peut avoir un effet important sur l'ampleur et la durée de l'activation des KARs. Ces effets interdépendants ne sont pas observés chez les récepteurs AMPA (AMPARs). Comment des ions de charge opposée peuvent-ils avoir le même effet sur les KARs? À l'aide d'applications ultra-rapides d'agonistes sur des KARs recombinants, de mutagénèse et des structures cristallines existantes, nous avons trouvé que les anions et les cations régulent les KARs par un méchanisme de dipôle. Spécifiquement, les anions et les cations se lient de façon adjacente à l'interface entre les domaines d'interaction du ligand des KARs. Cette importante région, nommée interface des dimères, ainsi que l'apposition étroite des ions, expliquent leurs effets communs.Étant donné le rôle de cette interface dans l'efficacité des KARs, et que les ions externes se lient à cette interface, nous avons décidé d'examiner si les anions et les cations régulent le potentiel relatif des agonistes des KARs. Nous avons découvert que les cations, mais étonnamment pas les anions, pouvaient contrôler ce potentiel à travers l'interface des dimères. Nous avons également observé une relation inverse entre l'activation maximale et à l'équilibre pour tous les agonistes et conditions ioniques. Les agonistes complets produisent une activation maximale considérable et une activation à l'équilibre relativement petite, mais lorsque l'efficacité de l'agoniste diminue, l'activation à l'équilibre devient relativement plus grande. Ce comportement omniprésent, observé chez les AMPARs et les KARs, peut être reproduit de façon optimale par des simulations modelant des changements de conformation qui se produisent après la liaison d'un agoniste mais avant l'ouverture du canal ionique. En général, de telles étapes transitoires pourraient être cruciales pour l'efficacité d'un agoniste agissant sur les KARs et peut-être même sur d'autres canaux ioniques ligand-dépendants.À travers ces expériences, nous avons découvert la capacité inattendue du plus petit cation, le Li+, de potentialiser l'activation maximale et à l'équilibre des KARs, ainsi que de ralentir leur désensibilisation. Étonnamment, cet effet fut seulement observé avec les agonistes contenant un anneau pyrrolidine, c'est-à-dire le kaïnate et le domoate, démontrant ainsi des conformations agoniste-dépendantes du récepteur intact. De plus, l'effet potentiateur du Li+ pour ces agonistes se produirait à travers un nouveau site de liaison non-identifié qui serait distinct du site de liaison des cations déjà connu.Mes résultats nous mènent vers quatre conclusions. Premièrement, les cations et les anions régulent les KARs à travers un méchanisme de liaison en dipôle. Deuxièmement, malgré leur disposition en dipôle, seuls les cations gouvernent l'efficacité relative des agonistes des KARs. Troisièmement, l'efficacité de ces agonistes pourrait être déterminée par une étape transitoire de pré-activation. Enfin, les KARs possèdent un site de liaison sélectif au Li+ qui potentialise leur activation de façon allostérique et agoniste-dépendante. Ces conclusions approfondissent notre compréhension de la régulation des KARs par les ions externes, et proposent aussi de nouvelles idées concernant l'agonisme partiel qui pourraient s'appliquer à d'autres canaux ioniques ligand-dépendants.

The present work consists of three parts. First, I demonstrate the effectiveness of C12E5/hexanol as an orienting media for the measurement of residual dipolar couplings (RDCs) at low pH and for proteins with the positively charged surfaces, such as carbon storage regulator A at pH 4.5 and catalytic fragment of 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP-CF; theoretical pI 8.99). Second, the structure of the regeneration-induced CNPase homolog was determined based on 15N-1 H, 13C'-13C alpha, and 13Calpha- 1Halpha RDCs measured in Pf1 phage alignment media. Finally, 2D experiments based on the recently introduced SAD-REDOR technique for the measurement of RDCs in proteins were developed. The SAD-REDOR (single-alignment domain rotational-echo double resonance) technique consists of magic angle spinning (MAS) and rotor synchronized radiofrequency pulses applied to the molecule fixed in the polymer-stabilized liquid crystalline media. MAS averages dipolar couplings to zero, while the application of the RF pulses allows selective recovery of chemical shift anisotropy, homonuclear or heteronuclear RDCs. SAD-REDOR can be used to study strongly aligned biomolecules. It allows measurement of both scalar and dipolar couplings in a single sample and control over their magnitudes. Here, I present SAD-IPAP and SAD-HSQC experiments for the measurements of 15N-1 H RDCs in direct and indirect dimensions, respectively, as it is demonstrated for 15N-enriched PSLC ubiquitin.

Mechanical loading is crucial in modulating the physiology and architecture of bone. Previous experiments indicated intercellular communication among osteoblasts upon mechanical stimulation, suggesting the involvement of a soluble signal mediator. Extracellular adenosine triphosphate (ATP) functions as signaling molecules in many cell regulation processes, therefore appears to be a prone candidate. ATP acts on osteoblasts through multiple P2 receptors. To provide insights on the roles of individual receptors, we modeled ATP concentration dependence for different P2 receptors. Next, the process of ATP degradation and the diffusion of ATP, adenosine diphosphate (ADP) and adenosine monophosphate (AMP) are modeled. To confirm the predictions of the model, we initiated experiments to measure ATP release from mechanically stimulated osteoblasts. Firefly luciferase assay successfully measures ATP using a luminometer and a charge coupled device (CCD) camera. Local indentation with a AFM cantilever is applied to mechanically stimulate an osteoblast. Preliminary results on real time imaging of ATP release from osteoblasts are reported. / Le chargement mécanique est crucial dans la modulation de la physiologie et de l'architecture de l'os. Des expériences antérieures ont indiqué la communication intercellulaire entre les ostéoblastes lors de la stimulation mécanique. Ces résultats suggèrent l'implication d'un médiateur soluble. L'adénosine triphosphate (ATP) extracellulaire fonctionne comme des molécules de signalisation dans de nombreux processus de régulation cellulaire. Celle-ci semble être un candidat à risque. L'ATP agit sur les ostéoblastes via les récepteurs P2. Ici, la concentration d'ATP pour chacun de ces récepteurs P2 a été modélisée mathématiquement pour mieux comprendre leur rôle. Le processus de dégradation de l'ATP et la diffusion de l'ATP, adénosine diphosphate (ADP) et adénosine monophosphate (AMP) ont aussi été modélisés. Avec le luminomètre, nous étions capables de mesurer avec succès l'ATP par dosage de la luciférase de luciole. Des images de haute résolution de la détection d'ATP ont été obtenues avec un dispositif à transfert de charge (CCD). Enfin, l'indentification locale avec une pointe de microscopie à force atomique (MFA) est appliquée mécaniquement pour stimuler un ostéoblaste. Les résultats préliminaires sur l'imagerie en temps réel de la libération d'ATP à partir d'ostéoblastes sont présentés.

Biology in the past two decades has shifted away from qualitative observation towards quantitative data, and away from reductionism towards viewing the phenomena under study as systems. Developments in fluorescent reporters, experimental instrumentation, and computational power have been integral to this change. A key feature of this transformation has been a substantial increase in the use of mathematical models to explore and verify our understanding of complicated biological mechanisms. This thesis looks at three different aspects of the systems modelling approach: data acquisition, model creation and evaluation, and measurement of parameter values. The system under study for the first two parts is the GAL pathway of the yeast Saccharomyces cerevisiae, a well-known model for genetic regulation. Despite this pathway being relative simple and well studied, various questions remain about the details of its regulatory mechanism. In the first part, I describe methodology for acquiring dynamic protein expression data. I use the green fluorescent protein (GFP) as a reporter and make measurements from cell populations growing in a microplate reader. Of particular interest is a technique I introduce for removing the autofluorescence that contaminates the GFP fluorescence signal. My technique makes it possible to detect expression even from very weakly expressed proteins. In the second part, I have developed a basic, deterministic model of the GAL pathway, which I then fit to dynamic protein expression data. I use the model to demonstrate that based on available data, the current understanding of the GAL pathway does capture a wide range of GAL system behaviours. I also identify and explore the GAL network's sensitivity to the relative levels of inducer and repressor proteins and discuss future directions for experiments and model development. In the third part, I present theoretical work that addresses the challenge of measuring protein-protein interactions in vivo from Förster resonance energy transfer (FRET) fluorescence data. I designed a computational tool that uses a Bayesian statistical framework to infer the dissociation constant and FRET efficiency from FRET data. One key advantage of this approach is that it produces probability distributions for these parameters of interest, revealing the uncertainty in the estimates obtained. I also demonstrate the experimental conditions, such as variations in levels of FRET donors and acceptors, that are necessary for the inference of the dissociation constant and FRET efficiency to be possible. / Au cours des deux dernières décennies, la biologie est passée d'une science réductionniste fondée sur l'observation qualitative à une science quantitative traitant les phénomènes biologiques comme des systèmes. Le développement de gènes rapporteurs fluorescents, d'instruments expérimentaux sophistiqués et de la puissance de calcul des ordinateurs ont été des éléments garants de cette transformation. Plus particulièrement, un élément clé de cette transformation a été l'utilisation croissante de modèles mathématiques pour explorer et vérifier notre compréhension de mécanismes biologiques complexes. Cette thèse traite de trois aspects de la modélisation des systèmes: l'acquisition de données, la création et l'évaluation d'un modèle et la mesure des valeurs de ses paramètres.Le système étudié dans les deux premières parties de cette thèse est la voie métabolique du galactose (GAL) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette voie est un exemple bien connu de régulation génétique. Bien qu'elle soit relativement simple et déjà bien étudiée, plusieurs questions subsistent quant aux détails reliés à son mécanisme de régulation. Dans la première partie, je décris la méthodologie pour l'acquisition de données dynamiques d'expression de protéines. J'utilise la protéine fluorescente verte (GFP) comme rapporteur et effectue des mesures sur des populations de cellules croissant dans un lecteur de microplaques. Notamment, je présente une technique permettant d'éliminer l'autofluorescence qui contamine le signal de fluorescence de la GFP. Cette technique permet même la détection de l'expression de protéines très faiblement exprimées. Dans la deuxième partie, je développe un modèle déterministe de base de la voie GAL, que je raccorde par la suite à des données dynamiques d'expression de protéines. J'utilise ce modèle pour démontrer qu'en se basant sur les données disponibles la compréhension théorique actuelle de la voie GAL capture une grande partie des comportements réels du système. Je discute aussi de possibilités pour l'élaboration subséquente du modèle. Dans la troisième partie, je présente un travail théorique qui traite de la difficulté de mesurer in vivo les interactions entre protéines à partir de données fluorescentes résultant du transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET). Je conçois un outil de calcul qui utilise les statistiques bayésiennes pour déduire la constante de dissociation et l'efficacité du FRET de données FRET. Un avantage clé de cette approche est qu'elle produit des distributions de probabilité pour ces paramètres d'intérêt, révélant l'incertitude des estimations obtenues. Je démontre aussi les conditions expérimentales, telles que les variations dans les concentrations de donneurs et d'accepteurs du FRET, requises pour permettre l'inférence de la constante de dissociation et de l'efficacité du FRET.