Els monoacilglicerols (MAGs) enantiomèrics són intermedis de gran interès i la seva producció mitjançant enzims ofereix vies alternatives a les reaccions químiques tradicionals. Aquesta tesi té com a objectiu la seva síntesi a partir de dos precursors dels MAGs (el rac-palmitat de solketil i el rac-palmitat de glicidil), utilitzant micelis de fongs aïllats de residus de la indústria de l’oli com a biocatalitzadors. En un primer intent d’obtenir MAGs, es va avaluar l’activitat epòxid-hidrolàsica dels micelis enfront el rac-fenil glicidil èter, el rac-benzil glicidil èter, el rac-1,2-epoxihexà i el rac-1,2-epoxioctà. A continuació, els micelis escollits es van utilitzar en la hidròlisi del rac-palmitat de glicidil. Només es va obtenir MAG amb el miceli de Penicillium sp., però com a mescla racèmica. L’efecte matriu associat a les reaccions amb micelis com ara la recuperació de l’anàlit adsorbit en la biomassa o l’extracció de components dels biocatalitzadors es van compensar realitzant l’extracció després de fortificar les mostres i patrons. En un segon intent, el palmitat de glicidil enantioenriquit i sintetitzat pel miceli de Mucor fragilis, es va hidrolitzar amb el miceli de Penicillium sp. La hidròlisi enzimàtica del MAG enantiomèric va dificultar la seva obtenció. / Los monoacilgliceroles (MAGs) són intermedios de gran interés y su producción mediante enzimas ofrece vías alternativas a las reacciones químicas tradicionales. Esta tesis tiene como objetivo su síntesis a partir de dos precursores de los MAGs (el rac-palmitato de solketilo y el rac-palmitato de glicidilo), utilizando micelios de hongos aislados de sustratos de la industria del aceite como biocatalizadores. En un primer intento de obtener MAGs, se evaluó la actividad epóxido-hidrolásica de los micelios frente al rac-fenil glicidil éter, el rac-bencil glicidil éter, el rac-1,2-epoxihexano y el rac-1,2-epoxioctano. A continuación, los micelios seleccionados se utilizaron en la hidrólisis del rac-palmitato de glicidilo. Sólo se obtuvo MAG con el micelio de Penicillium sp., pero como mezcla racémica. El efecto matriz asociado a las reacciones con micelios como por ejemplo la recuperación del analito adsorbido en la biomasa o la extracción de componentes de los biocatlizadores se compensó realizando la extracción después de fortificar las muestras y patrones. En un segundo intento, el palmitato de glicidilo enantioenriquecido y sintetizado por el micelio de Mucor fragilis, se hidrolizó con el micelio de Penicillium sp. La hidrólisis enzimática del MAG enantiomérico dificultó su obtención. / Enantiomeric monoacylglycerols (MAGs) are known to be useful intermediates of great interest. They are difficult to synthesize by traditional chemical reactions and enzymatic production provide alternative routes. This thesis reports their synthesis from two precursors of MAGs (rac-solketil palmitate and rac-glycidyl palmitate) by using fungic mycelia isolated from olive oil wastes as biocatalysts. In a first attempt to obtain MAGs, mycelia were screened towards rac-glycidyl phenyl ether, rac-benzyl glycidyl ether, rac-1,2-epoxyhexane and rac-1,2-epoxyoctane. Then, rac-glycidyl palmitate was hydrolysed by the mycelia selected by their epoxide hydrolase activity. Only Penicillium sp. mycelium yielded MAG, but as a racemic mixture. Matrix effects associated with mycelium-catalysed reactions such the need to recover the analyte adsorbed onto the biomass or the extraction of matrix components were compensated for using pre-extraction spiking approach. In a second attempt, enantioenriched glycidyl palmitate, synthesised by Mucor fragilis mycelium, was hydrolysed by Penicillium sp. mycelium. There was difficult to obtain enantiomeric MAG because of its enzymatic hydrolysis.

L’atàxia de Friedreich és una malaltia rara neurodegenerativa causada pel dèficit d’una proteïna mitocondrial anomenada frataxina. La miocardiopatia és freqüent en els pacients i sol ser la principal causa de mort. Actualment no existeix cap model cel•lular cardíac per estudiar la patofisiologia en aquestes cèl•lules. És per això que hem desenvolupat un model utilitzant miòcits ventriculars de rates neonatals i RNA d’interferència. Utilitzant aquest model hem observat que el dèficit de frataxina en aquestes cèl•lules causa una alteració de la xarxa mitocondrial i estrès oxidatiu. A més, els miòcits cardíacs pateixen un canvi en el perfil metabòlic i acumulen una gran quantitat d’àcids grassos en gotes lipídiques. Aquest model ens permetrà en un futur estudiar els mecanismes de la malaltia cardíaca a l’atàxia de Friedreich, descobrir nous biomarcadors i provar possibles tractaments. / La ataxia de Friedreich es una enfermedad rara neurodegenerativa causada por el déficit de una proteína mitocondrial denominada frataxina. La miocardiopatía es frecuente en los pacientes y suele ser la principal causa de muerte. Actualmente no existe ningún modelo celular cardíaco para estudiar la patofisiología en estas células. Es por ello que hemos desarrollado un modelo utilizando miocitos ventriculares de ratas neonatales y RNA de interferencia. Utilizando este modelo hemos observado que el déficit de frataxina en estas células causa una alteración de la red mitocondrial y estrés oxidativo. Además, los miocitos cardíacos sufren un cambio en el perfil metabólico y acumulan una gran cantidad de ácidos grasos en gotas lipídicas. Este modelo nos permitirá en un futuro estudiar los mecanismos de la enfermedad cardíaca en la ataxia de Friedreich, descubrir nuevos biomarcadores y probar posibles tratamientos. / Friedreich's ataxia is a neurodegenerative rare disease caused by a deficiency of the mitochondrial protein frataxin. Cardiomyopathy is frequent in patients and is usually the main cause of death. Currently there is no cardiac cell model to study the pathophysiology in these cells. Under these circumstances we have developed a model using neonatal rat ventricular myocytes and RNA interference. Frataxin deficiency in these cells causes an alteration of the mitochondrial network and oxidative stress. Furthermore, cardiac myocytes undergo a change in the metabolic profile and accumulate large amounts of fatty acids in lipid droplets. This model will favor the study of the mechanisms of cardiac disease in Friedreich ataxia, discover new biomarkers and test potential treatments.

En aquest estudi hem trobat que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona amb el receptor de Slit, Robo1, de forma independent lligand. En cèl•lules HEK293T hem vist que FLRT3 i Robo1 interaccionen mitjançant els seus dominis intracel•lulars, que la co-expressió de FLRT3 amb Robo1 indueix el processament del receptor i que FLRT3 interacciona amb el fragment intracel•lular generat amb major afinitat i el segresta a la membrana. En presència de Slit, es produeix un increment en el processament de Robo1 i el fragment intracel•lular generat és captat per FLRT3. La interacció entre FLRT3-Robo1 i entre FLRT3-Robo1ICD es dóna en neurones talàmiques rostrals a E13.5. Slit indueix el processament de Robo1 per metaloproteases en aquestes neurones i FLRT3 captura el fragment generat. La interacció FLRT3-Robo1 i l'activació de ROCK són necessàries per la correcta guia axonal dels axons talamocorticals rostrals. FLRT3 regula directament i de forma negativa la senyalització repulsiva Slit/Robo i indirectament promou la senyalització atractiva Netrin/DCC / En este estudio hemos encontrado que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona con el receptor de Slit, Robo1, de forma independiente de ligando. En células HEK293T hemos visto que FLRT3 y Robo1 interaccionan mediante sus dominios intracelulares, que la co-expresión de FLRT3 con Robo1 induce el procesamiento del receptor y que FLRT3 interacciona con el fragmento intracelular generado con mayor afinidad y lo secuestra en la membrana. En presencia de Slit, se produce un incremento en el procesamiento de Robo1 y el fragmento intracelular generado es captado por FLRT3. La interacción entre FLRT3-Robo1 y entre FLRT3-Robo1ICD tiene lugar en neuronas talámicas rostrales a E13.5. Slit induce el procesamiento de Robo1 por metaloproteasas en estas neuronas y FLRT3 captura el fragmento generado. La interacción FLRT3-Robo1 i la activación de ROCK son necesarias para la correcta guía axonal de los axones talamocorticales rostrales. FLRT3 regula directamente y de forma negativa la señalización repulsiva Slit/Robo y indirectamente promueve la señalización atractiva Netrin/DCC. / In this study we have found that FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacts with the Slit receptor Robo1 ligand- independently. In HEK293T cells we have found that FLRT3 and Robo1 interact throught their intracellular domains, that the co-expression of FLRT3 with Robo1 triggers the shedding of the receptor and that FLRT3 interacts with the intracellular fragment generated with higher affinity and keeps it in the plasma membrane. The presence of Slit produces an increase in the shedding of Robo1 and the intracellular fragment that is generated is catched by FLRT3. The interaction between FLRT3-Robo1 and between FLRT3-Robo1ICD takes place in rostral thalamic neurons at E13.5. Slit triggers Robo1 shedding by metalloproteases in these neurons and FLRT3 catches the intracellular fragment generated. The interaction FLRT3-Robo1 and the activation of ROCK are necessary for the proper guidance of the rostral talamocortical axons. FLRT3 regulates directly and negatively the Slit/Robo repulsive signaling and indirectly promotes the Netrin/DCC attractive signaling

El cicle cellular és el conjunt d'esdeveniments ordenats que permeten a la cèllula donar lloc a dues cèllules filles genèticament idèntiques. Diversos senyals externs i interns regulen aquest procés per a que la cèllula proliferi només en les condicions apropiades. Un punt de control important pel que fa a la coordinació de la proliferació amb el creixement cellular es troba en la fase G1 (punt de restricció), on la cèllula comprova que ha adquirit la massa i la maquinària necessària per la replicació del DNA. Les ciclines D són molècules que juguen un paper clau en la regulació de la fase G1. Les cèllules de mamífer contenen gens que codifiquen per 3 ciclines de tipus D altament homòlogues (D1, D2, D3), que s'expressen de manera específica de teixit i s'associen a Cdk4 o Cdk6 per formar una proteïna quinasa activa. D'aquestes tres ciclines la ciclina D1 és la més estudiada ja que es troba freqüentment superexpressada en molts càncers humans. L'expressió de ciclina D1 i la seva unió a Cdk4 representa un dels esdeveniments més importants, regulats per senyals mitogènics, necessaris per la progressió del cicle cellular a través del punt de restricció. Les cèllules inhibeixen l'entrada en cicle en la fase G1 principalment per dos mecanismes diferents: la disminució de l'expressió de ciclines D i l'augment de les proteïnes KIP que inhibeixen l'activitat residual del complex Cdk4/6ciclina D. Tot i discrepàncies d'origen metodològic, diferents estudis han observat l'acumulació de la ciclina D1 en el citoplasma de cèllules quiescents o diferenciades, suggerint l'existència d'altres mecanismes que podrien regular l'activitat dels complexes Cdk4ciclina D1 a nivell de la seva distribució nucleocitoplasmàtica. D'altra banda, en el nostre laboratori s'havia desvetllat un mecanisme de retenció citoplasmàtica de Cln3, l'homòleg funcional de ciclina D1 en llevat de gemmació, que regula l'entrada en cicle i juga un paper molt important en la coordinació entre creixement i proliferació. Aquests antecedents ens van conduir a plantejar com a hipòtesi de treball d'aquesta tesi doctoral l'existència d'un mecanisme de control de la localització de la ciclina D1 entre el nucli i el citoplasma, que podria tenir un paper especialment rellevant en situacions d'aturada de la proliferació cellular. En aquest treball hem demostrat que la ciclina D1 es localitza en el citoplasma de fibroblasts embrionaris de ratolí quiescents, i que això succeeix per un mecanisme independent de l'export mediat per Crm1. De la cerca d'interactors de ciclina D1 per dihíbrid i copurificació hem identificat la transloquina, una proteïna que havia estat descrita com a important en el procés d'import nuclear de FGF2. En observar durant el nostre treball que FGF2 és un potent estimulador de l'acumulació nuclear de ciclina D1, varem decidir analitzar en detall les seves implicacions funcionals. La superexpressió de transloquina inhibeix l'acumulació nuclear de ciclina D1 en cèllules proliferant. En canvi, la inhibició de l'expressió de transloquina causa l'efecte oposat, és a dir, indueix l'acumulació nuclear de ciclina D1 i la fosforilació de RB per Cdk4 en cèllules sotmeses a condicions de quiescència. En resum, en aquest treball de tesi doctoral hem desvetllat i descrit un mecanisme de retenció citoplasmàtica de la ciclina D1 en fibroblasts embrionaris de ratolí, on la transloquina hi juga un paper important per a mantenir l'estat de quiescència cellular. La transloquina i Cdk4 s'uneixen i competeixen pel mateix domini de ciclina D1 i, donat que cal la formació prèvia del complex Cdk4ciclina D1 per al seu import nuclear, aquest fet permet establir una base molecular senzilla pel propi mecanisme de retenció citoplasmàtica. / El ciclo celular es el conjunto de sucesos ordenados que permiten a la célula originar dos células hijas genéticamente idénticas. Distintas señales internas y externas regulan este proceso para que las células proliferen sólo en las condiciones más apropiadas. Uno de los puntos de control importantes, donde se coordina la proliferación con el crecimiento celular se encuentra en la fase G1 (punto de restricción). En este punto la célula comprueba que ha adquirido la masa y la maquinaria necesaria para la replicación del DNA. Las ciclinas D son moléculas que tienen un papel clave en la regulación de la fase G1. Las células de mamífero contienen genes que codifican para tres ciclina tipo D altamente homólogas (D1, D2, D3), que se expresan de forma específica de tejido y se asocian a Cdk4 o Cdk6 para formar una proteína quinasa activa. Entre las tres ciclinas, la ciclina D1 es la más estudiada, ya que se encuentra sobrexpresada en muchos cánceres humanos. La expresión de ciclina D1 y su unión con Cdk4 representa uno de los acontecimientos más importantes, regulados por señales mitogénicas, necesarios para la progresión del ciclo celular a través del punto de restricción. Las células inhiben la entrada en ciclo en la fase G1 principalmente por dos mecanismos distintos: la disminución de la expresión de ciclinas D y el aumento de las proteínas KIP que inhiben la actividad residual del complejo Cdk4/6ciclina D. A pesar de alguna inconsistencia de origen metodológico, distintos estudios han observado la acumulación de la ciclina D1 en el citoplasma de células quiescentes o diferenciadas, sugiriendo la existencia de otros mecanismos que podrían regular la actividad de los complejos Cdk4ciclina D1 a nivel de su localización núcleocitoplasmática. Por otro lado, en nuestro laboratorio se había descrito un mecanismo de retención citoplasmática de Cln3, el homólogo funcional de ciclina D1 en levadura de gemación, que regula la entrada en ciclo y juega un papel muy importante en la coordinación entre crecimiento y proliferación. Estos antecedentes nos llevaron a plantear, como hipótesis de trabajo de esta tesis doctoral, la existencia de un mecanismo de control de localización de ciclina D1 entre el núcleo y el citoplasma, que podría tener un papel relevante en situaciones de detención de la proliferación celular. En este trabajo hemos demostrado que la ciclina D1 se localiza en el citoplasma de fibroblastos embrionarios de ratón quiescentes, y que además sucede por un mecanismo independiente del exporte por Crm1. De la búsqueda de interactores de ciclina D1 por dihíbrido y copurificación hemos identificado la transloquina, una proteína cuya implicación ya se había descrito en el proceso de importe nuclear de FGF2. Además, durante nuestro trabajo observamos que FGF2 es un potente estimulador de la acumulación nuclear de ciclina D1. La sobreexpresión de transloquina inhibe la acumulación nuclear de ciclina D1 en células proliferando. En cambio, la inhibición de la expresión de transloquina causa un efecto opuesto, induce la acumulación nuclear de ciclina D1 y la fosforilación de RB por Cdk4 en células sometidas a condiciones de quiescencia. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral hemos identificado un mecanismo de retención citoplasmática de la ciclina D1 en fibroblastos embrionarios de ratón, donde la transloquina juega un papel importante para mantener el estado de quiescencia celular. La transloquina y Cdk4 se unen y compiten por el mismo dominio de ciclina D1, y puesto que la formación del complejo Cdk4ciclina D1 es un requisito previo para el importe nuclear, este hecho permite establecer una base molecular sencilla para el propio mecanismo de retención citoplasmática. / The cell cycle is the series of events by which the cell duplicates its contents and divides into two daughter cells identical genetically. This process is regulated by different external and internal signals allowing the cell to proliferate under suitable conditions. Higher eukaryotes control proliferation and growth in late G1 at the restriction point, where they ensure that enough appropriate nutrients and extracellular mitogens are present to enter a new cell cycle and initiate DNA replication. Dtype cyclins are a key target in the regulation of G1 phase. Mammalian cells contain genes encoding three highly homologous Dtype cyclins (D1, D2, D3) that associate in a tissue specific manner with either Cdk4 or Cdk6 to form an active protein kinase. Among them, cyclin D1 is the most studied because its overexpression is frequently present in human tumors. Mitogendriven upregulation of cyclin D1 levels and assembly into active complexes with Cdk4/6 are key events for exit from quiescence and G1 progression in mammalian cells. Quiescent cells are thought to inhibit cell cycle entry mainly by two different mechanisms: downregulation of Dtype cyclin expression and upregulation of KIP proteins to inhibit residual Cdk4/6cyclin D activity. However, cytoplasmic accumulation of cyclin D1 in quiescent or differentiated cells has been observed in different instances, suggesting the existence of other mechanisms to control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. On the other hand, we have previously characterized a cytoplasmic retention device that sequesters Cln3, the functional homologue of Dtype cyclins in budding yeast, to regulate G1 progression and cell size homeostasis. Thus, as the initial hypothesis of this doctoral thesis, we asked whether mammalian cells control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. In this doctoral thesis we show that cyclin D1 is localized in the cytoplasm in quiescent mouse fibroblasts by a mechanism that does not involve the Crm1 exportin. We have screened for cyclin D1 interactors by twohybrid and coimmunopurification strategies and we have identified translokin, a protein that interacts with FGF2 and facilitates its nuclear import. We have also observed that FGF2 treatment of quiescent cells causes nuclear accumulation of cyclin D1. Overexpression of translokin prevents proper cyclin D1 accumulation in the nucleus of proliferating cells. On the other hand, downregulation of translokin levels results in nuclear accumulation of cyclin D1 and causes Cdk4dependent phosphorylation of RB in quiescent cells. In summary, in the present doctoral thesis we show that cyclin D1 is also subject to an analogous but different cytoplasmic retention mechanism in quiescent mouse fibroblasts. We have identified translokin as an interactor of cyclin D1 that plays an essential role to inhibit its accumulation in the nucleus under quiescence conditions. As translokin interacts with cyclin D1 domains also needed for Cdk4 binding and subsequent nuclear import, we propose that translokin is an essential component of a cytoplasmic retention mechanism of cyclin D1 that prevents cell cycle entry during cellular quiescence.