Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Advances in biotechnology have provided possibilities to the performance of large-scale of biomolecules and therefore of their industrial applications. Escherichia coli stands out among microorganisms that act as host genes, functioning as a synthetic protein. The most useful vectors for the production of recombinant proteins in E. coli are based on the operon lac, where isopropyl β-D1-thiogalactopyroside (IPTG), analogous to lactose, is used to induce the production of proteins of interest. Studies in the literature have also observed the good performance of lactose as an inducer of recombinant E. coli in the expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and its advantages when compared to IPTG, such as lower cost and toxicity. EGFP becomes promising because it is monomeric and does not need to help the main agents for fluorescence activity. It has several uses in the biological field as an excellent biomarker of gene expression and biosensor. In bioprocesses, operated in conventional bioreactors, it is fundamental to study the interfering parameters in the cultures to optimize the expression of the desired product. Oxygenation in aerobically conducted processes is also a challenging task in conventional bioreactors, with control of the concentration of dissolved oxygen in the culture medium is essential, which may be limiting for growth and expression of the protein of interest. In processes of production of heterologous proteins, it is assumed that the productiv... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5647.pdf: 2822412 bytes, checksum: 769ca8edf54438ee75a0a4df886371c3 (MD5) Previous issue date: 2013-09-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Penicillin G acilase (PGA) is a key enzyme in the industrial production of β-lactamic antibiotics. In this work, it was studied the production of PGA from Escherichia coli by recombinant E. coli and from Bacillus megaterium by recombinant B. megaterium. In E. coli, the enzyme accumulates in the periplasmic cell space, B. megaterium secretes PGA, what may reduce downstream costs. With E.coli, the study has begun at the expression step. Using a donated recombinant microorganism, it was studied, in shake flasks cultures, the influence of temperature (ranging from 18 to 28°C) during induction phase in the PGA production. High level expression of PGA E. coli was detected at 20°C, which was 4-fold superior than the volumetric enzymatic activity reached at 28°C. Fed-batch cultures were conducted with glycerol as carbon source, using both defined and complex media as well as IPTG and lactose as inducers. Final biomass concentrations of 100 gDCW/L and 120 gDCW/L and enzymatic activity 210000 and 80000 IU/L were achieved, for complex and defined media, respectively. The study with B. megaterium was initiated isolating the pac gene, encoding for PGA from B. megaterium ATCC14945, which was after cloned into the pLipAhp expression plasmid, together with the promoter gene and a gene codifying antibiotic resistance. This construct (pga-pLipAhp) was used to transform three different B. megaterium strain protoplasts, aiming studies to determine the best expression host in terms of PGA production. The tested strains, B. megaterium PV361, QM B1551 and ATCC 14945, have respectively shown about 95%, 95% and 10% plasmidial stability, after eight consecutive growths. The best PGA production was detected in PV361. Study of thermal and pH stability with the purified enzyme showed that PGA has a half-life of 5 min at 60° C, 20 min at 50° C, keeping 100% of activity for 1h at pH 10.0 and up to 8 h at pH 5.0. The values of temperature and pH for maximum PGA activity are 37° C and 8.0, respectively. The enzyme was stable at least for 5 hours in these conditions, with Michaelis-Menten estimated as Km=8.8 μM. A systematic study was developed to search the best condition to obtain the highest level of B.megaterium PGA production by recombinant B.megaterium. Media compositions for biomass and PGA production were evaluated using a genetic algorithm. The screening was carried out in 96 microtiter deep well plates, starting as a minimal medium and studying the concentration of 12 defined components. In 7 generations, 240 different kinds of media were tested for production and secretion and a 10-fold increase in PGA production and 5-fold increase in biomass compared to the previously used minimal medium could be achieved. It was scaled-up to shaker flasks obtaining 3-fold in PGA production and 1.8-fold in biomass. Later, it was scaled-up to bioreactors obtaining 3-fold in biomass and 8-fold in PGA production. Using glycerol as carbon source, it was tested different complex amino acids sources, using flask cultures. The best medium was scale-up in a 5 L bioreactor, in a batch culture with pulses. The highest production of PGA of recombinant B. megaterium achieved was 105600 IU/L and 36 gDCW/L. / Penicilina G Acilase (PGA) é enzima chave na produção industrial de antibióticos β- lactâmicos. Neste trabalho, foram estudadas as produções de PGA de Escherichia coli produzida por E.coli recombinante e de Bacillus megaterium produzida por B. megaterium recombinante. No primeiro, esta é acumulada no espaço periplasmático, o segundo secreta a enzima, o que pode reduzir grandemente custos de recuperação da enzima, pois não requer rompimento celular. Para E.coli, o estudo foi iniciado na etapa de expressão. Utilizando E.coli recombinante doada, foi realizado um estudo em frascos agitados da influência da temperatura (entre 18 e 28°C), durante a fase de indução, na expressão de PGA, que mostrou haver altos níveis de expressão de enzima a 20°C, com atividade volumétrica 4 vezes superior à obtida a 28°C. Foram realizados então cultivos a 20°C, em biorreator, em batelada alimentada, com glicerol como fonte de carbono, usando meio definido ou complexo, com IPTG ou lactose como indutores. Foram atingidas concentrações de biomassa finais de 100 gms/L e 120 gms/L, e atividades enzimáticas de 210000 e 80000 UI/L para meios complexo e definido, respectivamente. Para B. megaterium, o gene pac, que codifica PGA de B. megaterium ATCC14945 foi isolado e clonado no plasmídeo pLipAhp, juntamente com um gene promotor e outro codificando resistência a antibiótico (para seleção da linhagem clonada). Essa construção (pga-pLipAhp) foi usada para transformar três linhagens de protoplastos de B. megaterium, com o objetivo de determinar o melhor hospedeiro para a expressão de PGA recombinante. Foram testadas as linhagens: B. megaterium PV 361, QM B1551 e ATCC 14945, obtendo-se 95%, 95% e 10%, respectivamente, de estabilidade plasmidial, após 8 cultivos consecutivos. A melhor produção de PGA foi detectada em PV 361. Estudo de estabilidade térmica e de pH com a enzima purificada mostrou que PGA possui um tempo de meia vida de 5 min a 60°C, 20 min a 50°C, mantém 100% de atividade por 1 h, a pH 10 e por 8 horas, a pH 5. A temperatura e pH de atividade máxima é 37°C e 8,0, respectivamente, com Km=8.8 μM, com manutenção de 100% de atividade, no mínimo por 5 horas, nessas condições. Um estudo sistemático foi desenvolvido para obter um alto rendimento na produção de PGA de B. megaterium por B.megaterium recombinante. Busca da melhor composição de meio para biomassa e produção de PGA foi feita usando o algoritmo genético. A busca foi desenvolvida em placas de 96 poços, iniciando com um meio mínimo, com 12 componentes definidos. Em 7 gerações, 240 tipos de meio foram testados para a produção e secreção, conseguindo-se um incremento de 10 vezes na produção de PGA e de 5 vezes na produção de biomassa, comparando-se com o meio mínimo controle. Escalonamento para frascos agitados permitiu aumento de 3 vezes na produção de PGA e de 1.8 vezes na produção de biomassa. Escolhendo-se glicerol como fonte de carbono, foram testadas diferentes fontes complexas de aminoácidos. O meio que conduziu ao melhor resultado foi usado em cultivos em biorreator em batelada, 5L, onde se obteve como máxima produção de PGA recombinante de B. megaterium 105600 UI/L, com 36 gms/L de massa celular.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAC.pdf: 1100634 bytes, checksum: a59508afe52240474931f49ecbfe180d (MD5) Previous issue date: 2007-03-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / In biochemical processes, shear rate ( γ&) in the system is an important variable on design and operation of bioreactors. Shear can result in damage to the cells and the microorganisms, taking to the viability loss and even to the cellular breaking and the microbial death. In the present work was proposed a methodology to quantify average shear rate ( av γ & ) in stirred bioreactor with a 4 L working volume, through volumetric oxygen transfer coefficient (kLa), varying the operating conditions, as the impeller rotational speed (N: 600, 700, 800, 900 and 1000 rpm) and the specific air flow rate (Φar: 0.50 and 1.00 vvm). Five different glycerol solutions and distilled water were utilized as Newtonian fluids and six different xantham gum solutions were utilized as non-Newtonian fluids. Dynamic viscosity (µ) of the glycerol solutions and rheological parameters (K, n) for the xantham gum solutions, were determined at 28ºC from rheograms using a digital concentric-cylinders rheometer. Based on the obtained results, a correlation for average shear rate ( av γ & ) as function of the impeller rotational speed (N), rheological parameters (K, n) and volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) was proposed. The correlation obtained for the average shear rate ( av γ & ) showed appropriate to estimate av γ & , because the estimated values approximated of others values described in literature for another correlations. In a second stage, four cultivations of Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 was realized in a stirred bioreactor, aerated 0.50 vvm and agitated in 700, 800, 900 and 1000 rpm. Process variable values, as consistency index (K), flow index (n), cellular concentration (Cx), glicerol concentration (CGlic) and 2 CO n& produced ag of the cultivations were evaluated. It was observed that the consistency index (K), flow index (n) and cellular concentration (Cx) varied due to shear conditions imposed to the cultivations. Finally, based on experimental literature results, average shear rate ( av γ & ) was determined in function of the time for cultivation of S. clavuligerus in stirred bioreactor for 600, 800 and 1000 rpm and specific air flow rate (Φar) of 0.50 vvm, using the proposed methodology, the obtained values were more consistent, because the experimental values of kLa were obtained by gaseous balance. / Em processos bioquímicos, a velocidade de cisalhamento ( γ &) no meio reacional é uma importante variável no projeto e operação de biorreatores. O cisalhamento pode resultar em dano às células e aos microrganismos, levando à perda de viabilidade e até mesmo ao rompimento celular e à morte microbiana. No presente trabalho propôs-se uma metodologia para quantificar a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado com 4 litros de volume útil, através do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa), variando-se as condições de operação, no caso freqüência de rotação do impelidor (N: 600, 700, 800, 900 e 1000 rpm) e vazão específica de alimentação de ar (Φar: 0,50 e 1,00 vvm). Utilizaramse cinco diferentes soluções de glicerol e água destilada como fluidos Newtonianos, e seis diferentes soluções de goma xantana como fluidos não-Newtonianos. As viscosidades dinâmicas (µ) para as soluções de glicerol e as constantes reológicas (K e n) para as soluções de goma xantana foram obtidas a 28ºC em reômetro de cilindros concêntricos a partir de reogramas. Com base nos resultados obtidos, propôs-se uma correlação para a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em função da freqüência de rotação do impelidor (N), das propriedades reológicas dos fluidos (K e n) e do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). A correlação obtida para a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) mostrou-se adequada para estimativas de γ &m, pois os valores estimados aproximaram-se de outros estimados por diferentes correlações propostas na literatura. Numa segunda etapa, realizaram-se quatro cultivos com Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 em biorreator convencional tipo tanque agitado e aerado a 0,50 vvm e agitado em 700, 800, 900 e 1000 rpm. Valores de variáveis do processo como o índice de consistência (K), índice de comportamento de escoamento (n), concentração celular (Cx), concentração de glicerol (CGlic) e quantidade de dióxido de carbono produzido ( 2 CO n& ) foram obtidos ao longo dos cultivos. Observou-se que o índice de consistência (K), índice de comportamento de escoamento (n) e a concentração celular (Cx) sofreram variações decorrentes das condições de cisalhamento impostas aos cultivos. Por fim, com base em resultados experimentais de literatura, determinou-se a velocidade de cisalhamento média ( γ &m) em função do tempo para cultivos de S. clavuligerus em biorreator convencional, a 600, 800 e 1000 rpm e vazão específica de alimentação de ar de 0,50 vvm, empregando-se a metodologia proposta, os resultados obtidos foram mais consistentes, pois se utilizou valores experimentais de kLa obtidos pelo balanço gasoso.

Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Streptomyces clavuligerus é uma bactéria filamentosa, capaz de produzir ácido clavulânico (AC), um importante fármaco β-lactâmico. Sendo necessário o controle de parâmetros como pH, temperatura, homogeneização do caldo, adequada transferência de oxigênio e cisalhamento para melhora de processos biotecnológicos. Sabe-se que a partir da transferência de oxigênio e da velocidade média de cisalhamento imposta ao sistema nesses biorreatores, por meio do uso de maiores ou menores rotações dos impelidores, a produção de ácido clavulânico é afetada, pois essas variáveis influenciam no crescimento do microrganismo, na reologia e morfologia do microrganismo presente no caldo fermentativo e na formação e estabilidade da molécula de AC. No presente trabalho, foram realizados experimentos para determinação volumétrica de oxigênio com diferentes conformações para encontrar o melhor posicionamento dos impelidores. Com a melhor conformação, estudou- se a transferência de oxigênio com diferentes vazões e rotações de ar. Os resultados desses experimentos mostram que um sistema pode apresentar melhores ou piores resultados de transferência de oxigênio para o processo, dependendo da sua geometria. A variação na distância entre os impelidores aumentou em até 83% a transferência de oxigênio do biorreator. Foram realizados cultivos de Streptomyces clavuligerus em biorreator convencional com diferentes vazões, rotações e composição de gás para comparar os diversos efeitos sofridos na morfologia dos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Streptomyces clavuligerus is a filamentous bacterium, producing of clavulanic acid (CA), an important β-lactam drug. It is necessary to control parameters such as pH, temperature, broth homogenization, adequate oxygen transfer and shear to improve biotechnological processes. Knows that from the transfer of oxygen and the average shear velocity imposed to the system in these bioreactors, through the use of greater or smaller rotations of the impellers, affect the production of clavulanic acid, since these variables influence the growth of the microorganism, in the rheology and morphology of the microorganism present in the fermentative broth and in the formation and stability of the CA molecule. In the present work, experiments were carried out for the volumetric determination of oxygen with different conformations to find the best positioning of the impellers. With the best conformation, the transfer of oxygen with different flow rates and air rotations was studied. The results of these experiments show that a system can present better or worse oxygen transfer results to the process depending on its geometry. The variation in distance between the impellers increased by up to 83% the transfer of oxygen from the bioreactor. Streptomyces clavuligerus cultures were grown in conventional bioreactor with different flow rates, rotations and gas composition to compare the different effects of microorganism’s morphology, substrate consumption, optical density and rheology and clavulan... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre