Tesis por compendio / [ES] La tesis doctoral se centra en el desarrollo de un hidrogel sensible a analitos, funcionalizado con sondas de ADN, con estructura difractiva como transductor óptico para aplicaciones de diagnóstico in vitro. El primer capítulo incluye una visión general de los diferentes conceptos relacionados con el biosensado, los desarrollos recientes en el mercado del diagnóstico in vitro y, en particular, los biosensores de ADN. Además, se presenta la síntesis y caracterización de hidrogeles, su papel como matriz de soporte en biosensado y las estrategias de inmovilización. Por último, se explican los conceptos básicos de la holografía como nueva estrategia de detección y el papel de las diferentes redes de difracción en la biosensación. A continuación, en el Capítulo 2, se discuten los objetivos de este proyecto. El objetivo de esta investigación es desarrollar hidrogeles que incorporen sondas de ADN y dotarlas de una estructura difractiva para que actúen como transductores ópticos sin etiquetas. Se consideran dos tipos de estructuras difractivas: redes holográficas de relieve superficial (SRG) y redes de transmisión de volumen (VTG). La fase inicial de este trabajo se centró en la optimización de hidrogeles, ajustando su composición para que actuaran como biosensores holográficos. Se seleccionaron acrilamida y bisacrilamida para la preparación del hidrogel mediante reacción de polimerización por radicales libres. Además, para introducir la respuesta del analito en la red de hidrogeles 3D, hubo que investigar y poner a punto diferentes estrategias de inmovilización de biorreceptores. En el capítulo 3, la estrategia optimizada consiste en incorporar directamente sondas de ADN modificadas con acridita mediante copolimerización con monómeros de acrilamida durante la formación del hidrogel. Los hidrogeles funcionalizados con ADN se caracterizaron mediante imágenes de fluorescencia y se exploró su versatilidad mediante la fabricación de microarrays. Por último, el hidrogel optimizado sensible a los analitos se utilizó como plataforma para la preparación de SRG. El capítulo 4 describe otro enfoque adoptado para la funcionalización del hidrogel con sondas de ADN. Se añadió un comonómero de acrilato de propargilo al hidrogel de acrilamida, con el fin de introducir la presencia de residuos alcínicos y facilitar una mayor incorporación de las sondas de ADN. Las sondas de ADN utilizadas tenían grupos terminales tiol y se incorporaron mediante química de clic tiol-eno/tiol-yo, debido a la presencia de enlaces C-C dobles y triples. Con esta estrategia, se demostraron dos enfoques de inmovilización de sondas de ADN: durante y después de la síntesis del hidrogel. Los resultados preliminares mostraron que los SRGs tienen potencial para detectar directamente la hibridación de oligonucleótidos en un formato libre de etiquetas. En el capítulo 5, se optimizó el proceso de grabación de VTGs no inclinados en capas de hidrogel para mejorar el rendimiento del transductor. Tras una cuidadosa evaluación de los parámetros de grabación holográfica, las composiciones de las soluciones de incubación y los tiempos de incubación, las estructuras VTG se grabaron con una buena reproducibilidad, logrando una excelente eficiencia de difracción. Además, se estudió su estabilidad en agua para bioensayos. Por último, se observó que los VTG, modificados con oligonucleótidos, respondían selectivamente hibridándose sólo con la diana complementaria, a la vez que conservaban sus propiedades de difracción. El trabajo de investigación demostró la viabilidad de utilizar redes difractivas en capas de hidrogel como biosensores libres de etiquetas, capaces de detectar sondas de ADN, complementarias a la secuencia inmovilizada, en un medio acuoso. Por último, en el capítulo 6, se analizan comparativamente el rendimiento y la aplicabilidad de los distintos enfoques estudiados y se discuten las perspectivas futuras de los hidrogeles de ácidos nucleicos para la detección holográfica. / [CA] La tesi doctoral se centra en el desenvolupament d'un hidrogel sensible a anàlits, funcionalitzat amb sondes d'ADN, amb estructura difractiva com a transductor òptic per a aplicacions de diagnòstic in vitro. El primer capítol inclou una visió general dels diferents conceptes relacionats amb el biosensado, els desenvolupaments recents en el mercat del diagnòstic in vitro i, en particular, els biosensores d'ADN. A més, es presenta la síntesi i caracterització d'hidrogels, el seu paper com a matriu de suport en biosensado i les estratègies d'immobilització. Finalment, s'expliquen els conceptes bàsics de l'holografia com a nova estratègia de detecció i el paper de les diferents xarxes de difracció en la biosensación. A continuació, en el Capítol 2, es discuteixen els objectius d'este projecte. L'objectiu d'esta investigació és desenvolupar hidrogels que incorporen sondes d'ADN i dotar-les d'una estructura difractiva perquè actuen com a transductors òptics sense etiquetes. Es consideren dos tipus d'estructures difractivas: xarxes hologràfiques de relleu superficial (SRG) i xarxes de transmissió de volum (VTG). La fase inicial d'este treball es va centrar en l'optimització d'hidrogels, ajustant la seua composició perquè actuaren com biosensores hologràfics. Es van seleccionar acrilamida I bisacrilamida per a la preparació de l'hidrogel mitjançant reacció de polimerització per radicals lliures. A més, per a introduir la resposta de l'anàlit en la xarxa d'hidrogels 3D, va caldre investigar i posar a punt diferents estratègies d'immobilització de biorreceptores. En el capítol 3, l'estratègia optimitzada consisteix a incorporar directament sondes d'ADN modificades amb acridita mitjançant copolimerización amb monòmers d'acrilamida durant la formació de l'hidrogel. Els hidrogels funcionalitzats amb ADN es van caracteritzar mitjançant imatges de fluorescència i es va explorar la seua versatilitat mitjançant la fabricació de bioxips. Finalment, l'hidrogel optimitzat sensible als anàlits es va utilitzar com a plataforma per a la preparació de SRG. El capítol 4 descriu un altre enfocament adoptat per a la funcionalització de l'hidrogel amb sondes d'ADN. Es va afegir un comonómero de acrilato de propargilo a l'hidrogel d'acrilamida, amb la finalitat d'introduir la presència de residus alcínicos i facilitar una major incorporació de les sondes d'ADN. Les sondes d'ADN utilitzades tenien grups terminals tiol i es van incorporar mitjançant química de clic tiol-eno/tiol-ino, a causa de la presència d'enllaços C-C dobles i triples. Amb esta estratègia, es van demostrar dos enfocaments d'immobilització de sondes d'ADN: durant i després de la síntesi de l'hidrogel. Els resultats preliminars van mostrar que els SRGs tenen potencial per a detectar directament la hibridació de oligonucleótidos en un format lliure d'etiquetes. En el capítol 5, es va optimitzar el procés de gravació de VTGs no inclinats en capes d'hidrogel per a millorar el rendiment del transductor. Després d'una acurada avaluació dels paràmetres de gravació hologràfica, les composicions de les solucions d'incubació i els temps d'incubació, les estructures VTG es van gravar amb una bona reproducibilidad, aconseguint una excel·lent eficiència de difracció. A més, es va estudiar la seua estabilitat en aigua per a bioensayos. Finalment, es va observar que els VTG, modificats amb oligonucleótidos, responien selectivament hibridant-se només amb la diana complementària, alhora que conservaven les seues propietats de difracció. El treball de recerca va demostrar la viabilitat d'utilitzar xarxes difractivas en capes d'hidrogel com biosensores lliures d'etiquetes, capaces de detectar sondes d'ADN, complementàries a la seqüència immobilitzada, en un medi aquós. Finalment, en el capítol 6, s'analitzen comparativament el rendiment i l'aplicabilitat dels diferents enfocaments estudiats i es discuteixen les perspectives futures dels hidrogels d'àcids nucleics per a la detecció hologràfica. / [EN] The PhD thesis focuses on the development of an analyte-sensitive hydrogel, functionalised with DNA probes, with a diffractive structure as an optical transducer for in vitro diagnostic applications. The first chapter includes an overview of the different concepts related to biosensing, recent developments in the in vitro diagnostics market and, in particular, DNA biosensors. Furthermore, the synthesis and characterisation of hydrogels, their role as a support matrix in biosensing and immobilisation strategies are presented. Finally, the basic concepts of holography as a new detection strategy and the role of different diffraction gratings in biosensing are explained. Then, in Chapter 2, the objectives of this project are discussed. The aim of this research is to develop hydrogels that incorporate DNA probes and provide them with a diffractive structure to act as label-free optical transducers. Two types of diffractive structures are considered: surface-relief holographic gratings (SRGs) and volume transmission gratings (VTGs). The initial phase of this work focused on the optimisation of hydrogels, adjusting their composition to act as holographic biosensors. Acrylamide and bisacrylamide were selected for hydrogel preparation by free radical polymerisation reaction. Furthermore, in order to introduce the analyte response into the 3D hydrogel network, different bioreceptor immobilisation strategies had to be investigated and fine-tuned. In chapter 3, the optimised strategy is to directly incorporate acridite-modified DNA probes by copolymerisation with acrylamide monomers during hydrogel formation. The DNA-functionalised hydrogels were characterised by fluorescence imaging and their versatility was explored by microarray fabrication. Finally, the optimised analyte-responsive hydrogel was used as a platform for SRG preparation. Chapter 4 describes another approach adopted for functionalisation of the hydrogel with DNA probes. A propargyl acrylate comonomer was added to the acrylamide hydrogel in order to introduce the presence of alkyl residues and facilitate further incorporation of the DNA probes. The DNA probes used had thiol end-groups and were incorporated by thiol-ene/thiol-yo click chemistry, due to the presence of double and triple C-C bonds. With this strategy, two approaches to DNA probe immobilisation were demonstrated: during and after hydrogel synthesis. Preliminary results showed that SRGs have the potential to directly detect oligonucleotide hybridisation in a label-free format. In chapter 5, the recording process of unslanted VTGs in hydrogel layers was optimised to improve transducer performance. After careful evaluation of holographic recording parameters, incubation solution compositions and incubation times, the VTG structures were recorded with good reproducibility, achieving excellent diffraction efficiency. In addition, their stability in water for bioassays was studied. Finally, oligonucleotide-modified VTGs were found to respond selectively by hybridising only to the complementary target, while retaining their diffraction properties. The research work demonstrated the feasibility of using diffractive networks in hydrogel layers as label-free biosensors, capable of detecting DNA probes, complementary to the immobilised sequence, in an aqueous medium. Finally, in chapter 6, the performance and applicability of the different approaches studied are comparatively analysed and future prospects of nucleic acid hydrogels for holographic detection are discussed. / I would like to acknowledge the government of Valencia to for the PhD fellowship “Santiago Grisolia” and the BEFPI/2022 grant for a 4-months doctoral stay and also the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO (ADBIHOL national project) for their financial support. / Zezza, P. (2023). Holographic biosensors made of DNA-functionalised hydrogels for in vitro diagnostic [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202597 / Compendio