Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:50:03Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_ra_me_botfm.pdf: 896730 bytes, checksum: 97ac1a0ea8e45d9861c31c7feaac2ecb (MD5) / Fundação para o Desenvolvimento Médico e Hospitalar (Famesp) / A tecnologia de produção de anticorpos monoclonais revolucionou a investigação diagnóstica, especialmente a análise dos grupos sanguíneos em imuno-hematologia. O polimorfismo das hemácias humanas torna a produção de novos insumos extremamente necessária. Dentre os sistemas de grupos sanguíneos descritos, o sistema Rh tem se mostrado um dos mais complexos pela vasta composição de antígenos. Analisando aspectos estruturais do antígeno D associado às técnicas de biologia molecular, identificam-se numerosas variantes deste antígeno por trocas de DNA entre genes similares levando a alteração de epítopos e consequentemente de padrão de expressão fenotípica na superfície das hemácias. Desvendar e identificar estas variantes com insumos biotecnológicos desenvolvidos no país foi o desafio desta pesquisa, onde anticorpos monoclonais contra antígenos eritrocitários foram produzidos através de fusão celular, utilizando-se células de baço de camundongos BALB/c imunizados com hemácias fenótipo D categoria IVa. Nove fusões foram realizadas e os sobrenadantes de cultura foram triados por teste de hemaglutinação em microplacas. Foram congelados e mantidos em nitrogêncio líquido 41 híbridos. Estes híbridos foram clonados e mantidos em meio de cultura para a obtenção dos anticorpos monoclonais, resultando em 12 clones IgG1, 5 IgG2a e 10 IgM. Os clones foram selecionados para produção de líquido ascítico, através da injeção dos clones em camundongos BALB/c. Os anticorpos monoclonais produzidos, inicialmente não demonstraram a especificidade foco do presente trabalho que foi a produção de anticorpos anti-D, no entanto, os hibridomas podem ter secretado diferentes especificidades de anticorpos monoclonais, de acordo com os antígenos presentes na membrana das hemácias utilizadas para a imunização dos camundongos. Uma segunda fase da pesquisa está sendo... / The blood groups analyses in immunohematology have been highly benefited based on the advance of the monoclonal antibody technology improvement on diagnostics investigation. The human red blood cell polymorphism increases the need for new alternatives. The Rh system blood group is the most complex of all, due to the vast antigenic composition. When analyzing the structural aspects of the D antigen in combination with the molecular techniques, based upon DNA exchange between similar genes it is possible to identify a huge number of partial D variants, this situation leads to a change of epitopes and hence the red blood cell phenotypic expression pattern. Unveil and identify these variables through the use of local biotechnology was the challenge of this research. Monoclonal antibodies against human red blood cell were produced by cell fusion, using spleen cells from immunized BALB/c mice and DIVa red blood cells. Nine fusions had been made and the culture supernatants were selected to the hemaglutination test using microplates. Forty-one hybrids had been frozen and kept in liquid nitrogen. These hybrids had been cloned and kept in the culture to collect monoclonal antibodies, resulting in 12 IgG1, 5 IgG2a e 10 IgM. The clones had been selected for ascitic fluid production, by injection in BALB/c mice. The monoclonal antibodies produced initially had not produced the anti-D as expected by the research. However, the hibrydomas could have created different specificities of monoclonal antibodies, according to the antigen located in the donor red blood cells membrane used in the mice’s immunization. The second phase of the research is being done to confirm the monoclonal antibodies specificities produced through the deployment of new tests to immunoglobulin identification

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:08:59Z : No. of bitstreams: 1 sabino_js_me_botfm.pdf: 566217 bytes, checksum: 240c61c93ab7c7cbdc92982de0adea0d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo / O Sistema Rh é constituído por 48 antígenos eritrocitários, sendo o antígeno Rh D, considerado o mais imunogênico seguido dos antígenos c, E, C, e. A probabilidade de imunização por Rh D é muito mais alta quando comparada com outros antígenos de grupos sanguíneos humano que ocasionalmente produzem anticorpos irregulares, tornando esse sistema de grande importância clínica. O antígeno Rh D é composto por 37 epítopos, formando um mosaico. Qualquer mudança de aminoácidos em uma parte da proteína pode afetar a expressão da seqüência de epítopos ou resultar em novos epítopos. Por isso, os antígenos do grupo sanguíneo Rh D podem apresentar variações de sua expressão na membrana eritrocitária. As hemácias com fenótipo Rh D fraco diferem quantitativamente das células Rh D positivas normais, por serem definidas como tendo todos os epítopos Rh D presentes, porém com uma redução dos níveis de antígeno Rh D. As hemácias Rh D parcial diferem qualitativamente das células Rh D positivas normais, pois carecem de um ou mais epítopos que formam o antígeno Rh D. Em geral, os fenótipos Rh D parcial se expressam devido à presença de genes híbridos, os quais ocorrem predominantemente em indivíduos de origem africana. O número de amostras classificadas como Rh D fraco e Rh D parcial depende das características do reagente utilizado para a fenotipagem Rh D. Anteriormente os reagentes utilizados eram os policlonais, porém atualmente, com a descoberta do anticorpos monoclonais e a dificuldade de obtenção dos policlonais, tem-se utilizado apenas os reagentes monoclonais. Desde então, diferenças entre a reatividade de vários reagentes, especialmente na detecção de Rh D fraco e Rh D parcial, têm criado uma discussão sobre o teste adequado para doadores de sangue, pacientes e receptores. / The Rh System is constituted by 48 red cells antigens, where the Rh D antigen is considered the most immunogenic followed by c, E, C, e antigens. The probability of immunization by Rh D is higher when is compared with other human sanguineous groups antigens, that occasionally produce irregular antibodies, what makes this system very important clinically. The antigen Rh D is composed by 37 epitopes, which forms a mosaic. Any amino acid change in a protein part can affect the expression of the epitopes sequence or results in new epitopes. Therefore, the sanguineous group Rh D antigens can present variations in the red cells membrane expression. The red cells with weak D phenotype are quantitatively different from the Rh D normal positive cells, because of the presence of all epitopes in their definition, but with a reduction of Rh D antigen levels. The red cells D partial are qualitatively different from the Rh D normal positive cells, because they need one or more epitopes that form Rh D antigen. In general, the partial D phenotype occurs due to the presence of hybrid genes, which occur predominantly in African individuals. The number of classified samples as weak D and partial D depends on the reagent used for the Rh D phenotyping characteristics. Previously the used reagents were polyclonal, but currently, with the discovery of the monoclonal antibodies and the difficulty of attainment of the polyclonal, it has been used only monoclonal reagents. Since then, differences between the reactivity of many reagents, especially in the detention of weak D and partial D, have been created a discussion about the apropriated tests for blood donators, patients and receivers.

Orientador: Valéria Nogueira Dias Paes Secco / Banca: Ana Maria Bormio de Rosis / Banca: Wilson Baliotti Júnior / Resumo: O Sistema Rh é constituído por 48 antígenos eritrocitários, sendo o antígeno Rh D, considerado o mais imunogênico seguido dos antígenos c, E, C, e. A probabilidade de imunização por Rh D é muito mais alta quando comparada com outros antígenos de grupos sanguíneos humano que ocasionalmente produzem anticorpos irregulares, tornando esse sistema de grande importância clínica. O antígeno Rh D é composto por 37 epítopos, formando um mosaico. Qualquer mudança de aminoácidos em uma parte da proteína pode afetar a expressão da seqüência de epítopos ou resultar em novos epítopos. Por isso, os antígenos do grupo sanguíneo Rh D podem apresentar variações de sua expressão na membrana eritrocitária. As hemácias com fenótipo Rh D fraco diferem quantitativamente das células Rh D positivas normais, por serem definidas como tendo todos os epítopos Rh D presentes, porém com uma redução dos níveis de antígeno Rh D. As hemácias Rh D parcial diferem qualitativamente das células Rh D positivas normais, pois carecem de um ou mais epítopos que formam o antígeno Rh D. Em geral, os fenótipos Rh D parcial se expressam devido à presença de genes híbridos, os quais ocorrem predominantemente em indivíduos de origem africana. O número de amostras classificadas como Rh D fraco e Rh D parcial depende das características do reagente utilizado para a fenotipagem Rh D. Anteriormente os reagentes utilizados eram os policlonais, porém atualmente, com a descoberta do anticorpos monoclonais e a dificuldade de obtenção dos policlonais, tem-se utilizado apenas os reagentes monoclonais. Desde então, diferenças entre a reatividade de vários reagentes, especialmente na detecção de Rh D fraco e Rh D parcial, têm criado uma discussão sobre o teste adequado para doadores de sangue, pacientes e receptores. / Abstract: The Rh System is constituted by 48 red cells antigens, where the Rh D antigen is considered the most immunogenic followed by c, E, C, e antigens. The probability of immunization by Rh D is higher when is compared with other human sanguineous groups antigens, that occasionally produce irregular antibodies, what makes this system very important clinically. The antigen Rh D is composed by 37 epitopes, which forms a mosaic. Any amino acid change in a protein part can affect the expression of the epitopes sequence or results in new epitopes. Therefore, the sanguineous group Rh D antigens can present variations in the red cells membrane expression. The red cells with weak D phenotype are quantitatively different from the Rh D normal positive cells, because of the presence of all epitopes in their definition, but with a reduction of Rh D antigen levels. The red cells D partial are qualitatively different from the Rh D normal positive cells, because they need one or more epitopes that form Rh D antigen. In general, the partial D phenotype occurs due to the presence of hybrid genes, which occur predominantly in African individuals. The number of classified samples as weak D and partial D depends on the reagent used for the Rh D phenotyping characteristics. Previously the used reagents were polyclonal, but currently, with the discovery of the monoclonal antibodies and the difficulty of attainment of the polyclonal, it has been used only monoclonal reagents. Since then, differences between the reactivity of many reagents, especially in the detention of weak D and partial D, have been created a discussion about the apropriated tests for blood donators, patients and receivers. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-20Bitstream added on 2014-06-13T20:59:29Z : No. of bitstreams: 1 crocomo_lf_me_botfmvz.pdf: 25649116 bytes, checksum: 05169c2ff45ce468070cb0f57b50ab2f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo visou avaliar e comparar a eficiência e reversibilidade da inibição meiótica promovida pela roscovitina e ciclohexemida nos COCs de ovinos cultivados in vitro, assim como analisar o efeitos desses inibidores da meiose sobre a ultraestrutura dos COCs e expansão das células do cumulus. Para isto, COCs grau 1 e 2 recuperados de ovários de ovelhas, obtidos em frigoríficos, foram cultivados, por 24 horas a 38,5ºC e atmosfera com 5% de CO2, em meio de maturação constituído por TCM 199 suplementado com 0,1UI/mL de FSH; 0,1UI/mL de LH; 0,3mM de piruvato; 75µg/mL de penicilina/estreptomicina; 10% SFB e 100µM/mL de cisteamina (Grupo Controle) acrescido de 100μM de roscovitina ou 1μg/mL de ciclohexemida (Grupos Tratamentos). Para retomada e progressão da maturação nuclear, os COCs foram cultivados por mais 22 horas em meio de maturação livre de inibidores da meiose, nas mesmas condições acima descritas. Após 24 e 46 horas de cultivo in vitro, os COCs foram avaliados quanto à expansão das células cumulus em estereomicroscópio, quanto à maturação nuclear em microscópio de fluorescência e quanto à maturação citoplasmática, em microscópio eletrônico de transmissão. Foi constatado adequado bloqueio meiótico em 53,07% e 89,67% dos COCs tratados com roscovitina e ciclohexemida, respectivamente. Em ambos os tratamentos, o bloqueio meiótico foi reversível, com aproximadamente 60% dos oócitos em MII ao final de 46 horas de cultivo in vitro. No entanto, o tratamento com roscovitina inibiu de maneira irreversível a expansão do cumulus em aproximadamente 90% dos COCs e também afetou a ultraestrutura oocitária. Em contrapartida, no tratamento com ciclohexemida, 84,23% dos COCs apresentaram expansão total do cumulus ao final de 46 horas de cultivo in vitro, e houve adequada progressão da maturação citoplasmática, o que denota que a ciclohexemida confirmou a hipótese proposta no presente estudo / This study aimed to evaluate and compare the efficiency and reversibility of meiotic inhibition promoted bv roscovitine and cycloheximide in ovine COCs in vitro cultured, as well as, to assess the effects of these inhibitors on the ultrastructure of COCs and on the cumulus cells expansion. To this, grades I and II COCs recovered from ovines ovaries, obtained from slaughterhouse, were cultured, for 24 hours at 38.5ºC in a 5% CO2 humidified air atmosphere, in a specific maturation medium consisting of TCM 199 supplemented with 0,1UI/mL FSH, 0,1UI/mL LH, 1µg/mL estradiol, 0,3mM sodium pyruvate, 75µg/mL penicillin/ streptomycin, 10% FBS and 100µM/mL cysteamine (Control Group) plus 100 μM roscovitine or 1μg/ml cycloheximide (Treatment Groups). For the resumption and progression of nuclear maturation, COCs were cultured for another 22 hours in maturation medium free of meiosis inhibitors in the same conditions (as described before). After 24 and 46 hours of in vitro culture, COCs were evaluated according to cumulus cells expansion under stereomicroscope, to nuclear maturation under fluorescence microscope and to cytoplasmic maturation under electronic transmission microscope. There was adequate meiotic arrest in 53,07% and 89,67% of COCs treated with roscovitine and cycloheximide, respectively. In both treatments, the meiotic arrest was reversible, with approximately 60% MII oocytes at the end of 46 hours of in vitro culture. However, treatment with roscovitine irreversibly inhibited the cumulus expansion by approximately 90% of COCs and also affected the ultrastructure of COC. In contrast, in the treatment with cycloheximide, 84,23% of COCs showed total cumulus expansion at the end of 46 hours of in vitro culture, and there was adequate progression of cytoplasmic maturation, which indicates that the cycloheximide confirmed the hypothesis proposed in this study

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A engenharia de tecidos utiliza células e biomateriais para desenvolver substitutos de tecidos bioartificiais com diferentes finalidades. Embora vários modelos de pele tenham sido desenvolvidos para estudos farmacêuticos e cosméticos, assim como para cicatrização de feridas cutâneas, existem poucos estudos sobre culturas 3D de queratinócitos em scaffolds impressos em 3D. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um scaffold de hidrogel impresso em 3D capaz de promover o crescimento de queratinócitos humanos. Scaffolds 3D em forma de rede foram impressos, usando um método de extrusão, com um hidrogel de 20% de gelatina / 5% de alginato onde células HaCaT foram cultivadas durante 7 dias. Os scaffolds mantiveram a sua estrutura durante uma semana e a sua rigidez só diminuiu após 7 dias, demonstrando boas características mecânicas e estruturais, além de boa biodegradabilidade (27% de perda de peso). Queratinócitos viáveis (ensaio MTT) agregaram em forma de esferóides, que é um modelo 3D capaz de mimetizar as propriedades e fenótipos das células in vivo. Foram formados esferóides em 47% dos poros dos scaffolds e aumentaram de tamanho ao longo do tempo, mostrando uma proliferação celular promissora. A marcação de F-actina mostrou células com formas irregulares e interligadas e a sua organização ao longo do tempo. Este método oferece uma solução fácil e barata para a formação de esferóides de queratinócitos, que pode ser útil para engenharia de tecidos como um sistema de entrega de células, para pesquisa farmacológica ou básica ou aplicações médicas de cicatrização de feridas. / Tissue engineering uses cells and biomaterials to develop bioartificial tissue substitutes for different purposes. Although several skin models have been developed for pharmaceutical and cosmetic research, but also for skin wound healing, there are few studies on 3D cultures of keratinocytes in 3D printed scaffolds. So, the aim of this work was to develop a 3D-printed hydrogel scaffold able to promote human keratinocytes growth. Mesh 3D scaffolds were printed using an extrusion-based method with a 20% gelatin/ 5% alginate hydrogel where HaCaT cells were cultured for 7 days. Scaffolds kept their structure over one week and their stiffness only decreased after 7 days, showing good mechanical and structural characteristics, along with good biodegradability (27% weight lost). Viable keratinocytes (MTT assay) aggregated into spheroids, which is a 3D model capable of mimicking in vivo cells properties and phenotypes. Spheroids were formed on 47% of scaffolds pores and got larger over time, showing promising cell proliferation. F-actin staining showed cells irregular and interconnected shapes and organization over time. This method offers an easy and inexpensive solution for keratinocyte spheroid formation, which may be useful for tissue engineering as a cell delivery system, for pharmacological or basic research, or wound healing medical applications.

O tratamento de fraturas ósseas requer muitas vezes a utilização de implantes de fixação, que por vezes precisam de ser removidos cirurgicamente. Tais implantes e procedimentos aumentam a propensão dos doentes para desenvolver infeções associadas aos dispositivos médicos, sendo a osteomielite decorrente do trauma uma complicação desafiante para os ortopedistas. Nos últimos anos, os materiais biodegradáveis têm conquistado grande importância no desenvolvimento de dispositivos médicos temporários, evitando cirurgias de remoção. O objetivo desta revisão sistemática foi analisar a literatura sobre a utilização de implantes ósseos biodegradáveis na consolidação de fraturas e seu impacto na redução de infeções associadas a implantes. A revisão sistemática seguiu as diretrizes do PRISMA e baseou-se na pesquisa e análise de estudos publicados sobre o uso in vivo de implantes de fixação óssea biodegradável e sua atividade antibacteriana. De um total de 667 referências, 23 estudos foram incluídos com base nos critérios de inclusão e exclusão. Implantes ortopédicos biodegradáveis de Mg-Cu, Mg-Zn e Zn-Ag revelaram atividade antibacteriana, especialmente na redução da taxa de infeção por estirpes de MRSA, em modelos de osteomielite in vivo. A capacidade de certos dispositivos em prevenir e combater as infeções associadas a implantes, bem como a potencialidade para se degradarem gradualmente dentro do corpo reduzem a necessidade de uma segunda cirurgia de remoção do implante, com ganhos esperados no que diz respeito ao conforto dos doentes. Mais estudos in vivo serão necessários para avaliar a eficácia desses materiais biodegradáveis com propriedades antibacterianas. / Bone fractures often require fixation devices that frequently need to be surgically removed. These implants and procedures turn the patient more prone to develop medical device-associated infections, and osteomyelitis associated with trauma is a challenging complication for orthopedists. In recent years, biodegradable materials have gained great importance as temporary medical implant devices, avoiding removal surgery. The purpose of this systematic review was to revise the literature regarding the use of biodegradable bone implants in fracture healing and its impact on the reduction of implant-associated infections. The systematic review followed the PRISMA guidelines and was conducted by searching published studies regarding the in vivo use of biodegradable bone fixation implants and their antibacterial activity. From a total of 667 references, 23 studies were included based on inclusion and exclusion criteria. Biodegradable orthopedic implants of Mg-Cu, Mg-Zn, and Zn-Ag have shown antibacterial activity especially in reducing infection burden by MRSA strains in vivo osteomyelitis models. Their ability to prevent and tackle implant-associated infections and to gradually degrade inside the body reduces the need for a second surgery for implant removal, with expectable gains regarding patients' comfort. Further in vivo studies are mandatory to evaluate the efficiency of these antibacterial biodegradable materials.