Ao longo da vida reprodutiva dos machos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonialstemcells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento e exige a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículosde camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foramsubmetidos a dois protocolosde vitrificação de tecido testicular descritos na literatura (Protocolo EG+Sacarose e ProtocoloEG+DMSO+BSA). Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram descongelados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por \"beads\" magnéticas (MACS) com anticorpoThy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo EG+Sac e Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo EG+Sace Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar queo número de colônias observadas para as células do Protocolo EG+DMSO+BSA foi maior comparado ao Protocolo EG+Sac. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o ProtocoloEG+DMSO+BSA de vitrificação foi mais eficiente. / Throughout the reproductive life of males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors and require the maintenanceof these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols of testicular tissue vitrification(Protocol EG+Sucrose and EG+DMSO+BSA). After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were thawed and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibodyand transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strainpreviously treated with thequimioterapicbusulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observedfor Protocol EG+DMSO+BSA cells was higher compared to the Protocol EG+Suc. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cellsallowing the formation of colonies by these cells and the vitrification ProtocolEG+DMSO+BSA was more efficient.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonialstemcells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento e exige a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículosde camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foramsubmetidos a dois protocolosde vitrificação de tecido testicular descritos na literatura (Protocolo EG+Sacarose e ProtocoloEG+DMSO+BSA). Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram descongelados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por \"beads\" magnéticas (MACS) com anticorpoThy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo EG+Sac e Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo EG+Sace Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar queo número de colônias observadas para as células do Protocolo EG+DMSO+BSA foi maior comparado ao Protocolo EG+Sac. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o ProtocoloEG+DMSO+BSA de vitrificação foi mais eficiente. / Throughout the reproductive life of males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors and require the maintenanceof these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols of testicular tissue vitrification(Protocol EG+Sucrose and EG+DMSO+BSA). After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were thawed and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibodyand transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strainpreviously treated with thequimioterapicbusulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observedfor Protocol EG+DMSO+BSA cells was higher compared to the Protocol EG+Suc. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cellsallowing the formation of colonies by these cells and the vitrification ProtocolEG+DMSO+BSA was more efficient.

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Para sua realização é mandatório o uso de anestesia epidural, porém sabe-se que a punção repetida do espaço epidural pode causar alterações inflamatórias e fibrose do canal, aos quais reduzem a eficácia da técnica. Objetivou-se, por meio deste estudo desenvolver uma técnica cirúrgica de implantação de cateter epidural com portal de acesso subcutâneo e avaliar a patência deste dispositivo para a realização de aspiração folicular em vacas, por um período de 510 dias. Para a realização deste estudo foram utilizadas doze vacas, com idade entre 3-5 anos e peso entre 308-518 kg, que foram alocadas em dois grupos, grupo A, animais da raça Nelore e B animais da raça Holandesa. Após contenção em tronco, foi realizada sedação com 0,04 mg/kg de acepromazina 1% associada a 0,01 mg/kg de xilazina 2% pela via intramuscular e bloqueio anestésico local da região sacrococcígea e sacral direita. Procedeu-se uma incisão de pele semicircular de dez centímetros (incisão-I), abrangendo o espaço sacrococcígeo e intercoccígeo. Após divulsão da tela subcutânea, a pele foi rebatida lateralmente. Através de uma agulha de Tuohy (16G) posicionada na articulação sacrococcígea ou intercoccígea, introduziu-se dez centímetros do cateter (17G) em sentido cranial, no canal epidural. Procedeu-se uma segunda incisão (incisão-II), de quatro centímetros, no terço médio da região sacral direita. O cateter epidural foi transposto, da incisão-I para a incisão-II, através do espaço subcutâneo utilizando um guia metálico, para ser conectado ao portal de acesso, o qual foi sepultado no espaço subcutâneo da região sacral (incisão-II). As incisões foram suturadas com pontos simples separados. Após 15 dias da implantação, a patência do cateter e do portal foi comprovada por meio da administração de 3 mL de cloridrato de lidocaína 2%. Decorridos 30 dias, reaplicou-se o anestésico local, através do portal de acesso para se proceder a aspiração folicular transvaginal. Este procedimento foi repetido a cada 30 dias, durante 240 dias (8 ciclos). Na sequência, foi realizado descanso de 9 meses, seguido de nova aspiração folicular aos 510 dias após a implantação. A técnica cirúrgica de implantação do cateter e portal foi de média complexidade de execução. As anestesias foram eficazes para a realização da aspiração folicular durante os oito ciclos propostos. Não foram constatadas quaisquer evidências de rejeição do portal e tampouco obstrução total ou parcial dos cateteres. A ferida cirúrgica para a implantação do cateter epidural e do portal de acesso cicatrizou por primeira intenção em todos os animais. A implantação do portal e do cateter permitiu administrações múltiplas de anestésico local, otimizando a aspiração folicular, cuja patência abrangeu 510 dias desde a implantação. / In vitro fertilization and embryo transfer are often used as genetic multipliers in cows of high zootechnical value. Epidural anesthesia is mandatory preceding these procedures, but repeated puncture of the epidural space may cause inflammation and fibrosis, which reduce the effectiveness of the technique in time. The objective of this study was to describe a surgical technique for implantation of an epidural catheter with subcutaneous access portal, and to evaluate the patency this device during eight follicular aspiration cycles in cows. Twelve cows, aged between 3-5 years, weighting 308-518 kg were used in this study. They were allocated in two groups, (A) Nellore and (B) Holstein. Following physical retrain in a hydraulic stock and sedation with 0.04 mg/kg of acepromazine 1% associated with 0.01 mg/Kg of xylazine 2%, administered intramuscularly, local anesthetic block of the sacrococcygeal and right sacral region was made. Then, a 10-cm semicircular followed by skin incision (I-incision), was performed over the sacrococcygeal space, after divulsion of the subcutaneous tissue. Through a Tuohy needle (16G) positioned within the sacrococcygeal joint, ten centimeters of the catheter (17G) were cranially inserted in the epidural space. A second incision (incision-II), four centimeters long, was made at the middle third of the right sacral region. The epidural catheter was transposed from the I-incision to the II-incision through the subcutaneous by using a metallic guide, and promptly connected to the access portal, which was accommodated in the subcutaneous space of the sacral region. Both incisions were sutured with simple interrupted pattern. After 15 days of implantation, the patency of the catheter and portal was confirmed by administration of 3 mL of lidocaine 2%. After 30 days, the local anesthetic was reapplied through the access portal to perform transvaginal follicular aspiration. This procedure was repeated every 30 days for 240 days (8 cycles). Following, 9 months interval a new follicular aspiration was performed on the 510th day following implantation. The surgical technique for the catheter and portal implantation was of medium complexity. Anesthesia was effective for follicular aspiration along the eight cycles. No evidence of portal rejection and total or partial catheter obstruction were noticed. The surgical wounds promptly closed by primary intention. The implantation of the portal and the catheter allowed multiple administrations of local anesthetic optimizing follicular aspiration until the 510th day of implantation. / 2014/11630-8