Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) are plasmid-mediated bacterial enzymes that confer resistance for most β-lactams antibiotics. These enzymes are widespread in microorganisms in hospital settings worldwide. This study estimated the distribution and prevalence of the main ESBLs families among samples of Escherichia coli and Klebsiella spp. in the university hospital of Santa Maria (HUSM), Rio Grande do Sul. During a period of 14 months 90 microorganisms were selected as probable ESBL producers according to the recommendations of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The isolated microorganisms were submitted to phenotypic confirmatory tests for the presence of ESBL. Samples that showed negative results were tested against their susceptibility to cefoxitin. The ESBLs types found in each organism were determined by the research of the genes bla TEM, bla SHV e bla CTX-M by polymerase chain reaction (PCR). Fifty-five (61.1%) samples were confirmed as ESBL positive by the combined disc method and fifty-seven (63.3%) by the double disc method. In the cefoxitin susceptibility test 16 of the 39 samples presented resistance to this agent. Based on PCR, 74 (82,2%) samples harbored TEM-type ESBL gens, 61 (67,8%) SHV-type and 19 (21,1%) CTX-M-type. Only one Escherichia coli isolate appeared harboring genes for the CTX-M family of ESBLs. The distribution of TEM, SHV and CTX-M ESBL families from HUSM presented some similarities and differences compared with ESBLs of other hospital settings. / As β-lactamases de Espectro Estendido (ESBLs) são enzimas bacterianas mediadas por plasmídeos que conferem resistência à maioria dos antibióticos β-lactâmicos. Estas enzimas estão amplamente disseminadas em microrganismos nos ambientes hospitalares do mundo. Este estudo estimou a distribuição e prevalência das principais famílias de ESBLs entre amostras de Escherichia coli e Klebsiella spp. no Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM), Rio Grande do Sul. Durante um período de 14 meses, 90 microrganismos foram selecionados como prováveis produtores de ESBLs de acordo com os critérios estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Os microrganismos isolados foram submetidos a testes fenotípicos confirmatórios para a presença de ESBL. As amostras que apresentaram resultado negativo nestes testes tiveram sua susceptibilidade testada frente à cefoxitina. Os tipos de ESBLs presentes em cada microrganismo foram determinados pela pesquisa dos genes bla TEM, bla SHV e bla CTX-M através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Empregando-se o método do disco combinado, a presença de ESBLs foi confirmada em 55 (61,1%) amostras; quando o método do duplo disco foi utilizado, 57 (63,3%) amostras foram confirmadas. No teste de susceptibilidade à cefoxitina, 16 das 39 amostras testadas apresentaram resistência a este substrato. Com base na PCR, 74 (82,2%) amostras possuíam genes para a família TEM de ESBLs, 61 (67,8%) para a família SHV e 19 (21,1%) para a família CTX-M. Apenas um isolado de Escherichia coli demonstrou possuir genes para a família CTX-M de ESBLs. A distribuição de ESBLs das famílias TEM, SHV e CTX-M no HUSM apresentou semelhanças e diferenças em comparação com ESBLs de outros ambientes hospitalares.