Die Blut-Hirn-Schranke reguliert den Transport von Molekülen aus dem Blut in das Gehirn und aus dem Hirngewebe in das Blut. Die Grundlage dieser für den Erhalt der Homöostase im Gehirn wichtigen Schranke bilden zwischen Endothelzellen der Gehirnkapillaren (BCECs) entwickelte, besonders dichte Zonulae Occludentes (Tight Junctions). Viele Krankheiten, zum Beispiel die Multiple Sklerose, gehen mit einer Dysfunktion der BBB einher, die molekularen Grundlagen verschiedener Störungen und damit die Therapiemöglichkeiten sind bisher jedoch oftmals noch unbekannt. Ein grundlegendes Problem der Forschung an der BBB war bislang das Fehlen eines geeigneten immortalisierten in vitro-Modelles zum Verständnis der Differenzierung und Regulierung der Schrankenfunktion. Es gelang nun erstmals, aus murinen BCECs ein solches in vitro-Modell der BBB zu entwickeln, welches wichtige Charakteristika der BBB in vivo aufweist. Zu den Eigenschaften der BBB in vivo zählen allgemein ein hoher transendothelialer elektrischer Widerstand (TER) von bis zu 2000  x cm², die Expression der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, Claudin-3 und Claudin-5 sowie eine geringe Rate transzellulärer Transportvorgänge. Die Entwicklung einer immortalisierten Zelllinie als in vitro-Modell der BBB beinhaltete das Bereitstellen einer möglichst natürlichen Umgebung für die Endothelzellen. Durch Zugabe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie Serumreduktion im Differenzierungsmedium konnte eine dichte Schrankenfunktion induziert werden, welche sich anhand von TER-Messungen nachweisen ließ. Mittels immuncytochemischen und molekularbiologischen Methoden wurde außerdem die Expression verschiedener TJ-Proteine in den immortalisierten BCECs gezeigt. Die Permeabilität der BBB wird durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst. So war zu erkennen, dass Glucocorticoide und Insulin die Barrierenfunktion der BBB induzieren und die Zugabe dieser Faktoren die in vitro-Kultivierung von BCECs ermöglicht, ohne dass diese dabei für die BBB in vivo wesentliche Charakteristika verlieren. Diese Ergebnisse stimmen überein mit anderen Studien, denenzufolge für die Induktion und Aufrechterhaltung komplexer Tight Junctions bei kultivierten Endothelzellen Glucocorticoide förderlich sind. Auch klinisch wird dieser Einfluss von Glucocorticoiden bereits genutzt: so konnten im Falle der Multiplen Sklerose Therapieerfolge durch die Gabe von Corticosteroiden erzielt werden. / The blood brain barrier is responsible for regulation of transport between blood and brain, thus keeping up the brain's homeostasis. Tight Junctions in between brain capillary endothelial cells are the basis for barrier properties. Many diseases are going hand in hand with or are caused by a leakage within the blood brain barrier. Research was often limited by the lack of a proper in vitro model of the blood brain barrier. Aim of this study was to establish an in vitro model of the blood brain barrier and investigate regulation mechanisms. After cell isolation from murine brains certain growth- and differentiation supplements were added, cells were afterwards investigated regarding typical blood brain barrier properties. These are certain tight junction proteins (e.g. occludine, claudins), a high transendothelial electrical resistance as well as a low rate of transcellular transport. Our results showed the isolated brain capillary endothelial cells to be displaying those properties, thus building a valid in vitro model of the blood brain barrier.

Universiẗat, Diss., 2003--Frankfurt (Main).

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main).

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine wichtige Barriere zwischen dem Blutsystem und dem Gehirngewebe dar. An der Bildung dieser Barriere sind hauptsächlich die Endothelzellen der Blutkapillaren beteilig. Dabei verschließen die Tight Junction Proteine und die Adherens Junction Proteine den interzellulären Spalt zwischen zwei benachbarten Endothelzellen. Dieser Verschluss sorgt dafür, dass keine Noxen aus dem Blut in das Zentralnervensystem gelangen können. Damit jedoch der Transport wichtiger Nährstoffe in das ZNS und der Abtransport von Abfallprodukten aus dem ZNS gewährleistet sind, sind spezielle Rezeptoren und Transporter notwendig. Diese sorgen auch dafür, dass in die Endothelzellen eingedrungene schädliche Substanzen wieder zurück in das Blutsystem befördert werden. Dafür sind Effluxpumpen, Proteine der Solute Carrier Familie und zelluläre Rezeptoren verantwortlich. Die immortalized mouse cerebral/cerebellar capillary endothelial cells (cEND/cerebEND) Modellsysteme sind in-vitro Modellsysteme der BHS und wurden in der AG: Förster in der Anästhesiologie im Universitätsklinikum Würzburg bereits erfolgreich isoliert und schon dazu benutzt verschiedene physiologische und pathophysiologische Prozesse in der BHS zu beschreiben und zu erklären. Die Zellen werden in diesem BHS-Modell mit Hilfe des Polynoma large T Antigens immortalisiert. Das Ziel der Doktorarbeit war der Vergleich der mRNA Expressions- und Proteinlevel verschiedener Tight Junction-Proteine, Adherens Junctions, Effluxpumpen, Proteine der SLC-Familie und zellulärer Rezeptoren der BHS zwischen cEND/cerebEND und primären Zellen, die aus dem Großhirn isoliert wurden, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Nährmedium. Es sollte ermittelt werden, ob durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen eine Veränderung in der Expression der Proteine herbeigeführt wird und ob es Unterschiede in der Expression bezüglich der Mediumkonzentration gibt. Untersucht wurden die mRNA Expressionslevel mit Hilfe der RT-PCR und die Proteinlevel mittels Western Blot. Es hat sich heraus gestellt, dass cEND und cerebEND in vielen Fällen ähnliche Mengen an ABC-Transportern, Proteinen der SLC-Familie, zellulärern Rezeptoren und Tight Junction Proteinen wie primäre Zellen, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Medium exprimieren. Dabei sind die mRNA- und Proteinexpressionslevel von Tight Junctions und der zellulären Rezeptoren, Insulin- und Transferrinrezeptor, im Vergleich zu primären Zellen am ähnlichsten. In diesen Fällen wird die Expression der untersuchten Proteine durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen nicht signifikant verändert. Somit lässt sich die Barrierefunktion der Hirnendothelzellen besonders gut mit den in-vitro Modellsystemen untersuchen. Die Modellsysteme cEND und cerebEND zeigen allerdings auch einige Schwachstellen. Bcrp, Mct1, Lrp1 und P-gp lassen sich nur bedingt mit diesen Modellsystemen untersuchen, da ihre mRNA- und Proteinexpression sehr stark hoch, im Fall von Bcrp, oder runter reguliert wird, im Fall von Mct1 und Lrp1 in cEND/cerebEND und P-gp in cerebEND. Im Hinblick auf Veränderungen in der Expression durch Mediumreduktion wird deutlich, dass sie zu höheren Expressionsraten in cEND, mehr noch in cerebEND, führt. Dies zeigt sich auf mRNA-Ebene noch deutlicher als auf Proteinebene. Diese Tatsache scheint sich allerdings nicht im Vergleich mit primären Zellen sichtbar zu machen. Es zeigt sich kein Unterschied im Vergleich zu primären Zellen zwischen 10% FCS und 1% FCS Nährmedium. Damit stellen cEND und cerebEND in vielen verschiedenen, jedoch nicht in allen Fragestellungen geeignete Modellsysteme dar. / The blood-brain barrier (BBB) ​​represents an important barrier between the blood system and the brain tissue. The endothelial cells of the blood capillaries are mainly involved in the formation of this barrier. The tight junction proteins and the adherens junction proteins close the intercellular gap between two neighboring endothelial cells. This closure ensures that no noxious substances from the blood can get into the central nervous system. However, in order to ensure that important nutrients are transported to the CNS and that waste products are removed from the CNS, special receptors and transporters are necessary. These also ensure that harmful substances that have entered the endothelial cells are transported back into the blood system. Efflux pumps, proteins from the Solute Carrier family and cellular receptors are responsible for this. The immortalized mouse cerebral / cerebellar capillary endothelial cells (cEND / cerebEND) model systems are in-vitro model systems of the BBB and have already been successfully isolated in the AG: Förster in anaesthesiology at the University Hospital in Würzburg and already used to describe and explain various physiological and pathophysiological processes in the BBB. In this BBB models, the cells are immortalized using the Polynoma large T antigen. The aim of the doctoral thesis was to compare the mRNA expression and protein levels of various tight junction proteins, adherens junctions, efflux pumps, proteins of the SLC family and cellular receptors of the BBB between cEND / cerebEND in 10% FCS as well as in 1% FCS culture medium and primary cells, that were isolated from the cerebrum. It should be determined whether immortalization of the brain endothelial cells leads to a change in the expression of the proteins and whether there are differences in the expression with regard to the medium concentration. The mRNA expression levels were examined using RT-PCR and the protein levels using Western blot. It has been found that cEND and cerebEND in many cases have similar amounts of ABC transporters, proteins of the SLC family, cellular receptors and tight junction proteins like primary cells, both in 10% FCS and in 1% FCS culture medium. The mRNA expression and protein levels of tight junctions and the cellular receptors, insulin- and transferrin receptor, are the most similar compared to primary cells. In these cases, the expression of the examined proteins is not significantly changed by the immortalization of the brain endothelial cells. The barrier function of the brain endothelial cells can thus be investigated particularly well with the in vitro model systems. However, the model systems cEND and cerebEND also show some weak points. Bcrp, Mct1, Lrp1 and P-gp can only be investigated to a limited extent with these model systems, since their transcription and expression are regulated very high, in the case of Bcrp, or down-regulated, in the case of Mct1 and Lrp1 in cEND / cerebEND and P- gp in cerebEND. With regard to changes in expression through medium reduction, it becomes clear that it leads to higher expression rates in cEND, and even more so in cerebEND. This is shown even more clearly at the mRNA level than at the protein level. However, this fact does not appear to be visible in comparison with primary cells. There is no difference compared to primary cells between 10% FCS and 1% FCS culture medium. cEND and cerebEND seem to represent suitable model systems for many, but not for all questions.

A highly regulated microenvironment is essential in maintaining normal functioning of the central nervous system (CNS). The existence of a biological barrier, termed as the blood-brain barrier (BBB), at the blood to brain interface effectively allows for selective passage of substances and pathogens into the brain (Kadry, Noorani et al. 2020). The BBB chiefly serves in protecting the brain from extrinsic toxin entry and pathogen invasions. The BBB is formed mainly by brain capillary endothelial cells (BCECs) which are responsible for excluding ∼ 100% of large-molecule neurotherapeutics and more than 98% of all small-molecule drugs from entry into the brain. Minimal BBB transport of major potential CNS drugs allows for attenuated effective treatments for majority of CNS disorders (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). Animals are generally used as model systems to study neurotherapeutic delivery into the brain, however due to species based disparity, experimental animal models lead to several false positive or false negative drug efficacy predictions thereby being unable to fully predict effects in humans (Ruck, Bittner et al. 2015). An example being that over the last two decades, much of the studies involving animals lead to high failure rates in drug development with ~ 97% failure in cancers and ~ 99% failure for Alzheimer´s disease (Pound 2020). Widespead failures in clinical trials associated with neurological disorders have resulted in questions on whether existing preclinical animal models are genuinely reflective of the human condition (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Apart from high failure rates in humans, the costs for animal testings is extremely high. According to the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), responsible for determining animal testing guidelines and methodology for government, industry, and independent laboratories the average cost of a single two-generation reproductive animal toxicity study worldwide is 318,295 € and for Europe alone is ~ 285,842 € (Van Norman 2019). Due to these reasons two separate movements exist within the scientific world, one being to improve animal research and the other to promote new approach methodologies with the European government setting 2025 - 2035 as a deadline for gradually disposing the use of animals in pharmaceutical testing (Pound 2020). The discovery of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology in 2006 (Takahashi and Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) revolutionized the field of drug discovery in-vitro. HiPSCs can be differentiated into various tissue types that mimic disease phenotypes, thereby offering the possibility to deliver humanized in-vitro test systems. With respect to the BBB, several strategies to differentiate hiPSCs to BCECs (iBCECs) are reported over the years (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). However, iBCECs are said to possess an epithelial or undifferentiated phenotype causing incongruity in BBB lineage specifications (Lippmann, 7 Azarin et al. 2020). Therefore, in order to identify a reliable differentiation strategy in deriving iBCECs possessing hallmark BBB characteristics, which can be used for downstream applications, the work in this thesis compared two methods, namely the co-differentiation (CD) and the directed differentiation (DD). Briefly, CD mimics a brain like niche environment for iBCEC specification (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), while DD focuses on induction of the mesoderm followed by iBCEC specification (Qian, Maguire et al. 2017). The results obtained verified that while iBCECs derived via CD, in comparison to human BCEC cell line hCMEC/D3 showed the presence of epithelial transcripts such as E-Cadherin (CDH1), and gene level downregulation of endothelial specific platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) and VE-cadherin (CDH5) but demonstrated higher barrier integrity. The CD strategy essentially presented iBCECs with a mean trans-endothelial electrical resistance (TEER) of ~ 2000 – 2500 Ω*cm2 and low permeability coefficients (PC) of < 0.50 μm/min for small molecule transport of sodium fluorescein (NaF) and characteristic BCEC tight junction (TJ) protein expression of claudin-5 and occludin. Additionally, iBCECs derived via CD did not form tubes in response to angiogenic stimuli. DD on the other hand resulted in iBCECs with similar down regulations in PECAM-1 and CDH5 gene expression. They were additionally characterized by lower barrier integrity, measured by mean TEER of only ~ 250 – 450 Ω*cm2 and high PC of > 5 μm/min in small molecule transport of NaF. Although iBCECs derived via DD formed tubes in response to angiogenic stimuli, they did not show positive protein expression of characteristic BCEC TJs such as claudin-5 and occludin. These results led to the hypothesis that maturity and lineage specification of iBCECs could be improved by incorporating in-vivo like characteristics in-vitro, such as direct co-culture with neurovascular unit (NVU) cell types via spheroid formation and by induction of shear stress and fluid flow. In comparison to standard iBCEC transwell mono-cultures, BBB spheroids showed enhanced transcript expression of PECAM-1 and reduced expression of epithelial markers such as CDH1 and claudin-6 (CLDN6). BBB spheroids showed classical BCEC-like ultrastructure that was identified by TJ particles on the protoplasmic face (P-face) and exoplasmic face (E-face) of the plasma membrane. TJ strands were organized as particles and particle-free grooves on the E-face, while on the P-face, partly beaded particles and partly continuous strands were identified. BBB spheroids also showed positive protein expression of claudin-5, VE-cadherin, PECAM-1, glucose transporter-1 (GLUT-1), P-glycoprotein (P-gp) and transferrin receptor-1 (Tfr-1). BBB spheroids demonstrated higher relative impedance percentages in comparison to spheroids without an iBCEC barrier. Barrier integrity assessments additionally corresponded with lower permeability to small molecule tracer NaF, with spheroids containing iBCECs showing higher relative fluorescence unit percentages (RFU%) of ~ 90% in apical compartments, compared to ~ 80% in spheroids without iBCECs. In summary, direct cellular contacts in the complex spheroid model resulted in enhanced maturation of iBCECs. 8 A bioreactor system was used to further assess the effect of shear stress. This system enabled inclusion of fluidic flow and shear stress conditions in addition to non-invasive barrier integrity measurements (Choi, Mathew et al. 2022). iBCECs were cultured for a total of seven days post differentiation (d17) within the bioreactor and barrier integrity was non-invasively monitored. Until d17 of long-term culture, TEER values of iBCECs steadily dropped from ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 under static conditions and from ~ 2500 Ω*cm2 to ~ 250 Ω*cm2 under dynamic conditions. Transcriptomic analyses, morphometric analyses and protein marker expression showed enhanced maturation of iBECs under long-term culture and dynamic flow. Importantly, on d10 claudin-5 was expressed mostly in the cytoplasm with only ~ 5% iBCECs showing continuous staining at the cell borders. With increase in culture duration, iBCECs at d17 of static culture showed ~ 18% of cells having continuous cell border expression, while dynamic conditions showed upto ~ 30% of cells with continuous cell-cell border expression patterns. Similarly, ~ 33% of cells showed cell-cell border expression of occludin on d10 with increases to ~ 55% under d17 static and up to ~ 65% under d17 dynamic conditions, thereby indicating iBCEC maturation. In conclusion, the data presented within this thesis demonstrates the maturation of iBCECs in BBB spheroids, obtained via direct cellular contacts and by the application of flow and shear stress. Both established novel models need to be further validated for pharmaceutical drug applications together with in-vitro-in-vivo correlations in order to exploit their full potential. / Eine hochregulierte Mikroumgebung ist für die Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Zentralen Nervensystems (ZNS) unerlässlich. Das Vorhandensein einer biologischen Barriere, der so genannten Blut-Hirn-Schranke (BHS), als Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Gehirn ermöglicht den selektiven Durchgang von Substanzen und Pathogenen in das Gehirn (Kadry, Noorani et al. 2020). Die BHS dient hauptsächlich dazu, das Gehirn vor dem Eindringen von Toxinen von außen und dem Eindringen von Krankheitserregern zu schützen. Die BHS wird hauptsächlich von Hirnkapillarendothelzellen (engl. brain capillary endothelial cells, BCECs) gebildet, die dafür verantwortlich sind, dass ∼ 100% der großmolekularen Neurotherapeutika und mehr als 98% aller kleinmolekularen Medikamente nicht in das Gehirn gelangen können. Ein eingeschränkter BHS-Transport wichtiger potenzieller Wirkstoffe führt zu einer abgeschwächten Wirksamkeit der Behandlung der meisten ZNS-Erkrankungen (Pardridge 2005). Mäuse, Ratten, Schweine und Rinder werden in der Regel als Modellsysteme verwendet, um die Verabreichung von Neurotherapeutika in das Gehirn zu untersuchen. Aufgrund der Unterschiede zwischen den Spezies führen experimentelle Tiermodelle jedoch vermehrt zu falsch positiven oder falsch negativen Vorhersagen über die Wirksamkeit von Medikamenten, so dass sie nicht in der Lage sind, die Wirkungen beim Menschen vollständig vorherzusagen (Ruck, Bittner et al. 2015). Ein Beispiel dafür ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten ein Großteil der Studien an Tieren zu Misserfolgsraten in der Wirkstoffzulassung geführt hat. Bei einer Fehlerrate von 97% im Zusammenhang mit Krebs und ~99% bei Alzheimer führt dies zum Therapieversagen (Pound 2020). Die weit verbreiteten Misserfolge bei klinischen Versuchen im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen haben zu der Frage geführt, ob die bestehenden präklinischen Tiermodelle wirklich die Physiologie des Menschen widerspiegeln (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Abgesehen von den hohen Ausfallraten sind die Kosten für Tierversuche extrem hoch. Nach Angaben der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (engl. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD), welche für die Festlegung von Tierversuchsrichtlinien und -methoden für die Regierung, die Industrie und unabhängige Labore zuständig ist, belaufen sich die durchschnittlichen Kosten für eine einzige Zwei-Generationen-Studie zur Reproduktionstoxizität an Tieren weltweit auf 318.295 € und allein für Europa auf ~ 285.842 € (Van Norman 2019). Aus diesen Gründen gibt es zwei unterschiedliche Bemühungen unter den Wissenschaftlern. Zum einen zur Verbesserung der Tierforschung und zum anderen zur Förderung neuer Methoden gemäß den 3R (eng. replace, reduce, refine), wobei die europäische Regierung die Jahre 2025 bis 2035 als Frist für den schrittweisen Verzicht auf Tierversuche in der Forschung festgelegt hat (Pound 2020). Die 10 Entdeckung der humanen induziert pluripotenten Stammzell (hiPSC)-Technologie im Jahr 2006 (Takahashi und Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) hat den Bereich der Arzneimittelforschung revolutioniert, da hiPSCs in verschiedene Gewebetypen differenziert werden können und damit die Möglichkeit bieten, humanisierte in-vitro-Testsysteme bereitzustellen, die zur Untersuchung verschiedener Krankheiten verwendet werden können. In Bezug auf die BHS wurde im Laufe der Jahre mehrere Strategien zur Differenzierung von hiPSCs zu BCECs (iBCECs) etabliert (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020), allerdings wird ihnen ein epithelialer Phänotyp nachgesagt, was zu Fragen in der Spezifikation der BBB führt (Lippmann, Azarin et al. 2020). Um eine verlässliche Differenzierungsstrategie für die Gewinnung von iBCECs mit charakteristischen BHS-Merkmalen zu finden, welche für Downstream-Anwendungengenutztwerden können, wurden in dieser Arbeit zwei Methoden verglichen. Die Ko-Differenzierung (engl. co-differentiation, CD) und die gerichtete Differenzierung (engl. directed differentiation, DD). Zusammengefasst simuliert die CD eine ZNS-ähnliche Mikroumgebung für die Spezifikation der iBCECs nach (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), während sich die DD auf die Induktion des Mesoderms und die anschließende iBCEC-Spezifikation konzentriert (Qian, Maguire et al. 2017). Die erzielten Ergebnisse bestätigten, dass iBCECs, welche mittels CD abgeleitet wurden, im Vergleich zur humanen BCEC-Zelllinie (hCMEC/D3) zwar epitheliale Transkripte wie E-Cadherin (CDH1) besitzen, aber eine Herabregulierung von Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) und VE-Cadherin (CDH5) aufweisen. Die von CD abgeleiteten iBCECs hatten zudem eine höhere Barriere-Integrität und Funktionalität gezeigt. Im Wesentlichen führte die CD-Strategie zu iBCECs mit einem hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (engl. Transendothelialelectrical resistance, TEER) von 2000 - 2500Ω*cm2, einem niedrigen Permeabilitätskoeffizienten (eng. Permeability co-efficient, PC) von < 0,50 μm/min für den Transport kleiner Moleküle wie Natriumfluorescein (NaF) und einer charakteristischen Expression von BCEC-spezifischen Tight Junction (TJ)-Proteinen wie Claudin-5 und Occludin. Außerdem bildeten iBCECs, welche über CD gewonnen wurden, keine Gefäßstrukturen als Reaktion auf angiogene Stimuli. DD hingegen führte zu iBCECs mit einer ähnlichen Herabregulierung der PECAM-1- und CDH5-Genexpression, die zusätzlich durch eine geringere Barriereintegrität, gemessen an einem niedrigen TEER von nur ~ 250 - 450 Ω*cm2 und einem hohen PC von > 5 μm/min, bei dem Transport von NaF gekennzeichnet war. Obwohl die über DD gewonnenen iBCECs in der Lage waren Gefäßnetze auszubilden, zeigten sie keine Expression der charakteristischen BCEC-TJs wie Claudin-5 und Occludin. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, die in-vitro Differenzierung und Reifung von iBCECs zu verbessern, indem in-vivo-ähnliche Stimuli in-vitro angewandt werden, wie z. B. die direkte Kokultur mit Zelltypen der neurovaskulären Einheit (NVE) durch Sphäroidbildung und die Induktion von Scherstress in einem dynamischen Flussmodell. Im Vergleich zu iBCEC- 11 basierten Transwellmodellen, die zumeist in Monokulturen aufgebaut werden, zeigten die BHS-Sphäroide eine erhöhte Expression von PECAM-1 und eine reduzierte Expression von Epithelmarkern wie E-Cadherin (CDH1) und Claudin-6 (CLDN6). BHS-Sphäroide zeigten eine klassische BCEC-ähnliche Ultrastruktur, die durch TJ-Partikel auf der protoplasmatischen Phase (P-Phase) und der exoplasmatischen Phase (E-Phase) der Plasmamembran gekennzeichnet war. Die TJ-Stränge waren als Partikel und partikelfreie Rillen auf der E-Phase organisiert, während auf der P-Phase teils Partikel und teils kontinuierliche Stränge zu erkennen waren. BHS-Sphäroide zeigten auch eine positive Proteinexpression von Claudin-5, VE-Cadherin, PECAM-1, Glukose-Transporter-1 (GLUT-1), P-Glykoprotein (P-gp) und Transferrin-Rezeptor-1 (Tfr-1). Die BHS-Sphäroide wiesen ebenfalls höhere relative Impedanzwerte im Vergleich zu Sphäroiden ohne iBCEC-Barriere auf. Die Bewertung der Integrität der Barriere korrespondierte zudem mit einer geringeren Permeabilität für den niedermolekularen Tracer NaF, wobei Sphäroide mit iBCECs einen höheren Prozentsatz an relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU%) von etwa 90% in den apikalen Kompartimenten aufwiesen, verglichen mit etwa 80% in Sphäroiden ohne iBCECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass direkte zelluläre Kontakte im komplexen Sphäroidmodell zu einer verstärkten Reifung von iBCECs führten. In-vivo ist die BHS Scherbelastungen ausgesetzt, die einen wichtigen und oft vernachlässigten physiologischen Stimulus darstellen (Cucullo, Hossain et al. 2011). Um die Auswirkung von Scherstress auf die Eigenschaften und die Reifung von iBCECs zu messen, wurden diese in einem Bioreaktorsystem kultiviert.(Choi, Mathew et al. 2022). Hier war es möglich, iBCECs für insgesamt sieben Tage nach der Differenzierung (d17) erfolgreich in diesem System zu kultivieren und zusätzlich die Barriereintegrität nicht-invasiv zu überwachen. Bis d17 der Langzeitkultur fielen die TEER-Werte von iBCECs stetig von ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 unter statischen Bedingungen bzw. von ~ 2500 Ω*cm2 auf ~ 250 Ω*cm2 unter dynamischen Bedingungen. Zusätzliche Untersuchungen und Vergleiche von iBCECs unter diesen Kulturbedingungen mittels transkriptioneller und morphometrischer Analysen, sowie Expression von Proteinmarkern zeigten, dass iBCECs aufgrund der Langzeitkultur und des dynamischen Flusses eine verstärkte Reifung vorweisen. Wichtig ist, dass Claudin-5 bei d10 hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wurde und nur etwa 5% der iBCECs eine kontinuierliche Färbung an den Zellgrenzen aufwiesen. Mit zunehmender Kulturdauer zeigten iBCECs bei d17 in statischer Kultur ~ 18% der Zellen mit kontinuierlicher Zellrandexpression, während unter dynamischen Bedingungen bis zu ~ 30% der Zellen kontinuierliche Zellrandexpressionsmuster aufwiesen. In ähnlicher Weise zeigten ~ 33% der Zellen eine Zell-Zell-Grenzexpression von Occludin an d10 mit einem Anstieg auf ~ 55% unter d17 statischen und bis zu ~ 65% unter d17 dynamischen Bedingungen, was auf eine iBCEC-Reifung hinweist. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten die Reifung von iBCECs in 12 BHS Sphäroiden, die durch direkte Zell - Zell Kontakte und in dynamischen Strömungsmodellen durch die Anwendung von Scherspannungen erreicht wird. Beide etablierten neuen Modelle müssen für pharmazeutische Anwendungen zusammen mit In-vitro-in-vivo-Korrelationen weiter validiert werden, um ihr volles Potential zu beweisen.

Würzburg, Univ., Diss., 2009 / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2008

Protocadherine (Pcdh) sind im zentralen Nervensystem (ZNS) stark exprimiert und üben vielfältige Funktionen bei der neuronalen Entwicklung aus. Der Knockout eines Vertreters der Pcdhs, PcdhgC3, führt zu Veränderungen in tight junction Proteinleveln in mikrovaskulären Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke (BBB). In dieser Arbeit untersuche ich die Rolle des PcdhgC3 Knockouts (KO) in Transportern der Blut-Hirn-Schranke sowie dessen Auswirkungen auf die Signaltransduktion mittels Serumreduktion, Zellmigrationsversuchen, Signalweg-Inhibierung und Sauerstoff-Glucose-Entzug. Der PcdhgC3 Knockout resultiert in veränderten Proteinleveln der BBB Transporter und könnte ein vielversprechendes Therapieziel zukünftiger Pharmakotherapie sein. Ebenso führt die Serumreduktion in den KO-Zellen zu höheren Leveln von Signalkinasen (Erk). Die Knockout-Zelllinie zeigt signifikant schnellere Migrationsraten und scheint durch Signalweg-Inhibitoren (mTOR, MAPK, wnt-Inhibitoren) stärker im Wachstum reduziert zu sein. So könnte PcdhgC3 eine Rolle bei der Regulierung von Signalwegen spielen und zu einer veränderten Integrität der Blut-Hirn-Schranke beitragen. / Protocadherins (Pcdh) are highly expressed in the central nervous system (CNS) and play multiple roles in neuronal development. Knockout of one member of the Pcdh family, PcdhgC3, resulted in changes of tight junction proteins in microvascular endothelial cells of the blood-brain-barrier (BBB). Here I characterize the role of PcdhgC3 knockout (KO) in BBB transporters and its impact on signal transduction using serum starvation, wound healing assays, inhibition of signalling pathways and oxygen glucose deprivation (OGD) tests. PcdhgC3 Knockout resulted in changes in BBB transporter protein levels and might be a promising target for future drug therapy. Serum starvation led to higher levels of signal regulated kinases (Erk) in Knockout cells. KO cells show significant faster migration rates in wound healing assays and are inhibited by signalling pathway inhibitors (mTOR, MAPK, wnt inhibitors) suggesting that PcdhgC3 may play a role in the regulation of signalling pathways and changes of the BBB integrity.

Das Ziel dieser Studie war es, die Pathomechanismen der Enzepahlopathie, welche während einer akuten Nierenschädigung beobachtet werden kann, zu untersuchen. Wir konzipierten ein Zellkulturmodell, welches aus der cerebralen Endothelzelllinie cEND und der Nierentubuluszelllinie HK-2 bestant. Die Nierenzellen wurden einem Sauerstoff-Glukose-Entzug zugeführt, um eine akute Nierenschädigung zu simulieren. Nach weiterer Behandlung mit zwei urmämischen Toxinen (Indoxylsulfate und Indolessigsäure) und gemeinsamer Inkubation beider Zelllinien für insgesamt 48 Stunden wurden die cEND-Zellen geerntet und die Expression von Tight junction-Proteinen und Glukosetransportern untersucht. / The aim of this study was to examine the pathogenesis of the encephalopathy that is observed during acute kidney injury. We created a cell culture model consisting of a cerebral endothelial cell line (cEND) and a kidney cell line (HK-2). The kidney cells were damaged by an oxygen-glucose deprivation (OGD) to simulate an acute kidney injury. After treatment with two uremic toxins (indoxyl sulfate and indolic acetic acid) and joint incubation of both cell lines for 48 hours the cEND cells were harvested and the expression of tight junction proteins and glucose transporters was investigated.

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide. The blood-brain barrier (BBB) plays an important role in maintaining brain homeostasis by tightly regulating the exchange of substances between circulating blood and brain parenchyma. BBB disruption is a common pathologic feature of stroke and traumatic brain injury. Understanding the cellular and molecular events that affect the BBB after ischaemic brain injury is important to improve patient prognosis. We have previously shown that microRNA-212/132 is elevated in hypoxic brain microvascular endothelial cells and acts through suppressing the expression of direct microRNA-212/132 target genes with function at the BBB: claudin-1, junctional adhesion molecule 3 (Jam3) and tight-junction associated protein 1 (Tjap1). While the role of claudin-1 and Jam3 at the BBB is well known, the role of Tjap1 is still unclear. The aim of this work was therefore to characterize the role of Tjap1 in brain endothelial cells using a knock-down (KD) approach in established murine in vitro BBB models cEND and cerebEND. Tjap1 KD was established by stable transfection of a plasmid expressing shRNA against Tjap1. The successful downregulation of Tjap1 mRNA and protein was demonstrated by qPCR and Western blot. Tjap1 KD resulted in impaired barrier properties of endothelial cells as shown by lower TEER values and higher paracellular permeability. Interestingly, the Tjap1 KD cells showed lower cell viability and proliferation but migrated faster in a wound healing assay. In the tube formation assay, Tjap1 KD cell lines showed a lower angiogenic potential due to a significantly lower tube length and number as well as a lower amount of branching points in formed capillaries. Tjap1 KD cells showed changes in gene and protein expression. The TJ proteins claudin-5, Jam3 and ZO-1 were significantly increased in Tjap1 KD cell lines, while occludin was strongly decreased. In addition, efflux pump P-glycoprotein was downregulated in Tjap1 KD cells. Oxygen-glucose deprivation (OGD) is a method to mimic stroke in vitro. Brain endothelial cell lines treated with OGD showed lower barrier properties compared to cells cultured under normal condition. These effects were more severe in Tjap1 KD cells, indicating active Tjap1 involvement in the OGD response in brain microvascular endothelial cells. We thus have shown that Tjap1 contributes to a tight barrier of the BBB, regulates cell viability and proliferation of endothelial cells, suppresses their migration and promotes new vessel formation. This means that Tjap1 function is important for mature BBB structure in health and disease. / Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Ursachen für Mortalität und Behinderung. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gehirnhomöostase, indem sie den Stoffaustausch zwischen dem zirkulierenden Blut und dem Gehirnparenchym streng reguliert. Eine Störung der BHS ist ein gemeinsames pathologisches Merkmal von Schlaganfällen und traumatischen Hirnverletzungen. Um die Prognose der Patientinnen und Patienten zu verbessern, ist es wichtig, die zellulären und molekularen Ereignisse zu verstehen, die sich nach einer ischämischen Hirnverletzung auf die BHS auswirken. Wir haben zuvor gezeigt, dass microRNA-212/132 in hypoxischen mikrovaskulären Endothelzellen erhöht ist und durch die Unterdrückung der Expression direkter Zielgene mit Funktion and der BHS wirkt. Zu den Zielgenen von microRNA-212/132 gehören: Claudin-1, Junctional Adhesion Molecule 3 (Jam3) und Tight Junction Associated Protein 1 (Tjap1). Während die Rolle von Caludin-1 und Jam3 and der BHS gut bekannt ist, ist die Rolle von Tjap1 noch unklar. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Rolle von Tjap1 in Endothelzellen mithilfe eines Knock-down (KD)-Ansatzes in etablierten murinen In-vitro-BHS-Modellen zu charakterisieren. Tjap1-KD wurde durch stabile Transfektion eines Plasmids etabliert, das shRNA gegen Tjap1 exprimiert. Die erfolgreiche Herunterregulierung von Tjap1-mRNA und -Protein wurde durch qPCR und Western Blot nachgewiesen. Tjap1-KD führte zu einer Beeinträchtigung der Barriereeigenschaften von Endothelzellen, was sich in niedrigeren TEER-Werten und einer höheren parazellulären Permeabilität wiederspiegelte. Interessanterweise zeigten die Tjap1-KD-Zellen in einem Wundheilungstest eine geringere Zelllebensfähigkeit und Proliferation, wanderten jedoch schneller. Im tube formation assay zeigten Tjap1-KD-Zelllinien ein geringeres Angiogenese-Potential durch eine signifikant geringere Anzahl der gebildeten Kapillaren. Tjap-1-KD-Zellen zeigten Veränderungen in der Gen- und Proteinexpression. Die TJ-Proteinen Claudin-5, Jam3 und ZO-1 waren in Tjap1-KD-Zelllinien signifikant erhöht, während Occludin stark verringert war. Darüber hinaus wurde P-Glykoprotein in Tjap1-KD-Zellen herunterreguliert. Sauerstoff-Glukose-Entzug (eng. oxygen/glucose-deprivation, OGD) ist eine Methode zur Nachahmung eines Schlaganfall in vitro. Mit OGD behandelte Endothelzelllinien zeigten im Vergleich zu unter normalen Bedingungen kultivierten Zellen geringere Barriereeigenschaften. Diese Effekte waren in Tjap1-KD-Zellen schwerwiegender, was auf eine aktive Beteiligung von Tjap1 an der OGD-Antwort in Endothelzellen hinweist. Wir haben gezeigt, dass Tjap1 zu einer dichten Barriere der BHS beiträgt, die Zellviabilität und die Proliferation von Endothelzellen reguliert, deren Migration unterdrückt und die Bildung neuer Gefäße fördert. Dies bedeutet, dass die Tjap1-Funktion für die reife BHS-Struktur unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen wichtig ist.

Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNF&#945; in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNF&#945; als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNF&#945;-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNF&#945; zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNF&#945; und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden. / Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNF&#945; in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNF&#945; als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNF&#945;-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNF&#945; zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNF&#945; und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden.