Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T20:08:58Z No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T20:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / A técnica de seleção espermática para fecundação in vitro (FIV) deve proporcionar além, da recuperação eficiente de espermatozoides, a manutenção da integridade celular. Diversos métodos vêm sendo propostos para a seleção de espermatozoides bovinos destinados a FIV, sendo o método de centrifugação em gradientes de densidade descontínuos de Percoll® o mais utilizado. Em bovinos esta técnica de seleção vem sendo amplamente modificada no que se refere ao volume, número de gradientes, tempo e força de centrifugação, visando aumentar a recuperação espermática, proporcionando um melhor rendimento da dose. Contudo, a etapa de centrifugação, presente nestes protocolos, pode causar danos irreversíveis aos espermatozoides e assim influenciar nas taxas de fecundação. O presente estudo teve como objetivo determinar a influência da força e do tempo de centrifugação, assim como a associação do meio Cushion Fluid® na segunda centrifugação na seleção espermática por gradientes de Mini Percoll® modificado, através da avaliação de características morfofuncionais, formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), defesas antioxidantes, taxa de fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário em três experimentos. No experimento I, um pool contendo sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foi submetido ao método de separação por Mini Percoll®, sendo as amostras divididas em quatro grupos e submetidos a duas forças (2200 ou 9000 X g) e dois tempos de centrifugação (1 e 3 minutos). No experimento II e III, um pool de sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foram processados pelo método de Mini Percoll® modificado, sendo adicionado uma quantidade de 150μL de Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) durante a segunda centrifugação. Foram realizadas avaliações morfofuncionais e bioquímicas das amostras do sêmen destinado a FIV, assim como a capacidade fecundante e o desenvolvimento embrionário dos oócitos fecundados com os espermatozoides selecionados. No primeiro experimento foi observada uma melhora no vigor dos espermatozoides após o gradiente de Mini Percoll®, para todos os tratamentos. No segundo experimento, a taxa de recuperação espermática não diferiu entre os tratamentos, sendo 42,0% ± 4,9 para T1 e 38,6% ± 3,6 para T2 (grupo com adição do Cushion Fluid® na segunda centrifugação):. Na morfologia espermática o T2 (5,1 ± 1,1) apresentou menor taxa de espermatozoides com defeitos maiores do que os tratamentos T0 (Pré-Percoll) e T1 (8,8 ± 0,8 e 5,8 ± 1,0). Neste mesmo experimento, os níveis de EROs apresentaram-se aumentados (P < 0,05) no meio com Cushion Fluid® (T2), no entanto, a avaliação das defesas antioxidantes não diferiram entre os tratamentos. No experimento III, não foram observadas diferenças na taxa de fecundação. Este trabalho demonstrou que o uso de uma menor força e tempo (2200 X g/1 min.) de centrifugação pode ser utilizado sem interferir nas taxas de recuperação espermática. O uso do meio Cushion Fluid® durante a centrifugação de espermatozoides bovinos não influenciou a taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário até 48 horas. / The technique of sperm selection for in vitro fertilization (IVF) should provide addition, the sperm efficient recovery, the maintenance of cellular integrity. Several methods have been proposed for bovine sperm selection for IVF, and the discontinuous density gradients Percoll® ( Sigma Aldrich – St. Louis MO, USA) centrifugation method on the most used. In cattle this selection technique has been extensively modified with respect to the volume, number of gradients, time, and centrifugal force, to increase the sperm recovery, providing a better yield of the dose. However, the centrifugation step present in these protocols, may cause irreversible damage to sperm and thus influence fertilization rate. The present study aimed to determine the influence of centrifugation force and time, as well as the association of the Cushion Fluid® centrifugation on sperm selection by gradients Mini Percoll® modified by evaluating morphological and functional characteristics, ROS formation, antioxidant defenses, rate of in vitro fertilization and embryo development. Three experiments carry out. In experiment I, a pool containing two semen Bos taurus taurus bulls was subjected Mini Percoll® separation method, samples being divided into four groups, with two centrifugal forces (2200 or 9000 X g) and two times (1 and 3 min). In experiment II and III, the pool has been processed by the Mini Percoll® modified method, being added to an amount of 150μLix of Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) in the second centrifugation in the treated group. Morphofunctional and biochemical evaluation of semen samples for IVF, as well as the fertilizing capacity and embryo development of oocytes fertilized with sperms were selected performed. In the first experiment an improvement was observed in the vigor of sperm after gradient Mini Percoll® for all treatments. In the second experiment, the recovery rate sperm did not differ between treatments (T1: 42.0 ± 4.9 and T2 (with adding Cushion Fluid® the second centrifugation): 38.6 ± 3.6). In sperm morphology T2 (5.1 ± 1.1) showed a lower sperm rate with major defects than T0 (Pre-Percoll) and T1 (8.8 ± 0.8 and 5.8 ± 1.0 treatments ). In this same experiment, ROS levels were presented increased (P <0.05) in the medium with Cushion Fluid® (T2), however, the evaluation of antioxidant defenses did not differ between treatments. In experiment III, no differences in fertilization rate were observed. This study demonstrated that the use of a smaller force and time (2200 X g / 1 min.) to centrifugation can be used without interfering with the sperm recovery rate. The use of the medium Cushion Fluid® during centrifugation of bovine sperm did not influence the fertilization rate and embryo development to 48 hours.

A espermatogênese é um processo orquestrado e coordenado pelo qual os espermatozoides são produzidos. Ao final deste processo, o excesso de citoplasma presente nas espermátides é fagocitado, permanecendo um resíduo denominado de gota citoplasmática. Os espermatozoides em fase de maturação apresentam gota, que migra da região proximal para regiões mais distais da célula espermática. Estudos relacionam o remanescente citoplasmático à proteção antioxidante e à ativação metabólica de espermatozoides imaturos. Os mecanimos fisiológicos da maturação e os status oxidativo e metabólico em células epididimárias de bovinos são pobremente elucidados. Desta forma, foram realizados dois experimentos com o objetivo de caracterizar o status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos durante a maturação espermática, e os possíveis papéis da gota citoplasmática envolvidas nesse processo. Para tal, amostras espermáticas foram recuperadas dos três segmentos epididimários (Cabeça, corpo e cauda) e submetidas às avaliações de cinética espermática (CASA) e testes morfofuncionais. Foram avaliadas as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GPx e mensurados os níveis de ATP em cada amostra epididimária. Espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo apresentaram maior porcentagem de células móveis e progressivas e elevados níveis de ATP em comparação aos demais grupos. As células provenientes do corpo apresentaram maior susceptibilidade à peroxidação lipídica e membranas plasmática e acrossomal lesionadas. Foi nesse segmento que também observamos a migração da gota e o início da aquisição da motilidade, e correlação negativa entre gota distal e susceptibilidade à peroxidação. Em amostras da cabeça, houve correlação positiva entre produção de EROs e níveis de ATP, e alto PMM; e correlação negativa entre atividade da SOD e susceptibilidade à peroxidação lipídica em amostras da cabeça. Não foram observadas diferenças significativas em relação ao potencial de membrana mitocondrial (PMM) e a atividade da SOD e da GPx entre os diferentes segmentos. Por meio dos principais resultados, pudemos sugerir que as células presentes na cauda do epidídimo apresentam o aparato energético ativo, devido à alta porcentagem de células móveis e níveis de ATP. As amostras provenientes do corpo evidenciam que é neste segmento em que a motilidade se inicia e que ocorre os principais remodelamentos de membrana. As correlações observadas nos permitem inferir que as mitocôndrias de espermatozoides bovinos imaturos já estivessem ativas desde o início da maturação, produzindo energia e EROs. Além disso, a correlação nos mostra o papel protetor da SOD contra à peroxidação lipídica. Paralelamente, sugerimos que a gota participe firmemente da ativação da motilidade e desempenhe papel antioxidante contra as EROs. Assim, concluímos que as modificações celulares inerentes ao processo de maturação e a presença da gota citoplasmática sejam cruciais no status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos imaturos, afim desenvolver a capacidade fecundante do espermatozoide. / Spermatogenesis is an orchestrated and coordinated process by which sperm are produced. In the end of this process, the excess cytoplasm present in the spermatids is phagocytosed, remaining a called cytoplasmic droplet. Spermatozoa in the stage of maturation present cytoplasmic droplet, which migrates from the proximal region to more distal regions in sperm cell. Studies relate the cytoplasmic remnant to the antioxidant protection and to metabolic activation of immature sperma. The physiological mechanisms of maturation and the oxidative and metabolic status of bovine epididymal cells are poorly elucidated. Thus, two experiments aimed to characterize the oxidative and metabolic status of bovine sperm during epididymal maturation, and the possible cytoplasmic droplet roles involved in this process. For this, sperm samples were recovered from the three epididymal segments (Caput, corpus and cauda) and submitted to spermatic kinetics analysis (CASA) and morphofunctional tests. The activities of the antioxidant enzymes SOD and GPx were evaluated and the levels of ATP in each epididymal sample. Sperm cells recovered from the cauda of the epididymis showed a higher percentage of motile and progressive cells and high levels of ATP compared to the other groups. Cells from the corpus showed elevated susceptibility to lipid peroxidation and lesioned plasma and acrosomal membranes. It was in this segment that we also observed the migration of cytoplasmic droplet and the beginning of the acquisition of motility, and negative correlation between distal droplet and susceptibility to peroxidation. In samples from the caput, there was a positive correlation between ROS production and ATP levels, and high PMM; and negative correlation between SOD activity and susceptibility to lipid peroxidation in caput samples. No significant differences were observed in relation to mitochondrial membrane potential (PMM) and SOD and GPx activity among the different segments.By means of the main results, we could suggest that cells present in the cauda of the epididymis present the active energy apparatus, due to the high percentage of mobile cells. Samples from the corpus show that is in this segment that the motility begins and the main membrane remodeling occurs. The observed correlations allow us to infer that mitochondria of immature bovine sperm are already active since the beginning of maturation, producing energy and ROS. In addition, the correlation shows us the protective role of SOD against lipid peroxidation. In parallel, we suggest that cytoplasmic droplet participates firmly in the activation of motility and plays an antioxidant role against ROS. Thus, we conclude that the cellular modifications inherent in the sperm maturation process and the presence of cytoplasmic droplet are crucial in the oxidative and metabolic status of immature bovine spermatozoa, in order to develop fecundant capacity.