Thesis (M. Ag. Sc.)--University of Adelaide, Dept. of Agricultural Biochemistry, 1988. / Includes bibliographical references (leaves 109-119).

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-16T08:35:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 711914 bytes, checksum: 511f604fff5df6ba29e27254ccaf0db2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T08:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 711914 bytes, checksum: 511f604fff5df6ba29e27254ccaf0db2 (MD5) Previous issue date: 1999-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram conduzidos quatro experimentos em condições de casa de vegetação, na Universidade Federal de Viçosa, objetivando determinar a influência do nematóide de cisto, Heterodera glycines Ichinohe, e do Bradyrhizobium japonicum sobre os teores de nutrientes em folhas da soja, bem como avaliar o efeito do nematóide, do nitrogênio e do Bradyrhizobium japonicum sobre características agronômicas da soja; e cinco experimentos em condições de campo, em Capinópolis e Rio Paranaíba, Minas Gerais, visando avaliar os danos causados por percevejos em sementes dessa leguminosa. Nos experimentos conduzidos em casa de vegetação, o delineamento foi de blocos casualizados, num esquema fatorial 4 4, com quatro repetições. No primeiro experimento, os tratamentos foram constituídos pela combinação dos fatores nematóide de cisto: 0, 3.000, 6.000 e 9.000 ovos de NCS/vaso e 45, 90, 180 e 270 mg N/dm 3 de solo. O nematóide de cisto aumentou significativamente os teores de K nas folhas, e o nitrogênio influenciou os teores de P, Ca e Fe na floração. No segundo experimento, os tratamentos foram constituídos pela combinação dos fatores nematóide de cisto: 0, 3.000, 6.000 e 9.000 ovos de NCS/vaso e 0; 0,4; 0,8; e 1,6 g de inoculante de Bradyrhizobium japonicum/100 sementes. O nematóide de cisto influenciou os teores de N, Ca, Mg, Mn, Zn, Cu, Fe e B nas folhas durante a floração. No terceiro experimento, os tratamentos foram constituídos pela combinação dos fatores nematóide de cisto: 0, 3.000, 6.000 e 9.000 ovos de NCS/vaso e 45, 90, 180 e 270 mg N/dm 3 de solo. A altura de planta e o peso de matéria seca da parte aérea aumentaram (P < 0,05) com as doses crescentes de N, e estas reduziram a nodulação. No quarto experimento, os tratamentos foram constituídos pela combinação dos fatores nematóide de cisto: 0, 3.000, 6.000 e 9.000 ovos de NCS/vaso e 0; 0,4; 0,8; e 1,6 g de inoculante de Bradyrhizobium japonicum/100 sementes. A altura de planta, o número de vagens por planta de nódulos e o peso de semente e de matéria seca da parte aérea e da raiz diminuíram (P < 0,05) com as doses crescentes de nematóide de cisto. Nos vasos inoculados com 3.000 e 6.000 ovos de NCS, o número de fêmeas e de cistos foi superior (P < 0,05) ao encontrado nas demais combinações de tratamentos. A presença do nematóide, independentemente da concentração de ovos, resultou numa redução significativa das características avaliadas. As doses crescentes do inoculante de Bradyrhizobium japonicum aumentaram (P < 0,05) os valores das características avaliadas. No quinto e sexto experimentos, conduzidos em Capinópolis, as 20 linhagens/variedades de soja foram avaliadas em duas épocas de colheita, correspondentes às respectivas épocas de semeadura. Em Rio Paranaíba, instalaram-se outros três experimentos, e as 20 linhagens/variedades de soja foram avaliadas em três épocas de colheita, também correspondentes às épocas de semeadura. Nestas épocas, além do peso da semente e dos danos causados por percevejos, observaram-se a intensidade desses danos e a sua localização na semente. A linhagem UFV96-37001 e as variedades CAC-1, Doko RC e UFV-18, independentemente da época de colheita, não diferiram (P > 0,05) das outras linhagens nas características avaliadas, indicando que o cultivo de linhagens com ausência de enzimas lipoxigenases não foi afetado diferentemente pelos percevejos. / Four experiments were carried out under greenhouse conditions at the Universidade Federal de Viçosa (UFV), with the purpose of determining the influence of cysts nematode, Heterodera glycines Ichinohe, of Bradyrhizobium japonicum on nutrient contents in soybean leafs; evaluate the effects of cysts nematode, of nitrogen fertilization and Bradyrhizobium japonicum on agricultural characteristics on soybean plants, and five experiments on field conditions of Capinópolis and Rio Paranaíba, Minas Gerais, Brazil, with de purpose to evaluate the damages caused by stink bugs on soybean seeds. At the study carried out under greenhouse, a factorial experimental design was used to the treatments. At first experimental design, the inoculum concentrations were 0, 3,000, 6,000 and 9,000 eggs per clay pot containing a single plant, and nitrogen fertilization was applied at 45, 90, 180 and 270 mg N/dm 3 of soil. The cysts nematode influenced leaf the contents of K and nitrogen fertilizer influenced the leaf contents of P, Ca and Fe, at flowering. At second experimental design, the inoculum concentrations were 0, 3,000, 6,000 and 9,000 eggs per clay pot containing a single plant and Bradyrhizobium japonicum inoculum concentrations were 0; 0,4; 0,8 and 1,6 g/100 seeds. The leaf contents of N, Ca, Mg, Mn, Zn, Fe and B were influenced by cysts nematode. At third experimental design, the inoculum concentrations were 0, 3,000, 6,000 and 9,000 eggs per clay pot containing a single plant, and nitrogen fertilization was applied at 45, 90, 180 and 270 mg N/dm 3 . The effects on soybean were estimated at the end of the growth cycle. Plant height and weight of the dried aerial plant parts increased linearly (P < 0,005) as the nitrogen levels also increased. At fourth experimental design, the inoculum concentrations were 0, 3,000, 6,000 and 9,000 eggs per clay pot containing a single plant and Bradyrhizobium japonicum inoculum concentrations were 0; 0,4; 0,8 and 1,6 g/100 seeds. The number of cysts in pots inoculated with 3,000 and 6,000 eggs was statistically higher (P < 0,05) than found in the remaining treatments. Regardless of egg concentration used in the inoculation, nematode presence resulted in a significant reduction in soybean characteristics and the nodulation was reduced by the nitrogen fertilization. At fifth and sixth experimental designs, the 20 soybean lines/varieties was evaluated in two periods of harvest. Tree another experimental designs were carried out at Rio Paranaíba, using 20 also soybean lines varieties that were evaluated in three periods of harvest. Besides weight of seeds and damage, the intensity of damages and the localization were observed. The stink bugs of seeds showed preference to feed on large seeds. The line UFV 96-37001 and the varieties CAC-1, Doko RC and UFV-18, independently of the period of harvest, there were no (P > 0,05) difference among lines with other lines on evaluated characteristics, so it showing that the cultivation of absence lines of lipoxygenases it is no affected by stink bugs. / Tese antiga, sem ficha catalog.

No description available.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana. / Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.

Verificou-se a influência da temperatura e da agitação ótima para o desenvolvimento da estirpe SEMIA 587 de Bradyrhizobium japonicum em fermentador de bancada. A variação da temperatura, nos estudos cinéticos, influenciou de forma mais marcante o desenvolvimento microbiano do que a variação da agitação. Os melhores resultados a nível de rendimento foram obtidos utilizando-se uma temperatura de 28ºC e uma agitação de 230 rpm. Fez-se também um estudo da competição entre as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5019 em fermentador, inoculante turfoso e por sítio de nodulação. A estirpe SEMIA 587, quando desenvolvida conjuntamente com a SEMIA 5019, atingiu aproximadamente 70% da população total após 120 horas de processo. Esta mistura mais as elaboradas com 30, 50 e 70% da estirpe SEMIA 587, foram utilizadas como tratamentos para a inoculação em soja e também para a impregnação em turfa esterilizada. Nestes experimentos observou-se uma predominância da estirpe SEMIA 587, em relação à SEMIA 5019, em fixar nitrogênio e competir por sítios de nodulação e também no inoculante. Os resultados confirmam a possibilidade de utilização dos cultivos mistos, desde que sejam encontradas condições operacionais para o desenvolvimento ótimo das duas estirpes.